细菌染色和涂片观察的方法.ppt

细菌的染色和涂片观察,第一节 不染色标本检查法,所谓不染色标本检查法是将细菌标本不经染色直接镜检，从而观察生活状态下细菌的形态及运动状况的一种检查方法。这种检查方法虽可看到细菌的大致轮廓，但主要用于观察细菌的动力。,一、不染色标本检查法的具体方法,1 、压滴法 2、悬滴法 3、毛细管法,第二节 染色标本检查法,所谓染色标本检查法是用特殊的手段对细菌进行染色，而后再检查其形态、大小、排列方式、染色反应以及特殊结构的一种检查方法,有助于细菌的初步识别或诊断。,细菌染色的一般程序,细菌染色的基本程序是： 涂片 固定 （媒染） 染色 （脱色）（复染）,1、 涂片制备：,随标本的种类而略有不同。一般临床标本大多可直接涂抹于洁净载玻片上；培养的细菌，若为液体培养液，亦可直接涂于载玻片上；若为固体培养基上的细菌，则先取一接种环生理盐水于载玻片中央，然后从培养基上取菌少许，在盐水中研磨均匀，使呈轻度乳浊，以接种环扩成1cm2或2份硬币大小的涂面，在室温下自然干燥或放在火焰上方的热空气中慢慢烘干。但切忌紧靠火焰烤干。,2、 固定：,染色前必须先行固定。其目的在于凝固细胞质和其它细胞结构成分而杀死细菌；使菌体粘附于玻片上以及改变细菌对染料的通透性（因活菌通常不易使染料透入细胞内）。 固定的方法一般采用火焰加热法，在特殊目的时也可用冷冻干燥法或化学法如醇、酸、氯化高汞、重金属盐或氧化剂等进行固定。,3、 媒染：,媒染的目的是增加染料和被染物的亲和力。凡使染料固定于被染物；或引起细胞膜通透性改变的物质统称为媒染剂。常用的媒染剂有明矾、苦味酸、金属盐、碘等。也可用加热法媒染。媒染剂可用于固定之后，亦可含于固定液或染液中，也可在初染之后复染之前进行。,4、 染色：,随目的而选用适宜的染液。染色时，滴加染液以覆盖涂面为度，染色时间随方法而定。单染法只用一种染料如吕氏美兰、稀释石炭酸复红等；而多数染色法需用第二种染液进行复染。,5、 脱色：,脱色：是使被染物脱去已染上的颜色。脱色的目的是观察细菌与染料结合的稳定程度，故可作为鉴别染色之用。 凡具有脱色作用的化学试剂称脱色剂。脱色剂或呈溶媒作用，如醇类、丙酮等；或能影响蛋白质的电离程度，改变其电荷性质或数量，因而影响细菌与染料的结合程度，如酸类能减少细菌的负电荷，故可作碱性染料的脱色剂。,6、 复染：,已经脱色处理的细胞或其结构常以复染液作复染以便于观察。复染液与初染液的颜色不同而成鲜明对比，所以复染也称为对比染色。复染液不宜太强，以免掩盖初染的颜色而失去对比作用。,常用染色法,细菌的常用染色法有：单染色法、复染色法、特殊结构染色法、负染色法以及荧光染色法等。,（一）、单染色法：,单染色法是指用一种染料进行染色的方法。如用美兰或稀释石炭酸复红等，使各种细菌均染成同一种单一的颜色。故此法只能显示细菌的形态及大小，对细菌的鉴别价值不大。,（二）、复染色法：,复染色法是用二种以上染料进行染色的方法。此法除显示细菌的形态、大小外，还有鉴别细菌种类的价值，因此也称鉴别染色法。常用的鉴别染色法有革兰氏染色法及抗酸染色法。,1、 革兰氏染色法（Grams Stain）,是最常用的鉴别染色法之一。此染色法是由丹麦细菌学家 Christian Gram氏于18821884年发明的，至今已逾百年，仍在广泛使用，是细菌学中最为经典的染色方法。,（1）、革兰氏染色的方法：,固定初染媒染脱色 （结晶紫或龙胆紫） （ 卢戈氏碘液） （95%酒精） 复 染 （稀释复红）,固定 初染 媒染 脱色 复染 革兰氏阳性菌，用符号“G+”或“GP” （Grams Positive）表示。 革兰氏阴性菌，用符号“G”或“GN”（Grams Negative）表示。,革兰氏阳性葡萄球菌例子 (金黄色葡萄球菌 x 1000),革兰氏阳性链球菌例子,革兰氏阴性杆菌例子 (大肠杆菌 x 1000),革兰氏阴性弧菌例子,革兰氏阳性产芽孢杆菌例子,革兰氏阳性短杆菌例子 (李斯特菌 x 1000),革兰氏阴性弯曲菌例子,革兰氏阳性棒状杆菌例子,革兰氏染色的结果与培养基成分、培养条件、操作技术及菌龄等有密切的关系。 培养基成分：在缺乏镁盐的培养基中，革兰氏阳性菌可变为革兰氏阴性菌。 培养条件：在酸性环境中细菌带正电荷。 操作技术：如涂片太厚影响酒精脱色，革兰氏阴性菌则可染成革兰氏阳性菌；脱色时倘酒精作用时间太长，革兰氏阳性菌又会染成革兰氏阴性菌。 菌龄：菌龄也能影响染色的结果，这和细菌生长过程中核酸含量的改变有关。例如本是革兰氏阳性的老龄菌，因核酸减少则常有许多菌细胞变为革兰氏阴性。,革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖含量较多，脂类较少，与95%酒精接触后可迅速导致细胞壁脱水，通透性降低，使在细菌细胞内着色的染料结晶紫与碘的复合物不易透出，所以保留了紫色。而革兰氏阴性菌细胞壁含肽聚糖较少、脂类较多，与95%酒精接触后肽聚糖脱水不明显，而脂类被酒精溶解后使细胞壁通透性增加，酒精易透入菌体内溶解染料碘复合物并使其透出，因而使紫色被洗脱后又被染成红色。,3）、革兰氏染色法的临床意义,、鉴别细菌：该染色法可将细菌分为GP菌与GN菌两大类，这样可以初步识别细菌、缩小范围，便于进一步鉴定。 、了解细菌与致病性的关系：大多数GP菌的致病物质主要为外毒素；而大多数GN菌的致病物质主要为内毒素。通过革兰氏染色，可了解细菌的致病物质，从而做出相应的治疗对策。,、选择抗菌药物：GP菌和GN菌在细胞壁等结构上有很大差别，因而对抗菌药物的敏感性不同。如大多数GP菌对青霉素、红霉素、头孢菌素等敏感；而大多数GN菌对这几种抗生素不敏感，但对链霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素等敏感，故临床上可根据病原菌的革兰氏染色性，选择有效的药物进行治疗。,2、 抗酸染色法,有些细菌如结核杆菌、麻风杆菌等分枝杆菌，用一般染色法不易着色，必须使用强染色剂（如石炭酸复红）并采用加热和延长染色时间的方法才能使其着色。且一旦染上颜色后又不易被酸性酒精脱色。这种能够抵抗酸性酒精脱色的细菌，称为抗酸杆菌。应用这种原理进行染色的方法叫抗酸染色法。抗酸染色法常用的有萋纳二氏染色法和潘本汉氏染色法。,染色的步骤： 直接涂片法,夹层杯液基集菌法：,固定初染脱色复 染 石炭酸复红加热 3%盐酸酒精 吕氏美兰,染色过程中的细菌颜色变化：,抗酸杆菌,非抗酸杆菌,镜检与报告：,用光学显微镜镜检(目镜10，油镜100)染色痰片。在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色，其它细菌和细胞呈蓝色。所见结果按下列标准报告： 1)抗酸杆菌阴性：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌。 2)抗酸杆菌(1+)： 19条抗酸杆菌100视野。 3)抗酸杆菌(2+)： l一9条抗酸杆菌10视野。 4)抗酸杆菌(3+)： 19条抗酸杆菌每个视野。 5)抗酸杆菌(4+)： 10条抗酸杆菌每个视野。, 抗酸染色的意义： 用以鉴别抗酸菌（如结核杆菌和麻风杆菌）和非抗酸菌。,（三）、特殊结构染色法,细菌的某些基本结构如细胞壁、核质、胞浆颗粒和特殊结构如荚膜、芽孢、鞭毛等，用普通染色法不易着色，须用一些特殊染色法才能染上颜色。特殊染色法主要有荚膜染色法、鞭毛染色法、芽孢染色法、异染颗粒染色法等。这些染色法不仅能使特殊结构着色，还可使特殊结构染成与菌体不同的颜色，有利于观察和区别。,在细菌检验工作中，除异染颗粒染色法较常用外，由于其它特殊结构染色法操作费时，费用较高、染色过程要求非常严格，而普通染色法虽不能使特殊结构本身着色，但菌体着色后，荚膜和芽孢部分由于不着色也能显示出来，再加上特殊染色法比较复杂，故日常工作中较少使用这些特殊结构染色法,（四）、负染色法,所谓负染色法是指使背景着色而细菌本身不着色的一种染色方法。常用的有墨汁染色法。也可用酸性染料如刚果红或水溶性苯胺黑等进行染色。因酸性染料带负电荷，而细菌