玉米NAC转录因子家族ZmES32基因的功能分析

分类号： 单位代码： 密 级： 学 号： 安徽农业大学学位论文玉米NAC转录因子家族ZmES32基因的功能分析Functional Analysis of ZmES32 Gene of NAC Transcription Factors Family in Maize (Zea mays L.)研究生： 王玉 指导教师： 朱苏文 合作指导教师： 赵阳 申请学位门类级别： 理学硕士 专业名称： 生物化学与分子生物学 研究方向： 分子生物学 所在学院： 生命科学学院 答辩委员会主席： 2016年6月独 创 性 声 明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名： 时间： 年 月 日关于论文使用授权的说明本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名： 时间： 年 月 日第一导师签名： 时间： 年 月 日摘 要玉米是世界上重要的粮食、油料及饲料作物，中国是世界上最大的玉米产量国和消费国之一。玉米在国民经济生活中占据着重要的位置，不仅是人类和动物的能量来源，还涉及医疗，酿造业和化工能源等诸多行业。淀粉是玉米深加工的主要产品，胚乳是玉米籽粒积累和贮藏营养物质的重要部位，约占玉米籽粒的80以上，所以是决定玉米产量和品质的关键因素。因此深入开展对玉米淀粉生物合成代谢途径的研究，挖掘玉米淀粉合成相关基因功能，对作物品质的遗传改良和培育高产优质的玉米等方面具有重要意义。本研究基于前人的基因组关联分析筛选与淀粉合成相关基因的生物信息学分析结果，从玉米B73自交系中克隆得到了玉米胚乳特异性的候选基因ZmES32，并通过分子生物学技术验证基因功能的方法，转化水稻对其功能进行解析。初步鉴定出ZmES32基因在淀粉合成代谢途径中的功能，获得主要研究成果如下：（1）对玉米胚乳特异性的候选基因ZmES32进行生物信息学研究和预测发现，序列全长1177 bp，pI为5.81，Mw为42.13kD；属于NAC转录因子家族；具有核输出序列，不具有信号肽和明显的跨膜结构域，转录组测序数据显示ZmES32基因在授粉后的胚乳中特异性表达。（2）通过荧光定量PCR方法对ZmES32进行组织表达模式分析，结果显示在授粉后10d、15d、20d的胚乳中表达量较高，其他组织基本不表达，初步可以确定ZmES32基因在胚乳中特异性表达，对其进行克隆并转化水稻进行过表达。（3）对ZmES32基因的亚细胞定位分析发现ZmES32是一个核定位基因；通过酵母转录活性分析表明它具有转录自激活活性，且活性区域在335-392的氨基酸处，通过DNA结合特异性分析发现，ZmES32基因能够与CATGTG元件特异性结合，揭示ZmES32是一个典型的转录因子。（4）对转基因水稻籽粒中与淀粉合成相关的17个内源基因的表达量的研究发现，内源基因的表达量受到影响，其中与直链淀粉合成相关的OsGBSSI基因的表达水平高于野生型，而与支链淀粉合成相关的OsGBSSII基因的表达水平下降。初步揭示了ZmES32基因在水稻淀粉合成过程中参与调控作用。（5）对ZmES32转基因水稻籽粒的统计分析发现，籽粒的千粒重、粒长、粒宽、总淀粉含量、可溶性糖含量、支链淀粉的蓝值和最大吸收峰均比对照组中花11降低，但直链淀粉的含量增加，最大均差值达到2.81%，相应的直链淀粉的蓝值和最大吸收峰也比野生型要高，另外对籽粒的扫描电镜观察发现，籽粒内部的结构发生了变化，淀粉颗粒和蛋白体之间结构排列疏松，出现垩白现象。结果揭示，ZmES32基因对转基因水稻的大小和重量产生了影响，同时提高了直链淀粉的含量。关键词：玉米，水稻，NAC转录因子家族，ZmES32，淀粉合成Abstract:Key words: maize, rice, NAC transcription factor family, ZmES32, starch synthesis目录摘 要3Abstract:4目录41文献综述51.1淀粉的研究进展51.1.1淀粉概述51.1.2淀粉的分子结构61.1.3参与淀粉生物合成关键酶81.2.3 NAC转录因子的生物学功能142引言142.1研究目的和意义152.2技术路线163材料与方法163.1实验材料163.1.1植物材料163.1.2菌株和载体163.2酶和试剂173.3实验设备和仪器173.4 实验培养基、抗生素及主要试剂的配制173.5 实验方法213.5.1 ZmES32基因生物信息学分析213.5.2 ZmES32基因的组织表达模式分析213.5.4 玉米ZmES32 基因过表达载体的构建273.5.5 ZmES32基因的水稻遗传转化283.5.6 ZmES32基因亚细胞定位分析303.5.7 ZmES32基因的转录活性分析313.5.8 ZmES32基因的结合特异性分析333.5.9 ZmES32基因转基因种子的内源基因的表达分析343.5.10 ZmES32基因转基因种子农艺性状和扫描电镜分析353.5.11ZmES32基因的转基因植株种子的淀粉含量354结果分析384.1 ZmES32基因生物信息学分析394.2 ZmES32基因的组织表达模式分析414.3 ZmES32基因的克隆414.4 ZmES32基因的亚细胞定位分析434.5 ZmES32基因的转录活性分析444.6ZmES32基因的结合特异性分析454.7 ZmES32基因的转基因植株检测464.8 ZmES32基因的转基因植株种子的内源性基因表达分析484.9 ZmES32基因的转基因植株种子的农艺性状分析504.10 ZmES32基因的转基因植株籽粒的淀粉含量和结构分析515 讨论556 结论57参考文献57附录57致 谢57作者简介57硕士期间发表的研究成果581文献综述1.1淀粉的研究进展1.1.1淀粉概述淀粉是高等植物中最常见的组分，也是植物碳水化合物贮藏的主要形式。淀粉是以淀粉粒组成并由淀粉颗粒的形式存储，在大多数高等植物的器官根（或块茎）、茎、球茎、叶、果实甚至花粉中都含有淀粉。它具有成本低、来源广泛、可降解、无污染的优点，不但是食品行业的主要来源，而且还可以作为一种重要的工业原料，被广泛应用在酿酒、环保涂料、粘合剂、纺织、生物医药、绿色燃料、生物降解塑料及造纸等领域1。淀粉是植物利用太阳光为能源，二氧化碳和水为原料，在组织中合成的-D-葡萄糖以脱水缩合的方式形成的高分子化合物，其化学结构式为（C6H10O5）n，高等植物中，淀粉合成的主要场所是淀粉体和叶绿体。目前市场上所使用较多的商品淀粉主要来源于玉米、小麦、马铃薯、木薯、甘薯和豆类作物，而玉米淀粉的纯度可达995，是化学成分最佳的淀粉之一。不同种类和来源的植物淀粉，其淀粉颗粒的大小、形态和晶体结构也不相同。形态大多数呈卵形（或椭圆形）、圆形（或球形）和多角形（或不规则形），而淀粉颗粒的大小一般以颗粒长轴的长度来表示，直径从0.1200nm不等2-4。淀粉的晶型结构依据X射线衍射图形的差别，可以分为A型、B型和C型三种5-7，其中谷类淀粉属于A型，块茎淀粉属于B型，而兼具前两者晶型特征的是C型，高支和高链的玉米淀粉就分别为A型和B型结构。1.1.2淀粉的分子结构淀粉是通过葡萄糖分子脱水聚合而成的一种生物高分子聚合物，根据分子结构特征，可将其分为直链淀粉（Amylose）和支链淀粉（Amylopectin）两种，其分子结构如图1所示。直链淀粉(Amylose)直链淀粉分子是由 D-葡萄糖通过-1,4-糖苷键连接而成，分子中有200个左右葡萄糖基，其相对分子量为 1.51056.0105，聚合度在1006000之间，它的空间构象卷曲成螺旋形，每一回转为6个葡萄糖基。直链淀粉的分子量和结构随淀粉来源的不同而有较大差别。每个直链淀粉分子含有920个分支点,311条链。直链淀粉分子之间相互靠近,可形成氢键,引起溶液中淀粉的老化和脱水收缩。直链淀粉遇碘时能呈现颜色反应而显蓝色，其原因是碘分子能够进入到直链淀粉分子的螺旋内部，而形成二者的复合物，该复合物的最大吸光值在620680nm之间8，其颜色的深浅与淀粉分子中的多苷键的长度(聚合度)有关。在一般情况下，直链淀粉的碘结合量是其自身重量的20%左右，而在普通玉米中直链淀粉一般约占整个籽粒的20 %，支链淀粉约为80 %。支链淀粉(Amylopectin)支链淀粉是由95%的-1,4-糖苷键和大约5%的-1,6-糖苷键连接D-葡萄糖而形成的高度分支的葡萄糖多聚物, 其相对分子量大小为 1.01066.0106，聚合度在480010000之间。支链淀粉带有分支，分支的链长平均为18-25个葡萄糖单位,高直链淀粉可以达到19-31个葡萄糖单位9，各分支也可以卷曲成螺旋结构，只有外围的支链能被淀粉酶水解成麦芽糖。支链淀粉难溶于水,与热水作用则膨胀成糊状，其分子中有许多个非还原性末端，但却只有一个还原性末端，遇碘显紫色或者紫红色，最大吸光值在530550nm之间。由于淀粉的特殊结构，使其具有致密不可溶和生理上稳定的特点，同时又能迅速被酶解为葡萄糖，这种特殊结构对谷物产量形成具有重要意义。淀粉中支链和直链的含量和比例受发育阶段，不同器官等诸多因素的影响，深入开展对淀粉生物代谢途径的研究以此来调节和改善直链和支链淀粉含量的平衡度，对我们的食品工业生产意义非凡。图 1直链淀粉和支链淀粉的化学结构图Fig. 1 Graph of chemical structure of Amylose and Amylopectin(来源:/chem005_wd/node/7882)1.1.3参与淀粉生物合成关键酶淀粉合成是一个复杂的生化调控过程,受到一系列酶的控制，其中最重要的四个关键酶10, 11为：ADPG焦磷酸化酶(ADPG pyrophosphorylase，AGPP)，淀粉合成酶（Starch Synthase，SS）、淀粉分支酶（Starch Branching Enzyme，SBE）以及淀粉去分支酶(Starch Debranching Enzyme，SDBE)，它们在淀粉的生物合成过程中发挥着重要的作用。（1）ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPP）ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（ADPase）是淀粉合成过程中的限速酶，其催化的反应是淀粉合成中的第一步12, 13。ADPase的作用底物为G-1-P和ATP，通过催化它们形成腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG）。AGPase 是一个异源四聚体，分子量为200-240KD,分别由两个大亚基（AGPLSU）和两个小亚基（AGPSSU）组成，大亚基分子量为51-60KD,小亚基分子量为50-55KD(Kleezkowskletal_,1991)大亚基是酶活性中心主要起调控作用，而小亚基是催化中心和底物结合起催化作用14, 15，是酶别构效应的关键部位16。同时研究发现，小亚基比大亚基更加保守17。根据在细胞中分布的特点，可以将AGPase分为胞质型和质体型两种类型。在谷物的胚乳中有85%95%的AGPase是胞质型的，其在蔗糖丰富的条件下可以将大量碳水化合物物转化为淀粉，但在谷物的其他组织或其他植物中，如大麦、玉米、水稻和牧草中16, 18-20，AGPase是质体型的，并且蔗糖的生产不受自身合成的积累。研究表明，在玉米胚乳中分别由brittle-2（Bt2）和shrunken-2（Sh2）这两个基因编码ADPase的大小亚基，其对应的突变体表型为，Bt2玉米突变体籽粒比对照组更容易研碎， Sh2 突变体玉米籽粒表面出现明显皱缩，最终结果是突变体的ADPase 活性和淀粉含量显著低于正常植株21, 22。相同的在大麦的Risc/16突变体中，其体内的AGPase 活性下降的范围更大，高于95%22。将大肠杆菌中的突变基因glgC-16转化到马铃薯中，其淀粉含量提高了35%，原因就在于glgC-16能够编码高活性和对异构调节不敏感的ADPase。而将该基因转到玉米和水稻中，结果也是显著提高了玉米和水稻籽粒的淀粉含量和重量23-25。从以上研究结果可以发现AGPP对淀粉含量的积累有显著影响。（2）淀粉合成酶（SS）淀粉合成酶（starch synthase, SS）也是淀粉合成过程中的关键酶，通过催化-1,4-糖苷键，将ADPG 的葡萄糖基连接到寡聚糖的非还原性末端，从而实现葡聚糖链的不断延伸而形成有分支的淀粉。根据淀粉合成酶在造粉体中存在形式的差别，可以分为两类，第一类是颗粒结合淀粉合成酶（Granule-bound starch synthase, GBSS），第二类是可溶性淀粉合成酶（Soluble starch synthase, SSS）26, 27。GBSS经过缓冲液提取后仍然保留在淀粉粒上，在功能上主要负责直链淀粉的合成；而SSS经过缓冲液提取后与淀粉粒分离而分散到缓冲液中，主要负责支链淀粉的合成28-30，但两类酶都是利用ADPG 作为合成淀粉的底物进行生化反应。GBSS有两种同工酶，分别为 GBSSI 和 GBSSII。GBSSI 由 waxy 基因编码，当抑制waxy基因的表达，最直接的结果就是直链淀粉的含量下降，即GBSSI是直链淀粉合成的关键酶；GBSSII 在叶片等非贮藏组织中负责合成临时性贮藏淀粉，GBSSII与支链淀粉的亲和性更高，主要与支链淀粉的合成相关31-33。SSS 游离于质体的可溶性基质中，对温度敏感，酶的最适温度在2025C之间，作为淀粉合成的最适调节位点，而高于或低于此温度，酶活性都会降低12，主要参与支链淀粉的合成。根据结构和功能不同将SSS分为四种类型，分别为SSSI, SSSII, SSSIII 和 SSSIV。SSI基因主要负责支链淀粉中短链（DP10）的形成4, 29，SSII主要负责支链淀粉中等长度链的合成30，SSIII能通过与DBE的作用控制支链结构形成31，这些酶在胚乳发育的不同时期淀粉合成具有重要作用34。玉米中 SSSIIa 和 SSSIIIa 分别由 sugary2（Su2）和dull1（Du1）编码。在 Su2 突变体中，短支链的支链淀粉增加，而较长支链的支链淀粉减少，但玉米籽粒的总淀粉含量和淀粉形态并未发生明显变化35。目前，此类基因已从水稻、玉米、豌豆、马铃薯等高等植物以及衣藻中获得了相应的克隆，虽然对SSS基因的研究，有了较大的进展，但其在淀粉合成过程中每种同工型所起的特定作用现在还不太明确。（3）淀粉分支酶（SBE）淀粉分支酶（Starch Branching Enzyme，SBE），又称Q 酶，是一种葡萄糖基转移酶，是参与支链淀粉合成的关键酶。SBE具有两方面的作用，第一步是先催化-1,4-糖苷键水解，第二步催化非还原性末端连接到C-6羟基上形成-1,6-糖苷键分支点36。高等植物的各类组织中存在多种淀粉分支酶的同工酶，例如玉米胚乳中的SBEII 和SBEI；水稻胚乳中的SBEIIa 和SBEI；马铃薯块茎中的SBEH 和SBEI；豌豆中的SBEI 和SBEII 等等，它们可以产生不同链长的分支37, 38。SBE在多数植物中均含有两个以上的同工型，根据淀粉分支酶的结构和底物的专一性及免疫反应等多方面的不同，可以将其分为两类：同工型A和同工型B。对淀粉分支酶基因的突变体的研究主要是对同工型A，如水稻和玉米的ae（amylose-extender）突变体以及豌豆种子皱缩的性状33。同工型A的突变体中的淀粉，具有支链淀粉分支少且分支链长，直链淀粉含量高等特点。同工型B功能较不明显，在用反义RNA（Ribonucleic Acid）技术创造针对同工型B的突变体，对淀粉颗粒分析发现淀粉的表型没有太大的变化34。SBE的同工型基因不同的发育时期表达也不相同，Burton等发现豌豆在胚发育的早期SBEI表达量较高，短分支链较多；而SBEII的在胚发育后期才表达，长分支链较多 35。（4）淀粉去分支酶（SDBE）淀粉去分支酶(starch debranching enzyme ，SDBE)主要作用是能特异性地水解淀粉中的-1,6-糖苷键分支点，属于淀粉水解酶家族。依据作用方式不同，将SDBE分为直接去分支酶和间接去分支酶两类。直接去分支酶主要存在于植物和细菌中，其水解作用不需其他酶的参与；而间接去分支酶主要存在于动物、酵母中，其水解过程需要-1,4葡萄糖苷转移酶的参与。根据作用的底物不同，直接去分支酶又可以分为两类，异淀粉酶（isoamylase, ISA）和极限糊精酶（pullulanase）或称R酶（RE）。ISA主要水解糖原和支链淀粉，而调节ISA活性是改变颗粒结构和淀粉理化性质的一个有效的方法37 ；RE是以极限糊精等为底物36，在淀粉水解过程中，同淀粉酶和淀粉酶一起作用，特异性的去除它们的-1,6-糖苷键，将淀粉降解为相对分子质量较小的糖。在玉米和水稻缺失DBE 活性的突变体Sugary-1 中，水溶性多糖和植物糖原的积累增多，支链淀粉积累减少，支链淀粉精细结构发生变化，从而导致淀粉的形态学和理化特性发生变化39, 40，相比异淀粉酶，对 R 酶的生理功能认识有限，一直认为 R 酶在谷物发芽中起降解淀粉的作用，但 Dinges 等（2003）通过研究玉米 Zpu1 突变体表明 R 酶在淀粉合成中也起重要作用。图 01 玉米淀粉合成代谢途径Fig. 1 Starch biosynthesis system in maize1.2 NAC转录因子1.2.1 NAC转录因子的研究进展转录因子 (Transcription factor, TF )是基因表达中调控蛋白翻译的一类重要的调控因子。一方面能与不同目的基因启动子区域的特定DNA序列即顺式作用元件结合，另一方面和其他转录因子家族的成员或调控蛋白相互作用，激活或抑制靶基因的转录表达40。典型的植物转录因子包含4个功能区域即DNA 结合结构域、转录调控结构域、核定位信号序列和寡聚化位点41。不同生物的同一转录因子家族一般 DNA 结合结构域变化不大，根据这个特点，转录因子被分成许多个不同的家族，如 AP2/ERF、bZIP、MYB、WARK和NAC 等等。NAC转录因子是植物特有的一类具有多种生物功能的转录因子, 命名起源于矮牵牛(Petunia hybrid) NAM(no apical meristem)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)ATAF1、ATAF2以及CUC2 (cup-shaped cotyledon)基因, 其数目众多, 在陆生植物中广泛存在 (Souer等1996; Duval等2002; Ooka等2003)。目前已经鉴定出拟南芥有117个、水稻(Oryza sativa)有151个、玉米（Zea mays L.）有148个、葡萄(Vitis vinifera)有79个、白杨(Populus trichocarpa)有163个、大豆(Glycine max)和烟草(Nicotiana tabacum)分别有152个NAC基因42-46, 可以看出NAC转录因子构成了较大的转录因子家族之一。具有如此众多成员的NAC转录因子家族在植物中发挥着重要的作用。研究表明, NAC转录因子不仅在植物生长发育过程中起到调控作用，比如种子萌发、细胞分裂、开花、衰老、次生壁的合成、侧根形成等, 还在植物防御抵抗生物和非生物胁迫的响等方面发挥重要作用应47 。1.2.2 NAC转录因子的结构特征NAC转录因子(NAM, ATAF, CUC)的主要结构特点是 N 端含有约160 个氨基酸残基组成的高度保守结构域，包含5 个保守区（A-E），该区域是NAC 转录因子的结合域。通过X射线观察拟南芥ANAC01转录因子，发现此结构域是由几个螺旋和反向平行的折叠结构共同组成的，而且不含有其他已知的结合DNA基序，但通过如盐桥等作用形成一侧富含正电荷的NAC蛋白二聚体，推测其可能与DNA的结合有关48。NAC转录因子的C 端是高度多样性的转录激活调控区，该端的共同特点是一些简单氨基酸重复出现的频率较高，同时富含丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、苏氨酸等，这是植物转录激活结构域的典型特征47, 49。最新的研究还发现一些NAC 蛋白的C-末端表现出蛋白结合活性和跨膜（TM）元件45, 50-54。NAC转录因子结构示意图如图155。图 1 NAC 转录因子结构示意图（Shen 等，2009）Fig.1 Structures of NAC protein domains and predicted motifs1.2.3 NAC转录因子的生物学功能NAC 家族中的大多数成员都是诱导型表达的转录因子，植物不同生长发育阶段、病原体侵染、高盐、干旱、低温、植物激素刺激和机械损伤等生物与非生物胁迫都可诱导其表达。因此，NAC 家族转录因子在植物生长发育、代谢调节、器官建成、激素响应、抵抗逆境和作物品质改良中具有重要作用，已成为当前植物基因功能及表达网络调控研究中的热点。NAC转录因子是植物中最大的转录因子家族之一，广泛分布于苔鲜植物到高等双子叶植物. 研究表明，NAC转录因子具有诸多方面的功能（表2参考文献出处），如参与植物次生生长，在细胞分裂和植株衰老中发挥作用，参与激素调控和信号转导，参与矿质元素营养和农作物品质改良，参与生物胁迫中植物的防御反应以及在非生物逆境中发挥作用. 有大量的证据表明，在病原体侵染等生物损伤及高盐、干旱、低温、ABA和机械损伤等非生物胁迫应答过程表1 相关NAC 基因的生物学功能Table 1 Biological function of related NAC gene 2引言2.1研究目的和意义玉米(Zea mays)是世界上最重要的粮食、油料及其饲料作物之一，目前全世界玉米的种植面积和总产量仅次于小麦和水稻，居第三位。中国是世界上最大的玉米产量国和消费国之一，每年种植面积约2400 万公顷，总产量约1.15 亿吨，种植面积和总产量仅次于美国，位居世界第二，而且玉米产量总体呈不断增长趋势。玉米在国民经济生活中占据着重要的位置，具有产量高、增产潜力大、适应性强、营养丰富、用途广泛等特点，在我们的日常生活中除了是人类和动物的能量来源外，还涉及医疗，酿造业和化工能源等许多行业56。玉米淀粉是玉米深加工的主要产品，胚乳是玉米籽粒积累和贮藏营养物质的重要部位，约占玉米籽粒的80以上，所以是决定玉米产量和品质的关键因素。根据分子结构特征将淀粉分为直链淀粉和支链淀粉两种，而二者各自所占的比例以及支链的分支结构决定了玉米的用途和品质。因此深入开展对玉米淀粉生物合成代谢途径的研究以及玉米淀粉合成相关基因的挖掘，对作物品质的遗传改良，培育高产优质的玉米以及高效育种和产业化栽培具有重要的理论和实践指导意义，在提高了玉米附加值同时，还满足了淀粉工业的发展需求以及有利于保证国家粮食安全。本研究基于前期的基因组关联分析筛选与淀粉合成相关基因的生物信息学分析结果，并通过分子生物学技术验证基因功能的方法，从玉米B73自交系中克隆得到了玉米胚乳特异性的候选基因ZmES32，通过转化水稻对其功能进行解析。本研究已经初步鉴定出ZmES32基因在淀粉合成代谢途径中的功能，这对完善玉米淀粉代谢途径以及改善淀粉含量和培育新型作物品质具有十分重要的意义。2.2技术路线3材料与方法3.1实验材料3.1.1植物材料供试材料包括玉米（Zea mays L.）B73自交系和粳稻（Oryza sativa L subsp.japonica）中花11号（安徽农业大学生物物理学省重点实验室保存），种植于实验室农翠园的温室和试验田内，温室的种植温度为 282C，光周期为14小时光照/10小时黑暗，实验田为开放的人工田，种植时间5-8月。3.1.2菌株和载体菌株：大肠杆菌（Escherichia coli.）DH5和根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105（安徽农业大学作物生物学省重点实验室保存）；转录活性分析实验菌株Y2Hgold和酵母单杂交实验菌株Y1HGold（购自Clontech公司）。载体：pEASY-T1 Simple载体（购自全式金生物技术有限公司），过表达载体pCAMBIA 1301a和亚细胞定位载体pCAMBIA1305-GFP（安徽农业大学作物生物学省重点实验室改造并保存），酵母杂交系列载体pGBKT7、p53-AbAi 、pGADT7-recAD、pAbAi 、pGADT7（购自Clontech公司）。3.2酶和试剂酶类：EasyTaq DNA Polymerase、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶如BamHI，SpeI，SacI，BglII、EcoRI、XbaI等、T4DNA连接酶以及PCR所需的buffer、dNTPs等（均购于TAKARA生物工程有限公司）。试剂：DNA Marker（大连宝生物工程有限公司）；卡那霉素(Kan)、氨苄青霉素(Amp)、利福平（Rif）、羧苄青霉素（Cb）、潮霉素B（Hyg）、二甲基亚砜（DMSO）、-葡萄糖苷酸酶(-Glucuronidase, GUS)、甘露醇、PEG-4000、MES、MgCl2、KCl、NaCl、 CaCl2、Aureobasidin A、Adenine Hemisulfate Salt、酵母提取物、蛋白胨、D-葡萄糖等(均购自Sigma公司)；Trizol（上海英俊生物技术有限公司）；SYBR Green Mix（美国ABI公司）；酵母缺陷型培养基购自Clontech公司；SYBR Green Mix（美国ABI公司)。其它常用化学试剂均为国产分析纯。试剂盒：反转录试剂盒(First-Strand cDNA Synthesis Kit) (美国Promega公司) 、PrimeScript 反转录试剂盒(Perfect Real Time，TAKARA)；质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)；酵母质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司) ；荧光定量试剂盒（Roche 公司）；MagSi 植物RNA提取试剂盒 (OMEGA)；酵母单杂试剂盒（Clontech公司）。3.3实验设备和仪器微量移液器(Eppendorf)、Eppendorf低温离心机、高压灭菌锅 （Hirayama HVE 50）、PCR仪(MJ Research)、DYY-6C型琼脂糖凝胶电泳仪、Kodak凝胶成像系统、-20低温冰箱（Sanyo）、-70超低温冰箱（Sanyo）、电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司)、组织研磨仪（鼎昊源科技, TL-2020）、制冰机(Sanyo)、超净工作台、VORTEX-2型涡旋振荡器(Genie)、荧光分光光度仪（Hitachi F-4500）、紫外分光光度计 (Hitech U2001)、微量紫外分光光度计(One Drop OD-1000)、7300实时荧光PCR仪(ABI)、体视显微镜（Leica）、荧光共聚焦显微镜(Olympus)、7300实时荧光PCR仪(ABI)、核酸自动提取仪（Thermo Fisher 公司）、临界点干燥仪（Hitachi HCP-2 Critical point dryer）、共聚焦显微镜Carl Zeiss LSM 710及实验室其它分子生物学实验常用的设备。3.4 实验培养基、抗生素及主要试剂的配制（1）大肠杆菌LB培养基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L， NaCl 10 g/L(固体培养基按比例加入1.5的琼脂粉)， pH调至7.2，定容，121 C，灭菌15-20 min。（2）农杆菌YEP培养基：酵母提取物10 g/L、牛肉膏5 g/L、胰蛋白胨10 g/L(固体培养基按比例加入1.5的琼脂粉)，pH调至7.0，定容，121 C，灭菌15-20 min。（3）酵母YPDA培养基：酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，D-葡萄糖20 g/L，0.2%腺嘌呤15 mL/L(固体培养基中的葡萄糖需培养基灭菌后单独添加，单独配制20%的葡萄糖存储液，55 C左右时每升培养基加入100 mL的葡萄糖存储液，葡萄糖也可过滤灭菌；固体培养基中每升加琼脂粉20 g)，加去离子水溶解后pH调节为6.5，定容，121 C灭菌15 min。其中酵母培养基中还需单独配置的试剂包括： 10LiAc：采用高压蒸汽灭菌；10TE：采用高压蒸汽灭菌；50% PEG：采用抽滤或高压蒸汽灭菌；0.2% Adenine：称取0.2g Adenine Hemisulfate Salt(Sigma公司)溶于100 mL灭菌水水中。Aureobasidin A: 称取1mg Aureobasidin A 溶于2ml的无水乙醇，配置成 500 g/mL的母液，4C冰箱贮存备用。X-gal：称取25 mg X-gal溶于1.25 mL二甲基甲酰胺(DMF)中，配置成20 mg/mL的浓度，为防止见光分解，可以分装于2.0mLEppendorf管中并用锡箔纸包裹严实，-20 C保存。（4）抗生素储液配制卡那霉素的配制：称取100 mg卡那霉素的粉末加入1 mL灭菌去离子水溶解，配置成100 mg/ml浓度的存储液，过滤除菌后，并分装在1.5ml EP管中，-20贮存备用，使用浓度为50 mg/L。利福霉素的配制: 称取10 mg氨苄青霉素粉末加入1 mL灭菌去离子水溶解，配置成10 mg/ml浓度的存储液，并分装在1.5ml EP管中，-20贮存备用，使用浓度为50 mg/L。氨苄青霉素的配制：称取100 mg氨苄青霉素粉末加入1 mL灭菌去离子水溶解，配置成100 mg/mL浓度的存储液，并分装在1.5ml EP管中，-20贮存备用，使用浓度为100 mg/L。（5）农杆菌介导水稻转化所需培养基的配制水稻愈伤组织诱导培养基：分别加入10mLN6 max、100mL N6 min、10mLVitamin、10mLFe盐、600mg/L水解酪蛋白CH 、300 mg/L 脯氨酸、30 g/L蔗糖，用ddH2O定容至700 mL左右，调节pH值至5.9，然后加3.0 g/L琼脂粉，煮沸，再加入2,4-D 储备溶液，最后用ddH2O定容至1L，再分装到25 mL规格的组培瓶中，121，灭菌15-20 min，冷却待用。侵染培养基：分别加入50mL N6max、5mL N6min、10mLFe盐、10mL Vitamin、800mg水解酪蛋白、20 g/L蔗糖，用ddH2O 定容至1 L，调节pH值至5.6，然后再加入3ml/L2,4-D 储备溶液、6.0g/L琼脂粉，121，灭菌15-20 min，待培养基冷却到4060，加入20mL Glucose葡萄糖储备溶液和1 L AS储备溶液，倒平板，封口待用。选择培养基：分别加入100mL N6max、10mL N6min、10mLFe盐、600mg/L水解酪蛋白CH、30 g/L蔗糖、10mLVitamin，用dd H2O定容到1L，调节pH值至5.9，加3.0 g/L琼脂粉，加入2,4-D 储备溶液，煮沸，再分装到25 mL规格的组培瓶中，121，灭菌15-20 min，待培养基冷却到4060，再加入5mL/L羧苄储备溶液、1mL/L潮霉素储备溶液、1mL/L头孢储备溶液。再分装到25 mL规格的组培瓶中，灭菌后的操作都要在超净工作台进行，防止污染培养基。分化培养基：分别加入100mL MSmax、10mLMSmin、1000mg/L水解酪蛋白CH、10mL Vitamin、10mLFe盐、30 g/L蔗糖、2mL/L 6-BA储备溶液、2mL/L NAA储备溶液、0.200uL/L KT储备溶液、200uL/L IAA储备溶液，用ddH2O定容到1L，调节pH值至6.0，然后再加3g/L琼脂粉，121，灭菌15-20 min，待培养基冷却到4060，再加入5 mL/L羧苄储备溶液和2,5mL/L潮霉素储备溶液，灭菌后的操作都要在超净工作台进行，防止污染培养基。生根培养基：分别加入50mlMSmax、5mLMSmin、10mLVitamin、10mL Fe盐、20 g/L蔗糖，用ddH2O定容到至700 mL, 调节pH值至5.8，煮沸，加2ml/L IBA储备溶液，再加入dd H2O定容至1mL，121，灭菌15-20 min，倒入生根瓶冷却备用。上述步骤所用到的一些热不稳定性化合物如抗生素、AS、6-BA及KT等，需要采用细菌滤器过滤除菌后，等培养基温度降至50左右时再加入以防止降解。培养基相关母液的配制: 1）N6max储备溶液(10X)：KNO328.3 gKH2PO44.0 g(NH4)2SO44.63 gMgSO4 7H2O1.85 gCaCl2 2H2O或CaCl21.66 g/1.25 g用ddH2O定容至1L，室温保存；2）N6min储备溶液(100X)：KI0.08 gH3BO30.16 gMnSO4 4 H2O或MnSO4 H2O0.44 g/0.3335 gZnSO47H2O0.15g用ddH2O定容至1L，室温保存；3）MSmax储备溶液（10X)： NH4NO16.5gKNO319.0gKH2PO41.7gMgSO47H2O3,7gCaCl22H2O或CaCl24.4 g/ 3.32 g用ddH2O定容至1L，室温保存；4）MSmin 储备溶液(100X)：KI0.083 gH3BO30.62 gMnSO4 4H2O或MnSO4 H2O2.23 g/1.69 gZnSO4 7H2O0.86 gNa2MoO4 2H2O0.025 gCuSO4 5H2O 0.0025 gCoCl2 6H2O 0.0025 gNa2MoO4需要单独溶解后再加入到混合液中，最后用ddH2O定容至1L，室温保存；5）Fe2+-EDTA (100X)：2.78 g FeSO4 7H2O 溶入300 mL ddH2O中将3.73 g Na2 EDTA 2H2O溶入70 的300 mL ddH2O中待两者全部溶化后，再混溶，70水浴中保温2 h, 用ddH2O定容至1L，4储存备用；6）Vitamin (100X)：Nicotinic acid0.1 gPyridoxine HCl (VB6)0.1 gThiamine HCl (VB1)0.1 gGlycine0.2 gInositol10 g用ddH2O定容至1000 mL，4储存备用；2,4-D储备溶液: 称量5.61 g 2,4-D加到1.0 mL 1N KOH溶液中，需要点震5 min，再加入10 mL ddH2O使得其完全溶解，最后再加ddH2O定容至100 mL，即配置成1 mg/mL的浓度，室温贮存备用。IAA储备溶液：称量0.1 g IAA吲哚乙酸，再加入1.0 mL 1N KOH，晃动直至IAA吲哚乙酸完全溶解，最后再加ddH2O定容至100 mL，即配置成1 mg/mL的浓度，室温贮存备用。NAA储备溶液：称量0.1 g NAA萘乙酸，再加入1.0 mL 1N KOH，晃动直至NAA萘乙酸完全溶解，最后再加ddH2O定容至100 mL，即配置成1 mg/mL的浓度，室温贮存备用。6-BA储备溶液：称量0.1 g 6-BA，再加入1.0 mL 1N KOH，晃动直至6-BA完全溶解，最后再加ddH2O定容至100 mL，即配置成1 mg/mL的浓度，室温贮存备用。3.5 实验方法3.5.1 ZmES32基因生物信息学分析对ZmES32基因进行生物信息学相关的基础研究，包括对其蛋白序列、保守domain、等电点、亲疏水性、跨膜结构预测、核输出序列、信号肽等方面进行分析，其中用到的网址包括如下：玉米基因组数据库网址/index.html（Schnable，2009）、Pfam网址/ search/sequence （Finn RD，2006） 、蛋白质亲疏水性分析ProtScale网址/tools/protscale.html、EXPASY /compute_pi/、跨膜区结构预测TMHMM网址http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0、信号肽分析网址http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/核输出序列分析NES网址http:/www.cbs.dtu.dk/services/NetNES/。3.5.2 ZmES32基因的组织表达模式分析（一）组织取样为了初步分析玉米ZmES32基因在各个组织中的表达水平情况，选取玉米B73自交系三叶期的根、茎、叶以及成苗时期的雄穗、花丝、果穗、，还有授粉后10d、15d、20d的胚和胚乳，取样后用液氮快速冷冻，然后保存于-80冰箱备用。（二）提取总RNA使用核酸自动提取仪提取RNA，方法参照E.Z.N.A.TM MagSi 植物RNA提取试剂盒的步骤。实验前需要准备研钵、移液枪、RNase-free 离心管、RNase-free枪头等，研钵及研磨棒采用锡箔纸包裹，在180 C干燥箱内灭菌8-10小时。实验具体步骤如下：（1）将保存于-80冰箱中的组织取出，放入装有液氮的研钵中，快速研磨至粉末状；（2）用预冷的1.5 ml 规格的RNase-free 离心管装取大约50mg的粉末，同时用RNase-free枪头立即加入0.5 mL Buffer RCL/Z-Me溶液（1ml RCL中加入20L的Z-Me），漩涡震荡仪混匀约30S,充分打散样品；（3）提前将水浴锅调到56 C，水浴锅水浴计时3 min；（4）室温14000 rpm离心5 min，取出并将上清液转移到KingFisher 96DW 板内；（5）按照下面表1各种数据的含量加到96DW 板中：表1 96DW板加样位置Table 1 Location of all samples in the 96DW plate（6）将96DW板和洗脱条放到仪器上，需要特别注意的是将洗脱条含数字的一侧放在里面，同时将96DW板上标注A1的孔对准仪器转盘上A1的位置；（7）开机，运行Mags plant RNA M6927 程序，程序运行33分钟后会暂停，需取出96DW板，并在H行中加入400L RNA Buffer。最后，等待程序运行结束，取出样品并分装，用于后续的检测和反转录。（三）RNA质量和浓度的检测总RNA的完整性检测：采用1.0% 的琼脂糖凝胶电泳的方法检测，取3 L 总RNA，再加入1 L溴酚蓝混匀，胶孔点样，电压调至35 V/cm，电泳20min左右，通过紫外凝胶成像系统拍照观察，完整的RNA会存在三条带（28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA，且 28S rRNA 是 18S rRNA的 1 倍以上）；总RNA纯度和浓度检测：取1 L总RNA加到微量紫外分光光度计的探头上（需要提前开机预热20min），读取峰线图和浓度值。一般而言，峰线单一光滑且A260/A280的值在1.8-2.0之间，则总RNA的质量较好，若A260/A280的值大于2，则说明样品中有乙醇残留，若A260/A280小于1.8，则说明样品中有蛋白质或者酚类污染。（四）反转录使用宝生物公司的反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，分为去除基因组DNA和反转录两步，具体步骤如