余甘子提取物对小鼠免疫功能的影响.doc

余甘子提取物对小鼠免疫功能的影响 作者：崔炳权， 何震宇， 杨泽民， 林元藻【摘要】 目的探讨余甘子对小鼠免疫功能的影响。方法用不同剂量余甘子提取物给正常小鼠连续灌胃,检测血清溶血素含量、腹腔巨噬细胞吞噬功能、迟发型变态反应、T淋巴细胞增殖和NK细胞活性。结果余甘子提取物能增加小鼠血清溶血素含量、明显增强小鼠巨噬细胞吞噬功能、改善迟发型变态反应，促进T淋巴细胞增殖，提高NK细胞活性。结论余甘子能显著增强小鼠免疫功能。 【关键词】 余甘子; 免疫功能; 溶血素; T淋巴细胞; 巨噬细胞; NK细胞; 迟发型变态反应余甘子Phyllanthus emblica L.又名山油柑、油甘子、余甘果等，为大戟科叶下珠属植物余甘子的成熟果实，广泛分布在广东、福建、台湾、贵州、湖南、广西、四川、浙江和云南等省区。余甘子果入药，中医学认为，余甘子性味甘、酸、涩、凉, 归肺、胃经。其功能与主治为清热凉血，消炎, 消食健胃, 生津止咳;用于血热血瘀、消化不良、腹胀、咳嗽、喉痛及口干1。明本草纲目曾记载：“余甘子果，主补益气，久服轻身，延年益寿” 。余甘子的药理作用的研究报道很少，为了探讨余甘子的抗肿瘤作用，本实验研究了余甘子提取物对小鼠免疫功能影响，旨在了解余甘子的免疫药理作用机制，为研究其抗肿瘤机制提供研究资料，为余甘子的食用和药用价值的开发提供实验依据。1 材料1.1 材料、药品与试剂余甘子采购自四川盐源县。经广东药学院中药学院药用植物与中药鉴定学教研室李书渊教授鉴定为戟科叶下珠属植物余甘子Phyllanthus emblica L.的成熟果实。余甘子提取物制备：将余甘子晾干，取适量余甘子，常规水煎2次，过滤后混合并浓缩成1g 生药/ml，4保存备用。2，4二硝基氟苯(DNFB)，二甲基亚砜(DMSO)，上海试剂一厂产品。RPMI-1640，MTT，PHA，Sigma产品。721型分光光度计，CO2培养箱，酶标仪，离心机。1.2 动物昆明种清洁级小鼠，雌雄兼用，体质量为(202) g，由广州市白云区穗北实验动物养殖场提供。2 方法2.1 余甘子提取物对小鼠体液免疫功能的影响采用溶血素测定法2：小鼠40只,体质量(202) g，随机分为4组，每组10只。空白对照组，每天灌胃蒸馏水0.5 ml/只;试药大剂量组、中剂量组、小剂量组，每只每天分别灌胃余甘子提取物45,30,15 mg/kg，连续12 d。给药第2天，每只小鼠腹腔注射5%绵羊红细胞悬液0.2 ml免疫，末次给药后禁食24 h，断头取血并分离血清，将血清用生理盐水按150稀释，取血清1 ml，加5% 绵羊红细胞悬液0.5ml和补体1 ml，37水浴10 min，冰浴，离心,取上清液1 ml，测定A540，计算样品的半数溶血值(HC50 )。 用HC50代表血清溶血素水平。2.2 余甘子提取物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响3小鼠40只，分组及给药天数和剂量同实验“2.1”项。第12天小鼠称重，后腹腔注射5%淀粉肉汤1 ml，致敏24 h后，腹腔注射1 ml 5%鸡红细胞悬液，4 h后脱臼处死，腹腔注入5 ml冷Hanks液，按摩腹部5 min后，解剖，无菌吸取腹腔液涂片，晾干，甲醇固定5 min，瑞-姬氏复合染色剂染色，镜检，在油镜下观察，随机计数100个吞噬细胞中吞噬鸡红细胞及吞噬的鸡红细胞总数，并计算巨噬细胞吞噬百分率与吞噬指数。2.3 余甘子提取物对小鼠T淋巴细胞增殖反应的影响T淋巴细胞增殖反应测定(MTT法)4：小鼠40只，分组及给药天数和剂量同实验“2.1”项。12 d后脱颈处死，无菌取脾，制细胞悬液(5106 /ml)，加入96孔培养板，每孔100 l，再加入含PHA (10 g/ml) 的RPMI-1640培养液100 l，每个样品设3个复孔，37 CO2 培养箱中孵育27 h，后每孔加入MTT (5 mg/l)10 l ，振荡1 min，放入37 CO2 培养箱反应3 h，取出离心，弃上清，每孔加DMSO200 l，混匀，振荡5 min，酶标仪测A500。结果以3个复孔的s表示。2.4 余甘子提取物对特异性细胞免疫功能的影响DNFB 诱导小鼠迟发型变态反应的测定2，5：小鼠40只，分组及给药天数和剂量同实验“2.1”项。给药后第6天进行致敏，在小鼠后肢皮下注射0.02 ml1% DNFB，给药第10天同法第2次致敏，于第1次致敏的第9天，用1% DNFB 0.02 ml涂于右耳进行攻击，左耳涂布生理盐水作为对照。次日处死，沿耳廓基线剪下两耳，用直径8 mm的打孔器分别在左、右耳同一部位打下耳片，称重。以耳肿胀度(EPR左右耳片重量之差)作为迟发型变态反应的指标。2.5 余甘子提取物对非特异性细胞免疫功能的影响NK细胞活性测定2：小鼠40只，分组及给药天数和剂量同实验“2.1”项。12 d后，处死取脾，制成细胞悬液，按乳酸脱氢酶(LDH)法，酶标仪测A490值。2.6 数据处理实验结果以s表示，用spss11软件进行统计分析比较，采用单因素方差分析检验其显著性。3 结果3.1 余甘子提取物对小鼠体液免疫功能和腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响结果见表1。与对照组相比，灌胃给药组都能显著提高血清血溶素水平(P<0.05)，但组间比较无显著差异(P>0.05)，无显著量-效关系。与对照组比较，灌胃给药组的吞噬百分率和吞噬指数有显著性差异(P<0.05)，提示余甘子提取物能提高小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬功能;巨噬细胞吞噬指数和吞噬百分率均随剂量增加而增加，但剂量增加到一定程度后，其作用效果就不再增加(中剂量组和大剂量组之间的吞噬百分率和吞噬指数差异无统计学意义，P>0.05)。表1 余甘子提取物对小鼠体液免疫功能和腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响3.2 余甘子提取物对小鼠T细胞增殖反应、迟发型变态反应和NK细胞活性的影响表2结果显示：余甘子提取物能增强经PHA诱导的小鼠T淋巴细胞转化。灌胃给药组与对照组比较,差异有显著性( P<0.05) 。说明余甘子提取物能显著增强T细胞增殖反应，而且作用呈量-效关系。各组小鼠耳肿胀度随剂量而逐渐增加，中、大剂量组肿胀度与对照组相比差异有显著性(P<0.05)，提示余甘子提取物能可以改善DNFB 诱导的小鼠迟发型变态反应，对小鼠特异性细胞免疫功能有促进作用。NK细胞活性随剂量而增加，特别是中、大剂量组NK细胞活性增加极显著(P<0.01)，但中、高剂量组间差异无统计学意义(P>0.05)。表2 余甘子提取物对小鼠T细胞增殖反应、迟发型变态反应和NK细胞活性的影响4 讨论T、B 淋巴细胞是体内的免疫活性细胞，它们的激活、分化和增殖在免疫应答过程中起着重要作用6。巨噬细胞是机体内生物学作用最为活跃的细胞，具有吞噬、杀伤及消化病原体、杀伤肿瘤细胞，并在特异性免疫应答中参与抗原的提呈及免疫调节作用3。NK细胞(natural killer cell,自然杀伤细胞)是与T、B并列的第三类群淋巴细胞，属于非特异性免疫细胞，它们无需抗原预先致敏，就可直接杀伤某些肿瘤细胞和病毒感染靶细胞，在机体抗肿瘤和早期抗病毒和胞内寄生菌感染的免疫过程中起重要作用。此外，NK 细胞活化后还可通过分泌IFN-、IL-2 和TNF 等细胞因子发挥免疫调节作用。因此，NK细胞具有抗肿瘤、抗感染、免疫调节等功能7。迟发型变态反应是由T细胞介导的细胞免疫应答的一种类型,也是常见的一种免疫反应8。这些免疫活性细胞与体液免疫共同构成机体的免疫防御系统。实验结果显示，余甘子提取物能增强小鼠溶血素形成的能力，提示其能提高抗原诱导循环抗体水平，从而实现提高机体的体液免疫力的作用;能提高小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬功能、促进淋巴细胞转化;能改善小鼠迟发型变态反应，对小鼠特异性细胞免疫功能有促进作用;能提高NK细胞活性，增强小鼠非特异性细胞免疫功能。以上结果表明，余甘子提取物具有良好的免疫增强作用，它可能通过增强B淋巴细胞产生特异性抗体，促进溶血，从而使血清溶血素含量增加，促进小鼠的体液免疫功能;也可能刺激T 淋巴细胞转化为致敏淋巴细胞，增强迟发性变态反应，提高巨噬细胞和NK细胞活性，促进小鼠的细胞免疫功能，而促进巨噬细胞活性和T淋巴细胞增殖及使NK 细胞活性提高，可能是余甘子抗肿瘤的作用机制之一。另外，从实验结果综合分析，中剂量(30 mgkg-1d-1) 余甘子提取物对小鼠免疫功能的调节效果较好。本实验对余甘子调节免疫功能的药理作用作了初步研究，目的为余甘子药理机制的研究和开发利用提供实验资料和依据。有关余甘子药理作用机制及其活性物质筛选还有待于进一步研究探讨。【参考文献】 1 张福平. 余甘子的营养价值J. 中国食物与营养,2004,10(1):25.2 李彦博,王 倩,张炳桢.牡丹皮对小白鼠免疫功能的影响J.中华中医药学刊，2007, 25(3):576.3 伍 杨,刘锦红,聂 青.长叶胡颓子叶对小鼠免疫功能的影响J.时珍国医国药，2006,17(8):1403.4 秦红兵,杨朝晔,刘红旗，等. 麋鹿角醇提液对正常小鼠免疫功能的影响J. 中成药，2006,28(12):1813.5 陈子珺,李云森,周吉燕，等. 香茶菜的免疫药理作用研究J.