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文档简介
DNA的琼脂糖凝胶电泳,一、目的要求 二、原理 1、类型: (1)聚丙烯酰胺凝胶电泳 适合分离1kb以下的片段,最高分辨率可达1bp,也用于分离寡核苷酸,在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化,也称PAGE纯化。,(2)琼脂糖凝胶电泳 可分离的DNA片段大小因胶浓度的不同而异,胶浓度为0.50.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp50kb。电泳结果用荧光染料染色后可直接在紫外下观察,并且可观察的DNA条带浓度为纳克级,而且整个过程一般1小时即可完成。由于该方法操作的简便和快速,在基因工程中较常用。,琼脂糖:从琼脂中分离得到,由1,3连接的吡喃型b-D-半乳糖和1,4连接的3,6脱水吡喃型阿a-L-半乳糖组成,形成相对分子量为104105的长链。 琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布,当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接,形成孔径结构,随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。,不同类型琼脂糖分离DNA片段大小的范围,2、DNA电泳影响因素 主要分两方面:DNA分子特性和电泳条件。 (1)DNA分子大小 DNA分子越大在胶中摩擦阻力就越大,泳动也越慢, 迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。 (2)DNA分子构型 相同分子量质粒DNA,构型不同电泳时受的阻力不同,泳动速率不同。常规电泳中质粒DNA分子的3种构型泳动速率:超螺旋最快、线状次之,开环最慢。,(3)胶浓度 (4)电场强度:根据需要选择合适电压。 为了尽快得到实验结果,所用电场强度约为5V/cm, 但分辨率不高。 精确测定DNA分子大小时,电压1V/cm。 (5)溴化乙锭 简称EB,电泳中的染色剂。,具有扁平 结构,能嵌入到DNA碱基对间,对线状分子与开环分子影响较小而对超螺旋态的分子影响较大。,(6)电泳缓冲液 常用DNA电泳缓冲液(1000ml) TAE (50) 242gTris 57.1ml 冰乙酸 100ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0),TBE(5) 54gTris 27.5硼酸 20ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0) TPE (10) 108g Tris 15.5ml 磷酸 (85%,1.679g/ml) 40ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0),3、DNA电泳上样缓冲液 主要作用如下: (1) 螯合Mg2,防止电泳过程中DNA被降解(2) 增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内,一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖,这样可以增加样品的比重。大片段电泳中采用Ficoll(聚蔗糖),可减少DNA条带的弯曲和托尾现象。 (3)指示剂监测电泳的行进过程,一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿,它的速率约与300bp的线状双链DNA相同。,4、 DNA电泳上样量的控制 分析性电泳中,一般样品投入量达50100ng/带,即可观察到清晰结果。 珍贵DNA样品则上样量达电泳的最低分辨率510ng/带也可。,5、 DNA电泳的标准分子量(DNA Marker) 目前各厂商开发了各种类型的标准分子量。,6、DNA染料 (1)溴化乙锭 简称EB,电泳中的染色剂。,(2)荧光染料 GoldViewTM核酸染料,三、实验操作步骤 琼脂糖凝胶的制备(浓度依照质粒大小确定). 凝胶板的制备 加样(加样体积在1030ul) 电泳 结果
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