基因克隆与表达finalZJJ.ppt

业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话基因的克隆与表达,张静静 2011-09-24,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话基因克隆(gene cloning) RACE技术服务 基因表达(gene expression) -原核基因表达 -真核基因表达,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话基 因 克 隆 Gene Cloning,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话概述 克隆载体 受体细胞 体外重组的策略 基因克隆工作流程,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话一、概述,确定了遗传信息的携带者 揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理 提出了中心法则和操纵子学说，破译了遗传密码,概述,1973年Cohen完成第一个基因工程实验,经体外重组获得杂合DNA 杂合子转化入大肠杆菌,所需元件： 限制性内切酶 连接酶 载体 受体细胞,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话-通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。,基因克隆（分子克隆molecular cloning）,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话基因克隆的核心-体外重组(Recombination) : 人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话基因克隆的技术路线 目的基因 载体,体外重组,重组子（杂合DNA）,转化,受体细胞,筛选阳性克隆,大量扩增，获得子代DNA,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话二、克隆载体,复制基因(replicator) 选择性记号 克隆位点,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话三、受体细胞 1、定义：外源DNA导入的细胞，是重组体扩增的场所。 2、要求：易于接纳外源DNA 无特异的内源性核酸内切酶 载体复制、扩增不受阻 与载体有互补性,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话四、体外重组的策略,粘-粘连接：最有效、最快捷,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话4、T-A克隆 T-vector两条链的5端含有一个游离的T PCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3端多加一个A,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话五、基因克隆的工作流程 （一）目的基因的获得 （二）体外重组 （三）转化Cacl2法、电击法 （四）重组子的筛选及鉴定 1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑） 2、鉴定：长度鉴定：酶切、PCR （五）测序,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话样品的要求,目标基因序列（最好附原始测序报告）； 克隆模板（包括：菌液、质粒、PCR扩增产物、RT-PCR扩增产物、从其他质粒上酶切得到的DNA片段等）及检测结果和背景资料； 载体及其图谱（常用载体可由我方免费提供）； 注明克隆要求，克隆使用的酶切位点。,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话服务流程,载体构建流程为：酶切、凝胶回收、连接、转化、鉴定、测序。,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话完成时间,2周内完成。,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话最终产品,构建好的重组质粒，不少于1g； 含有重组质粒的菌株； 电泳图谱，测序图谱，酶切图。,快速扩增cDNA末端 RACE,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话技术背景 RACE的基本概念 不同厂家RACE试剂盒的介绍 RACE技术的关键环节 存在的问题及解决办法 最终产品的要求,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话技 术 背 景,得到某基因的片段、全长或近全长cDNA的方法： 建立和筛选cDNA 和DNA 文库。 利用GenBank 数据库中的表达序列标签(express sequence tags , ESTs) 拼接出全长或近全长cDNA 。 是多聚酶链式反应即PCR。 cDNA 末端快速扩增(RACE) 技术。,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话RACE的优点,此方法是通过PCR实现的，无需建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息； 节约了实验所花费的经费和时间； 只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长；,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话RACE的基本概念,cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术是基于PCR技术由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法，为Frohman在1985年首次报道。 3RACE 和5RACE,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话基本原理和方法,利用Oligo (dT) 对mRNA 进行反转录的同时在两头加上通用接头(引物) ，从而可利用基因特异的引物(gene specific primer，GSP)通过PCR 反应快速获得目的序列的5端和3端。,?,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话3RACE原理示意图,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话RACE 产物的鉴定和全长 cDNA 的获得,3或5双链cDNA,限制性内切酶酶切,克隆,3和5重叠序列的连接,RACE 产物的3和5 末端序列的分析,合成相应引物,PCR获得全长cDNA,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话样品要求,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话不同厂家RACE试剂盒的介绍,clontech SMART RACE Invitrogen GeneRacerTM Kit BD SMARTTM RACE (Switching Mechanism At 5 end of the RNA Transcript ),业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话RACE技术的关键环节,RACE 技术的关键环节有2个： 1. 3个连续的酶促反应 （逆转录、TdT加尾、PCR扩增） TdT加尾反应是用脱氧核糖核酸末端转移酶（TDT）催化，它可将dT依次加在寡核苷酸的3端 2. RACE的引物 即使3个酶促反应均平稳顺利进行，但结果也通常会出现一些非特异性产物或非全长的产物背景。,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话存在的问题及解决办法,反转录 RNA的质量 有高质量的不被核糖核酸酶降解的RNA，RNA的完整性至关重要。一旦RNA降解就要重新提取，免得后期工作没有结果既浪费时间又浪费试剂，给试验带来麻烦。 反转录提前终止 模板中有特殊的二级结构，反转录提前终止。通过提高反转录的温度，加大反转录的反应体系以及反转录过程中一直保持已变性的RNA模板处于50以上，避免以解开二级结构的RNA再恢复原来的结构，以达到5末端。,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话RACE引物的设计 在实验过程中总结如下经验： 引物不能设计在保守区简并引物区。 各引物之间尽量不要重叠，由于引物的重叠，会引起很严重的引物多联体现象，不能准确地扩增。 尽量多设计引物，以减少PCR扩增的非特异性。也可以考虑在PCR鉴定阳性克隆的时候另设计一对引物，便于鉴定的正确性。,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话PCR扩增及产物的克隆 PCR扩增存在的问题 一方面可能未找到最佳扩增条件而导致产生许多不确定的、不需要的产物，有时甚至没有目的产物； 另一方面，可能根本就没有扩增到任何产物。 增加PCR扩增效率，提高扩增产物的特异性解决方法： 热启动PCR(hotstartPCR)，长距离PCR(long distance PCR)和降落PCR(touchdown PCR)以及加大反应体系中Mg2+的浓度提高扩增效率。 单引物的线性扩增问题：坚持做单引物对照，并减少引物的浓度。,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话A：The first PCR； BC：Nest PCR M：2000marker； 1：5GSP11+NAP； 2：NAP； 3：5GSP332+AUAP； 4,6：AUAP； 5：5GSP333+AUAP,图 多轮PCR扩增的电泳结果 Fig. Results of PCR amplified,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话图 5RACE、3RACE克隆的片段与GsAP2序列拼接的结果 Fig. The contig result of 5RACE 、3RACE and GsAP2 by software,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话完成时间,完成时间3-6周内完成。对于有些RNA难以抽提的材料或样品材料本身质量问题，时间较长，会在1周内和客户协商约定时间。 特殊样品除外。,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话最终产品,扩增全片段测序报告一份 扩增片段的电泳图 含未知末端片段的质粒载体及细菌一份,RACE技术应用,RACE技术主要是应用于对全长cDNA序列的获得，但对该技术进行一定的修改后，也可在其它方面显示出极高的应用价值。 RACE技术与生物信息学,例如EST库相结合,具有快速,高效克隆新基因的特点,为快速钓取基因家族候选新成员提供新思路,如果一个基因是多基因家族的一个成员,用基因特异引物(GSP)可能同时扩增几个高度同源的Cdna.李红等利用一条cDNA作为探针,通过BLASTN从GenBank中整合出了7条更长的EST,通过设计引物,利用RACE扩增,得到了7条新基因.相比单纯寻找新基因的全长,此种方法的结合充分利用了信息巨大的基因资源库,得到了更多的信息,获得新基因速度更快*效果更高,属一种颇具规模化的方法,很有应用前景。 随着RACE技术的不断改进和完善,优化PCR扩增的条件以提高扩增的效率和忠实性，RACE技术必将在基因克隆以及基因家族和基因表达变化等研究中发挥极大的作用。,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话基因的表达 Gene Expression,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话一表达系统： 基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括克隆载体，表达载体及受体细胞。,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话据受体细胞的不同可分为： 1原核表达系统： 将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。 2真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达的体系。,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话二原核生物基因结构和表达特点,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续进行。 原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话3、一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统 4、原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话五原核表达载体： 适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。 主要元件：强启动子 SD顺序 筛选标志 其它调控基因,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话技术关键：克隆基因插入原核序列3端而维持正确阅读框架。 选择合适酶切位点 加人工合成的DNA接头 构建位相载体,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话优点： 表达效率高 产物稳定 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定 易纯化：利用融合原核多肽的特性,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话Ptac：IPTG诱导 GST融合蛋白直接纯化 产物切割方便： pGEX-1T凝血酶 pGEX-2T-凝血酶 pGEX-3T-X因子 位相载体,融合型载体-pGEX系列,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话服务概述,目前本实验室主要采用原核表达体系为pET载体系列与pGEX载体系列，表达菌株为BL21(DE3)系列菌株和Rosseta系列菌株，如有特殊需要，我们还单独可以提供特殊菌株与载体。,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话样品要求,待测基因序列信息； 基因片段； 待测组织材料或RNA； 待表达基因已尝试表达的方法与结果； 表达基因的特殊要求（带何种标签及标签的位置）； 纯化方式； 最终表达量等。,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话服务流程,1、客户提供的基因片段。 2、构建重组载体质粒：把目的基因片段与相同酶切后的表达载体连接，转化大肠杆菌克隆菌株感受态细胞，筛选转化子，测序鉴定。 3、把重组载体质粒转化至BL21(DE3)或Rosseta系列表达菌株中，筛选转化子。 4、重组表达质粒在表达菌株中的诱导表达。 5、表达产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。 6、表达产物的纯化（按照柱材说明书操作）。 7、纯化产物免疫学活性的鉴定（ELISA 或WESTERN BLOTTING检测）,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话完成时间,12月。,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话最终产品,完整实验报告 含有目的基因的表达载体质粒以及对应的菌株。纯化的目的蛋白,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话八、原核表达系统的缺点 1、没有转录后加工系统，不能识别、剪除内含子 2、缺乏翻译后加工系统，不能对翻译的蛋白质进一步修饰加工,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话真核表达系统的必要性及优势 1. 具转录后加工系统 2. 具翻译后修饰系统 3. 可实现真正的分泌表达 4.基因治疗,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话真核基因结构及表达调控特点 （一）真核基因组的复杂性 真核基因组庞大，具大量非编码序列 -mRNA丰度不同 结构复杂：染色质、核膜、线粒体-表达调控多样 不连续性：内含子、外显子 没有操纵子结构,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话(二）真核表达系统 组成：真核表达载体 受体细胞 基因转移方式,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话据受体细胞及表达载体的不同分为3种： 酵母表达系统 哺乳动物细胞表达系统 昆虫细胞表达系统,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话（三）转化 1、原生质体法：去除厚壁 2、电穿孔法：效率较高,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话（四）外源基因的表达 1、胞内表达 2、分泌表达：在MCS前加入信号肽序列,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话（五）缺点 不能实现全部的翻译后修饰功能,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话酵母真核表达,目前本实验室主要采用酵母表达体系的载体为pPIC9k与pPIC3.5k，表达菌株为毕赤酵母GS115与KM71，如有特殊需要，我们还单独可以提供特殊菌株与载体。 样品要求，以及实验报告同原核表达。,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话哺乳细胞真核表达,1 随着愈来愈多的治疗疾病的药物蛋白质被发现，高纯度活性蛋白的获得具有更大的意义。 2 通过各种真核表达系统生产外源蛋白是目前研究的热点领域，也是今后蛋白质工程技术一个重要的研究方向。 3 它不仅可以表达克隆的cDNA，而且还可以表达真核基因组DNA，表达的蛋白质可以被适当地修饰(糖基化等)。,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话样品要求,1.目的基因序列信息 2.基因片段亚克隆模板（包括：菌液、质粒、PCR扩增产物、RT-PCR扩增产物、从其他质粒上酶切得到的DNA片段等）及检测结果和背景资料； 3.待表达基因的特殊要求（带何种标签及标签的位置） 4.纯化方式； 5.最终表达量等。,业务员 QQ 807475538 公司网址： 客服电话服务流程,哺乳动物细胞的瞬时表达： 1、获得含合适限制性内切酶位点的目的基因片段：合成基因或者客户提供(cDNA、基因组DNA、质粒等)； 2、