[精品论文]Sonic Hedgehog 信号通路在脉络膜-视网膜.doc

精品论文sonic hedgehog 信号通路在脉络膜-视网膜血管内皮细胞增殖、迁移和血管管腔形成中 的作用5何花，李贵刚（华中科技大学同济医学院附属同济医院眼科，武汉 430030） 摘要：【目的】目前研究表明 sonic hedgehog (shh)信号通路参与组织缺血缺氧下血管新生 的病理过程，而缺血缺氧在脉络膜新生血管（cnv）中起着重要作用。本实验研究旨在探 讨 shh 信号通路在缺氧状态下脉络膜-视网膜血管内皮细胞增殖、迁移以及血管管腔形成中10的作用及机制。【方法】用 200 mol/l cocl2 造成体外细胞化学性缺氧，体外培养缺氧状 态下的脉络膜-视网膜内皮细胞(rf/6a 细胞)来研究缺氧条件下 shh-ptch-gli1 信号通路及相 关信号通路中 ptch1、gli1、dll4, hes1, hif-1 等基因的时程表达规律。利用 real-time pcr 和蛋白印迹技术研究 shh 信号通路的激动剂和阻滞剂对相关调控基因（ptch1、gli1、dll4） mrna 和蛋白表达水平的影响，并进一步研究了 shh 信号通路的激动剂和阻滞剂对 rf/6a15细胞参与新生血管形成的生物学功能（包括细胞增殖，移行以及管腔形成）的影响。【结果】 缺氧导致体外 rf/6a 细胞中 ptch1、gli1、dll4、hes1 和 hif-1 的表达上调。shh 信号通路激动剂 rshh 能促进相关调控基因（ptch1、gli1、dll4）mrna 和蛋白的表达，并 能促进缺氧下 rf/6a 细胞增殖、迁移和血管管腔形成。相反，shh 信号通路阻滞剂 cyclopamine 则能下调调控基因（ptch1、gli1、dll4）mrna 和蛋白的表达，并能抑制20缺氧下 rf/6a 细胞增殖、迁移和血管管腔形成。两者作用具有显著性差异(p0.05)。【结论】 shh 信号通路可通过调节交互的 hif-1-vegf-dll4 信号通路来参与 cnv 发生发展。shh 信号通路的阻断剂可抑制缺氧条件下脉络膜血管内皮细胞增殖、迁移以及血管管腔形成。选 择性调节 shh 信号可能是 cnv 治疗的新途径。关键词：sonic hedgehog；脉络膜新生血管；血管内皮细胞；缺氧25effect of sonic hedgehog signaling on the proliferation, migration and tube formation of hypoxic choroid-retinal endothelial cellshe hua, li guigang30(department of ophthalmololgy, tongji hospital affiliated to tongji medical college,huazhonguniversity of science and technology, wuhan 430030)abstract: 【objective】hypoxia and ischemia are thought to play an important role in theformation of choroidal neovascularization (cnv). sonic hedgehog (shh) signaling has recently been shown to be involved in the pathological angiogenesis response to tissue hypoxia and35ischemic injury. the aim of this study was to evaluate the effects of the sonic hedgehog signaling on proliferation, migration and tube formation of choroid-retinal endothelial cells under hypoxicconditions.【methods】in order to evaluate the expression and role of shh signaling during cnv,our study utilized chemical hypoxia induced by 200m cocl2 to observe the expression of shh signaling in hypoxic choroid-retinal endothelial cells (rf/6a cells), mrna and protein expression40of key genes, including ptch1, gli1 and dll4, in hypoxic rf/6a cells were investigated by real-time pcr and western blot analysis. the effects of the shh signaling on the biological function of hypoxic rf/6a cells during angiogenesis, including cell proliferation, migration and,tube formation, were investigated. 【results】the results showed that hypoxic conditions lead to upregulation of ptch1、gli1、dll4、hes and hif-1 expression in rf/6a cells in vitro. the shh基金项目：教育部新教师基金项目（基金编号 20090142120068）作者简介：何花，女，副教授，副主任医师，研究方向：眼脉络膜新生血管的基础研究. e-mail:- 10 -45activator (recombinant sonic hedgehog n-terminals protein, rshh) not only can promote the mrna and protein expression of ptch1, gli1, and dll4, but also induce the cell proliferation, migration and, tube formation of hypoxic rf/6a cells. on the other hand, the shh blockade (cyclopamine) can significantly down-regulate the mrna expression and protein expression of ptch1, gli1 and dll4, furthermore, reduce significantly the cell proliferation, migration and,50tube formation of hypoxic rf/6a cells【.conclusion】the sonic hedgehog signaling pathway mayact as a cross-talk signaling pathway which controls the expression of the hypoxia-regulated hif-1a-vegf-dll4 cascade in the cnv. .cyclopamine, acting as a shh blockade, may represent a novel therapeutic alternative drug by blocking the proliferation, migration and tube formation of hypoxic rf/6a cells.55keywords: sonic hedgehog; choroidal neovascularization; endothelial cells; hypoxia0引言脉络膜新生血管（cnv，choroidal neovascularization）是来自脉络膜的病理性新生血管， 它是年龄相关性黄斑变性等多种眼底疾病不可逆性致盲的主要原因1,2。cnv 以往研究的焦60点主要集中在血管内皮细胞（ec）和血管内皮生长因子（vegf）。在此基础上发展起来的 临床治疗主要倾向于玻璃体腔注射 vegf 拮抗药物（macugen、lucentis 等）和光动力疗法， 前者可抑制 ec 增殖以对抗 cnv 生长，后者则破坏 ec 导致血管栓塞，主要针对已形成的 cnv 晚期的并发病变。尽管两者在一定程度上可改善视力，但仍未达到理想的治疗效果， 患者需要长期反复多次的昂贵治疗，不仅延长了病程，增加并发症发生的风险，而且带来巨65大的精神和经济负担。深入研究 cnv 的发病机制和提供新的治疗靶点是目前眼科的研究热 点。cnv 本质上是新生的病理性微血管，其发生与脉络膜视网膜局部微环境的缺血和低氧 状态息息相关3,4。sonic hedgehog（shh）信号通路是近年发现的血管新生的新信号通路， 研究证实 shh 信号通路是缺血或低氧损伤组织中血管新生的重要调节环节5,6,7，且 shh 信号70通路（shh-ptch-gli1 通路）调控血管新生的机制与 hif-1 -vegf-dll4 信号通路有关8 。 在体外 cnv 动物模型研究中已发现 shh 及其下游产物 ptch1 表达上调7 。那么 shh-ptch-gli1 信号通路如何参与了 cnv 的形成过程？目前这方面的研究报道较少。本实验研究利用体外培养缺氧状态下的脉络膜-视网膜内皮细胞(rf/6a 细胞)来研究缺 氧条件下 shh-ptch-gli1 信号通路的表达变化。并进一步观察 shh 信号通路的激动剂和阻滞75剂对缺氧状态下 rf/6a 细胞增殖、迁移以及血管管腔形成的影响，从而探讨 shh 信号通路 参与 cnv 形成的作用机制。1研究方法1.1 细胞培养及缺氧方案从上海中科院细胞库获取脉络膜-视网膜内皮细胞系 (rf/6a 细胞),在含 10%胎牛血清80(gibco), 100 u/ml 青霉素,100 g/ml 链霉素的 dmem 培养基培养。血管性血友病因子(santacruz biotech., usa)免疫染色鉴定。细胞缺氧之前给予含 1%胎牛血清的 dmem 培养，加入 200mol/l cocl2 形成缺氧环境。 在检测 shh 信号通路（ptch1、gli1）及相关重要调控基因（dll4、hes1、hdf-1）mrna 的时程表达规律时 rf/6a 细胞分别低氧培养 6h、12h、24h。在研究体外给予 shh 信85号通路的激动剂和阻断剂对 rf/6a 细胞相关调控基因表达及细胞增殖、迁移、血管管腔形 成的影响时，rf/6a 细胞低氧培养 12h。1.2 实时定量 pcr由中国上海 genechem 公司对 ptch1、gli1、dll4, hes1, hif-1 和 gapdh 进行引物 设计及合成。引物序列如表 1 所示。利用 abi prism 7500 系统 (biosystems, usa) ，用90sybr green (takara bio., japan)对 ptch1、gli1、dll4, hes1, hif-1 的 mrna 表达水平 进行实时定量 pcr 检测。每个 cdna 样本放入含 1 l cdna，12.5 l sybr green rt-pcr master mix (2), 以及 1 l 引物 (10 mol/l)的 25 l 容器，重复检测三次。实时定量 pcr 检 测步骤包括 95c 10 min 酶反应，95c15 s 变性及 60c1 min 复性共 40 周期，最后 72c20 min 延伸。利用相对 ct (ct)计算基因表达相对含量(biosystems 提供), 公式如下: 倍数改变95=2-ct, ct 表示信号达到阈值时扩增循环次数。表1 pcr引物序列tab. 1. primers used for pcr analysis100geneprimer sequenceproduct size. bp105110ptch1 forward primer: tctgctgggagtgctgatg 99reverse primer: ttgagaacgccgaggatgggli1 forward primer: ttcctaccagagtcccaagt 185reverse primer: ccctatgtgaagccctatttdll4 forward primer: aggtgcggacatccatcg 118reverse primer: ctgcccacaaagccataagghes1 forward primer: ctaccccagccagtgtcaaca 271reverse primer: aacgcagtaccggcgagtghif-1 forward primer: agaaagcagttccgcaagcc 425reverse primer: catgttccatttttcgctttctgapdh forward primer: accacagtccatgccatcac 452reverse primer: tccaccaccctgttgctgta1151201251.3 蛋白印迹技术（western blot）rf/6a 细胞放入 6 孔板，给予 12 小时的缺氧环境。pbs 冲洗 2 次后每孔给予 100 l 裂 解缓冲液，4c 冰浴 5min。依据生产商提供说明，用 bca protein assay kit (tianlai, china) 测量分析蛋白表达水平。每个蛋白样本 100c 加热 10 min 后载入 5%sds-聚丙烯酰胺凝胶， 冰转移缓冲液(25 mmol/l tris, 192 mmol/l 糖胶, 100% 冰乙醇)中转移至硝酸纤维素膜，5% 脱脂乳封闭，一抗分别为兔抗人、鼠 patched 多克隆抗体（abcam 公司产品）、兔抗人、鼠 dll4 多克隆抗体（abcam 公司产品）、兔抗人、鼠 gli1 多克隆抗体（abcam 公司产品） 以及 gapdh 一抗（内对照）检测，结合辣根过氧化物酶的抗兔 igg 孵育。蛋白条带以 gapdh 标准化。重复测量三次。1.4 体外给予 shh 信号通路的激动剂和阻滞剂分组干预低氧环境下（200umcocl2，培养 12 hour）的 rf/6a 细胞进行实验分组，共 4 组。分别 为空白对照组、pbs 液对照组、激动剂干预组（3ug/ml rshh, rshh-重组人 shh 蛋白，r&d 公司，）、阻断剂干预组（3ug/ml rshh+20um cyclopamine, cyclopamine ,美国 sigma 公司）。4 组低氧培养的 rf/6a 细胞均利用实时定量 pcr 和 western blot 技术分析 shh 信号通路相关 调控基因（ptch1、gli1、dll4）的 mrna 和蛋白表达水平。1301351401451501551.5 细胞周期的检测利用流式细胞仪分析 4 组分组干预对低氧 rf/6a 细胞周期的影响。将 rf/6a 细胞接种在密度为每孔 1106 的 6-孔板。缺氧 12 小时后依据生产商提供说明 给予 bd cycletesttm plus dna reagent kit (becton dickinson, usa)。用 facs caliber cytometer (becton dickinson)对样本进行分析。每组使用三个平行孔，实验重复三次。1.6 细胞迁移的检测用纤维连接蛋白包被的孔径为 8 m 的 transwell 小室对 rf/6a 细胞迁移进行分析。将 细胞按 5104 接种至小室内，上室用含 1% fbs 的 dmem 培养基孵育 1 小时后放入 24 孔板 ， 细胞会越过微孔膜向含 dmem 及 10% fbs 200 mol/l cocl2 的下室迁移。孵育 12 小时后膜 上细胞经 4% pfa 固定 giemsa 染色 15 min。用显微镜计数迁移细胞数目，每个小室随机 选择 5 个视野。细胞分为四组: 分别为空白对照组、pbs 液对照组、激动剂干预组（3ug/ml rshh, rshh-重组人 shh 蛋白，r&d 公司，）、阻断剂干预组（3ug/ml rshh+20um cyclopamine, cyclopamine ,美国 sigma 公司）。每组使用三个小室，实验重复三次。1.7 血管管腔形成的检测细胞分 4 组进行干预，分别为空白对照组、pbs 液对照组、激动剂干预组（3ug/ml rshh, rshh-重组人 shh 蛋白，r&d 公司）、阻断剂干预组（3ug/ml rshh+20um cyclopamine, cyclopamine环杷明, 美国 sigma 公司）。在 24 孔培养板内加入 250 l matrigel (bd, usa)37c 孵育 1 小时形成胶体，聚合凝胶后将各组 rf/6a 细胞按 4104 接种至小孔中。每组 三孔，1% fbs ，dmem 及 200 mol/l cocl2 孵育，12 小时后利用倒置相差显微镜观察 matrigel 胶上二维血管管腔形成的情况。每孔随机选择 5 个视野，每组实验重复三次。adobe photoshop 7.0 计算新生血管管腔长度，并用每孔每个视野下血管管腔平均总长度(mm)表示。1.8 统计学分析所有数据以平均值士标准差（sd）或平均值士标准误（se）表示。采用单因素方差分 析检验(anova) ，mann-whitney u test 以及 independent-samples t-test。显著性检验标准为 p0.05。利用 spss for windows l30 软件(spss inc., usa)进行统计学分析。2结果2.1 细胞培养及鉴定培养的 rf/6a 细胞和血管性血友病因子免疫染色鉴定,胞浆被 tritc 结合二抗染成红色(图 1)。160165170图1 培养的rf/6a 细胞和细胞鉴定。a：亚融合状态的rf/6a 细胞 (200); b:培养的rf/6a细胞血管性血 友病因子免疫荧光染色(400)。fig. 1 cultured rf/6a cells and cell identification. a: subconfluent rf/6a cells (original magnification 200); b: immunofluorescent staining for von willebrand factor in cultured rf/6a cells. (original magnification 400).2.2 体外不同缺氧时间下 rf/6a 细胞中 shh 信号通路（ptch1、gli1）及相 关调控基因（dll4、hes1、hdf-1）mrna 的时程表达规律。实时定量 pcr 结果显示：ptch1 mrna 表达随低氧时间的延长逐渐升高，gli1、dll4,、 hes1 的 mrna 表达于 12 小时达到最高值，并持续高表达至 24 小时。hif-1mrna 表达在 低氧 6 小时达到最高峰；（图 2）5.0relative mrna expression(normalized to hypoxic time 0 hour)4.54.03.53.02.52.01.5ptch1gli1dll4hes1hif-11.00.50.06h 12h24hhypoxia time (hour)175注：低氧 0 小时的 mrna 表达水平作为参照，其值设为 1，见圆点线条所示。图2 缺氧不同时间下rf/6a 细胞ptch1、gli1、dll4,、hes1、hif-1 mrna表达定量分析fig. 2 expression of the ptch1、gli1、dll4,、hes1、hif-1 mrna in rf/6a cells at different times.1802.3 shh 信号通路的激动剂和阻滞剂对相关调控基因（ptch1、gli1、dll4）mrna 和蛋白表达水平的影响。激动剂 rshh 能促进 shh 信号受体及下游相关调控基因 mrna 表达，阻断剂 cyclopamine 则能减少 shh 信号受体及下游相关调控基因 mrna 表达，其差异有统计学意义（p 0.05） (图 3)。western blot 结果与 real-time quantitative pcr 定量分析结果相符（图 4）。blankpbsrshhrshh+cyclopaminerelative mrna expression(normalized to hypoxic time 0 hour)16.014.0*12.0*10.08.0*6.0*4.0*2.00.0ptch1gli1 dll4185190195图 3 不同干预组对低氧条件下 rf/6a 细胞 ptch1、gli1、dll4 mrna 表达的影响。, p 0.05 与空白对 照组比较；*, p 0.05 与 rshh 组比较。fig. 3 mrna expression of ptch1, gli1 and dll4 in hypoxic rf/6a of different treatment groups. , p0.05 versus blank control. *, p 0.05 versus rshh alone.图 4 不同干预组对低氧条件下 rf/6a 细胞 ptch1、gli1、dll4 蛋白表达的影响。1：空白对照组；2： pbs 对照组；3：rshh 组；4：rshh + cyclopamine 组。fig. 4 protein expression of ptch1, gli1 and dll4 in hypoxic rf/6a of different treatment groups. note:1:blank group; 2: pbs group; 3: rshh group; 4: rshh + cyclopamine group.2.4 shh 信号通路的激动剂和阻滞剂对缺氧下 rf/6a 细胞周期进程的影响。细胞周期分析表明：相对于空白对照组，rshh 组阻滞在 s 期的细胞比例明显增多，其 差异具有统计学意义。（图 5）blank pbs rs hh rs hh+cyclopamine100rf/6a cell cycle distribution806040 *200go/g1 s g2/mstage200205图5 不同干预组对低氧条件下rf/6a 细胞周期的影响。, p 0.05与空白组对照；*, p 0.05与rshh组比较。fig.5 effect on the cell-cycle progression of hypoxic rf/6a cells in different treatment groups. , p 0.05versus blank control. *, p 0.05 versus rshh alone.2.5 shh 信号通路的激动剂和阻滞剂对缺氧下 rf/6a 细胞迁移的影响。细胞迁移实验结果显示：激动剂 rshh 能显著性促进低氧条件脉络膜微血管内皮细胞迁 移，阻断剂 cyclopamine 则显著性抑制其迁移（图 6）。100 *90number of migrated cells807060 *50403020100blank p bs rshh rshhgroups+c yclopamine 210图6 不同干预组对低氧条件下rf/6a 细胞迁移的影响。, p 0.05与空白组对照；*, p 0.05与rshh组比较。fig.6 effect on the migration of hypoxic rf/6a cells in different treatment groups. , p 0.05 versus blankcontrol. *, p 0.05 versus rshh alone.2152202252302.6 shh 信号通路的激动剂和阻滞剂对缺氧下 rf/6a 细胞血管管腔形成的影 响。缺氧 12 小时各组 rf/6a 细胞血管管腔形成情况 (图 7a,b,c,d)。用平均总血管长度表 示二维血管管腔形成情况，激动剂 rshh 导致 matrigel 内形成多而密集的网状血管结构，而 空白对照组形成不完整的稀疏血管网络。a: pbs groupb: rshh groupc: rshh + cyclopamine groupbar = 50 umd:6*54*32tube length , mm12350blank pbs rshhrshh+cyclopaminegroups240图 7 不同干预组对低氧条件下 rf/6a 细胞血管管腔形成的影响。a,b,c 分别为 pbs 液对照组、3ug/ml rshh组、3ug/ml rshh+20um cyclopamine 组的血管管腔形成实验的代表性图片。d 为各组低氧条件下 rf/6a 细 胞血管管腔形成的长度变化。, p 0.05 与空白组对照；*, p 0.05 与 rshh 组比较。fig.7 effect on the tube formation of hypoxic rf/6a cells in different treatment groups. reprresentative photographs of each group are shown. a: pbs group;b: 3ug/ml rshh group;c: 3ug/ml rshh+20um cyclopaminegroup. d: the tube length of hypoxic rf/6a cells in each group., p 0.05 versus blank control. *, p 0.05versus rshh alone.2452502552603讨论shh 信号通路调控血管新生主要通过 shh-ptch-smo-gli1 级联反应实现的。sonic hedgehog 效应细胞膜上有两种受体，即 ptch 和 smo。在缺少 shh 时，ptch 和 smo 相互作 用来抑制下游信号传导；当 shh 存在时，shh 连接到 ptch 和 smo 的复合物受体上，ptch 和 smo 解离，活化的 smo 将信号传到细胞内，激活细胞内的转录因子，即 gli 基因家族，激 活的 gli 进而转录激活下游靶基因。gli1 被认为是 shh 信号通路中目的基因激活的标记物。 研究已证实，shh 信号通路在血管新生特别在缺血或低氧损伤组织的血管新生中发挥着重要 作用，缺血后肢新生血管模型、小鼠伤口愈合模型和角膜新生血管模型中均可检测到 shh 信号通路的表达9,10,11,12。hif-1-vegf-dll4 信号通路在缺氧下血管新生中亦起重要作用。shh 信号与缺氧调节 基因 hif-1、vegf 以及 dll4 之间的关系已被证明12,13。本实验的结果表明在缺氧损伤 组织的血管新生中起关键作用的 shh 信号通路同样参与了实验性脉络膜新生血管的形成，且 调控机制与起核心作用的 hif-1 -vegf-dll4 信号通路有关。shh 信号通路通过调节下游 hif-1-vegf-dll4 通路来促进 cnv 形成。环杷明（cyclopamine）是一种来源于藜芦属植物的甾体生物碱。它能与 shh 信号通路 中的 smo 结合，改变 smo 的空间构象，失去活性的 smo 进而抑制 shh 信号通路下游的信号 传导。在大鼠碱烧伤所致的角膜新生血管模型和小鼠病理性视网膜血管新生模型的研究中 14，环杷明作为 shh 信号通路特异性的阻断剂，均证实有明显抑制新生血管形成的作用。本实验的结果显示环杷明作为 shh 信号通路的阻断剂可抑制缺氧条件下脉络膜血管内 皮细胞增殖、迁移以及血管管腔形成。环杷明可拮抗内源性 shh，下调 gli1 表达的同时，265270也下调 dll4 的表达水平，这提示 shh-gli1 可能作为 hif-1-vegf-dll4 级联反应的交互信号，共同参与了实验性 cnv 的形成。4结论研究结果表明 shh 信号通路可通过调节交互的 hif-1-vegf-dll4 信号通路来参与 cnv 发生发展。shh 信号通路的阻断剂可抑制缺氧条件下脉络膜血管内皮细胞增殖、迁移 以及血管管腔形成。选择性调节 shh 信号可能是 cnv 治疗的新途径。参考文献 (references)2752802852902951 friedman ds,ocolmain bj,munoz b.prevalence of age-related macular degeneration in the unitedstatesj.arch ophthalmol,2004,122(4):564-572.2 bressler nm,bressler sb.age-related macular degenarationj.surv ophthalmol,1988,32(6):375-413.3 starita c.hydrodynamics of ageing brchs membrane:implications for macular diseasej.exp eyeres,1996,62(5):565-572.4 feigl b.age-related maculopathy in the light of ischaemiaj.clin exp optom,2007,90(4):263-271.5 pola r,ling le.the morphogen sonic hedgehog is an in direct angiogenic agent upregulating two families of angiogenic