SNT 2676-2010 进出口粮谷中T-2毒素的检测方法 酶联免疫吸附法.pdf

书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖犜 进出口粮谷中犜 毒素的检测方法 酶联免疫吸附法 犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犜 犻 狀犮 犲 狉 犲 犪 犾 狊 犳 狅 狉 犻 犿 狆 狅 狉 狋 犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋 犈 狀 狕 狔 犿 犲 犾 犻 狀 犽 犲 犱 犻 犿犿 狌 狀 狅 狊 狅 狉 犫 犲 狀 狋 犪 狊 狊 犪 狔 发布 实施 中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 书书书 前 言 本标准按照 给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位： 中华人民共和国山东出入境检验检疫局。 本标准主要起草人： 孙静克、 鲍蕾、 张艺兵、 吕宁、 吴振兴、 金莹、 田娟、 许艳丽。 犛 犖犜 进出口粮谷中犜 毒素的检测方法 酶联免疫吸附法 范围 本标准规定了进出口粮谷中 毒素的酶联免疫吸附检测方法。 本标准适用于大麦、 小麦、 高粱、 玉米中 毒素的检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本（ 包括所有的修改单） 适用于本文件。 分析实验室用水规格和试验方法 方法提要 本方法的测定是基于竞争性酶联免疫反应， 用甲醇水振荡提取粉碎样品中的 毒素。处理后样 品中的 毒素与 毒素酶标记物竞争结合至包被在微孔板上的抗体。通过洗涤除去微孔上未结合 的 毒素与 毒素酶标记物， 然后加入反应底物， 用酶标仪测定吸光度， 根据吸光度值得出试样中 的 毒素含量。 试剂和材料 除注明外， 所用化学试剂均为分析纯， 水为 规定的一级水。 毒素检测试剂盒（ 参见附录） 。 甲醇。 甲醇水提取液： 用甲醇和水以的比例配制成提取液备用。 毒素标准品： 纯度大于等于 。 毒素标准品溶液的配制： 用乙腈作为溶剂配制成 的储备液， 于条件下保存。 值为 的样品稀释用磷酸盐缓冲液（ 缓冲液） ：分别称取 磷酸二氢钠（ ） ， 磷酸氢二钠（ ） 和 氯化钠， 用水溶解并定容至。如果毒素含量较 高， 需要更高倍稀释时（ 大于） ， 应向此缓冲液中加入 的甲醇溶液， 以保证甲醇溶液的浓度 为 。 仪器和设备 天平： 感量 。 均质器。 涡旋混合器。 微量移液器： ， ， 。 犛 犖犜 多通道微量移液器： 。 容量瓶： ， 。 酶标仪。 粉碎机。 离心机： 。 试样的制备与保存 试样的制备 将样品按四分法缩分至 ， 全部磨碎至颗粒可通过 目筛大小， 混匀， 均分成两份作为试样， 分 别装入清洁的容器内， 密封， 并标明标记。在抽样和制样的操作过程中， 应防止样品受到污染或发生残 留物含量的变化。 试样的保存 将试样于以下避光保存。 分析步骤 提取 称取 试样（ 精确到 ） ， 加入 甲醇水提取液（ ） ， 均质 ， 离心 。离心后取 滤液加入 样品稀释液， 混匀。取 进行酶联免疫测定， 最后 稀释倍数为 。高浓度的样品， 毒素含量如超出标准曲线范围， 可进一步稀释， 直至样品中毒素浓度在 标准曲线范围以内。 测定条件 操作条件 所有操作应在室温下（ ） 进行， 毒素试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温 （ ） 后方可使用。 洗板条件 人工洗涤次数次以上， 每次加入洗涤液量为 ， 自动洗板可以预定次。 酶标仪测定条件 酶标仪测定波长为 。 测定步骤 将测定需用的微孔条插入微孔架， 记录标准液和样液在微孔架上的位置。 吸取 毒素标准液（ 浓度分别为、 、 、 、 、 ） 和样液至各微孔。 吸取 毒素酶标记物至各微孔， 均匀混合， 依次加入 毒素抗体， 混合， 以封口 膜将微孔覆盖防止试液挥发， 于 黑暗避光处孵育。 倒出孔中液体， 以 蒸馏水反复清洗微孔， 重复操作次以上， 将微孔倒置在吸水纸上拍 打数次， 以保证完全除去微孔中洗液。 犛 犖犜 迅速加入 底物至各微孔， 于 黑暗避光处孵育 。 孵育完毕后加入 反应停止液至各微孔， 充分混匀， 上酶标仪测量并记录每个微孔试液 波长处的吸光度值（ 加入反应终止液后应在 内读取吸光度） 。 平行试验 按以上步骤， 对同一标准溶液、 同一样品溶液均应进行平行试验测定。 空白试验 除不称取试样外， 均按上述步骤进行。 阳性质控 每次测定均应做一个添加自配 毒素标准品溶液（ ） 的监控样品。以确定实验过程的操作准 确性。 结果计算 标准品和样品的 平均值除以零标准（ 犃、犃） 的平均 值， 再乘以 ， 计算出各标准液和样 品的百分比吸光度值。零标准为 （ 最大吸光度值） ， 其他 值为最大吸光度值的百分数。以吸 光度的百分比值（ 犅犅） 为纵坐标（） ， 毒素标准溶液浓度（ ） 的对数值为横坐标绘制标准工 作曲线。从标准工作曲线上得到试样中相应的 毒素浓度后， 结果按式（ ） 进行计算。 犡 犮犞 犿 （） 式中： 犡 样品中 毒素的残留量， 单位为微克每千克（ ） ； 犮 从标准工作曲线上得到的样品中 毒素浓度， 单位为纳克每毫升（ ） ； 犞 样品溶液的最终定容体积， 单位为毫升（ ） ； 犿 样品溶液所代表的最终试样质量， 单位为克（） 。 也可以用各种酶标仪的数据处理软件进行计算。 注：计算结果扣除空白值， 所得结果保留一位小数。 确证试验 如被测样品中 毒素含量的值大于限量要求时， 应用其他方法进行确证。 本方法测定低限、 回收率、 精密度 测定低限 本方法的测定低限为 。 回收率 本方法 毒素添加浓度和回收率实验数据： 添加量为 时， 回收率为 ； 添加量为 时， 回收率为 ； 犛 犖犜 添加量为 时， 回收率为 ； 添加量为 时， 回收率为 。 精密度 本方法在大麦中的精密度为 ， 在高粱中的精密度为 ， 在小麦中的精 密度为 ， 在玉米中的精密度为 。 犛 犖犜 附 录 犃 （ 资料性附录） 德国犚 犅 犻 狅 狆 犺 犪 狉 犿试剂盒） 犃 试剂和组成 犃 包被有抗体的微孔条， 条孔。 犃 毒素标准液（ 浓度分别为、 、 、 、 、 ） 。 犃 毒素酶标记物。 犃 毒素抗体。 犃 底物。 犃 样品稀释缓冲液。 犃 反应停止液。 试剂盒应在避光条件下保存。 犃 标准校正曲线 标准校正曲线见图 。 图犃 标准校正曲线 ） 给出该信息是为了方便本标准的使用者， 并不表示对某一产品的认可。如果其他产品具有相同的效果， 需经实 验评估后使用这些等效产品。 犛 犖犜 犉 狅 狉 犲 狑 狅 狉 犱 犜 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱狑 犪 狊狆 狉 狅 狆 狅 狊 犲 犱犫 狔犪 狀 犱 犻 狊狌 狀 犱 犲 狉 狋 犺 犲犮 犺 犪 狉 犵 犲狅 犳 狋 犺 犲犮 犲 狉 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犪 犮 犮 狉 犲 犱 犻 狋 犪 狋 犻 狅 狀犃 犱 犿 犻 狀 犻 狊 狋 狉 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳 狋 犺 犲犘 犲 狅 狆 犾 犲狊犚 犲 狆 狌 犫 犾 犻 犮狅 犳犆 犺 犻 狀 犪 犜 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱狑 犪 狊犱 狉 犪 犳 狋 犲 犱犫 狔犛 犺 犪 狀 犱 狅 狀 犵犈 狀 狋 狉 狔 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狉 犲 犮 狋 犲 犱犪 犵 犪 犻 狀 狊 狋犪 狀 狋 犻 犜 狋 狅 狓 犻 狀犪 狀 狋 犻 犫 狅 犱 犻 犲 狊 犜 犺 犲狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱 狊，狋 犺 犲狊 犪 犿 狆 犾 犲 狊犪 狀 犱狋 犺 犲犲 狀 狕 狔 犿 犲 犮 狅 狀 犼 狌 犵 犪 狋 犲犪 狉 犲犪 犱 犱 犲 犱狋 狅狋 犺 犲 犿 犻 犮 狉 狅 狆 犾 犪 狋 犲 狑 犲 犾 犾 狊 犇 狌 狉 犻 狀 犵狋 犺 犲犳 犻 狉 狊 狋犻 狀 犮 狌 犫 犪 狋 犻 狅 狀，狋 犺 犲 狉 犲犻 狊犪犮 狅 犿 狆 犲 狋 犻 狋 犻 狅 狀 犪 犿 狅 狀 犵狋 犺 犲犳 狉 犲 犲犿 狅 犾 犲 犮 狌 犾 犲 狊，犾 犻 犽 犲犜 ，狋 犺 犲狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱 狊狅 狉 狊 犪 犿 狆 犾 犲 狊犪 狀 犱狋 犺 犲犲 狀 狕 狔 犿 犲（犲 狀 狕 狔 犿 犲犮 狅 狀 犼 狌 犵 犪 狋 犲）犳 狅 狉 狋 犺 犲犫 犻 狀 犱 犻 狀 犵狊 犻 狋 犲 狊狅 犳狋 犺 犲犪 狀 狋 犻 犜 犪 狀 狋 犻 犫 狅 犱 狔犪 犱 狊 狅 狉 犫 犲 犱狋 狅狋 犺 犲狊 狅 犾 犻 犱狆 犺 犪 狊 犲 犃 犳 狋 犲 狉狋 犺 犲狑 犪 狊 犺 犻 狀 犵狊 狋 犲 狆， 犪 狀 狔 狌 狀 犫 狅 狌 狀 犱犿 狅 犾 犲 犮 狌 犾 犲犻 狊狉 犲 犿 狅 狏 犲 犱 犜 犺 犲犫 狅 狌 狀 犱犲 狀 狕 狔 犿 犲犪 犮 狋 犻 狏 犻 狋 狔犻 狊犱 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犲 犱犫 狔犪 犱 犱 犻 狀 犵犪 狀犪 犿 狅 狌 狀 狋狅 犳 犮 犺 狉 狅 犿 狅 犵 犲 狀狊 狌 犫 狊 狋 狉 犪 狋 犲 犜 犺 犲犪 犱 犱 犻 狋 犻 狅 狀狅 犳 狋 犺 犲狊 狋 狅 狆狉 犲 犪 犵 犲 狀 狋 犾 犲 犪 犱 狊 狋 狅犪犮 狅 犾 狅 狉 犮 犺 犪 狀 犵 犲犳 狉 狅 犿犫 犾 狌 犲狋 狅狔 犲 犾 犾 狅 狑 犜 犺 犲犪 犫 狊 狅 狉 犫 犪 狀 犮 犲，犿 犲 犪 狊 狌 狉 犲 犱犫 狔犪犿 犻 犮 狉 狅 狆 犾 犪 狋 犲狉 犲 犪 犱 犲 狉（ 狀 犿） ，犻 狊 犻 狀 狏 犲 狉 狊 犲 犾 狔狆 狉 狅 狆 狅 狉 狋 犻 狅 狀 犪 犾 狋 狅狋 犺 犲犜 狋 狅 狓 犻 狀 犮 狅 狀 犮 犲 狀 狋 狉 犪 狋 犻 狅 狀 犻 狀狋 犺 犲狊 犪 犿 狆 犾 犲 犚 犲 犪 犵 犲 狀 狋 狊犪 狀 犱犿 犪 狋 犲 狉 犻 犪 犾 狊 犝 狀 犾 犲 狊 狊狅 狋 犺 犲 狉 狑 犻 狊 犲狊 狆 犲 犮 犻 犳 犻 犲 犱，犪 犾 犾 狋 犺 犲犮 犺 犲 犿 犻 犮 犪 犾 狉 犲 犪 犵 犲 狀 狋 狊狊 犺 狅 狌 犾 犱犫 犲犃 犚犵 狉 犪 犱 犲，狑 犪 狋 犲 狉 犻 狊狋 犺 犲犳 犻 狉 狊 狋犵 狉 犪 犱 犲 犛 犖犜 狑 犪 犲 狉狆 狉 犲 狊 犮 狉 犻 犽 犲 犱 犻 狀犌 犅犜 犈 狀 狕 狔 犿 犲 犻 犿犿 狌 狀 狅 犪 狊 狊 犪 狔犽 犻 狋 犳 狅 狉 狋 犺 犲狇 狌 犪 狀 狋 犻 狋 犪 狋 犻 狏 犲犪 狀 犪 犾 狔 狊 犻 狊狅 犳犜 狊 犲 犲犪 狀 狀 犲 狓犃 犕 犲 狋 犺 犪 狀 狅 犾 犕 犲 狋 犺 犪 狀 狅 犾 狑 犪 狋 犲 狉（）犲 狓 狋 狉 犪 犮 狋狊 狅 犾 狌 狋 犻 狅 狀 犜 狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱：犘 狌 狉 犻 狋 狔 犜 狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱狊 狅 犾 狌 狋 犻 狅 狀：犇 犻 犾 狌 狋 犲狑 犻 狋 犺犪 犮 犲 狋 狅 狀 犻 狋 狉 犻 犾 犲 狋 狅狆 狉 犲 狆 犪 狉 犲犪 狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱狊 狋 狅 犮 犽 狊 狅 犾 狌 狋 犻 狅 狀狅 犳 犵 犿 犔 犻 狀犮 狅 狀 犮 犲 狀 狋 狉 犪 狋 犻 狅 狀 犘 犅 犛犫 狌 犳 犳 犲 狉，狆 犎 ：狑 犲 犻 犵 犺 犵犖 犪 犎犘 犗犎犗， 犵犖 犪犎 犘 犗 犎犗犪 狀 犱犵犖 犪 犆 犾，犳 犻 犾 犾 狌 狆狋 狅 犿 犔狑 犻 狋 犺犿 犲 狋 犺 犪 狀 狅 犾 犱 犻 狊 狋 犻 犾 犾 犲 犱狑 犪 狋 犲 狉 （犞犞） 犃 狋 犺 犻 犵 犺犜 狋 狅 狓 犻 狀犮 狅 狀 犮 犲 狀 狋 狉 犪 狋 犻 狅 狀 狊 狋 犺 犲犱 犻 犾 狌 狋 犲 犱犲 狓 狋 狉 犪 犮 狋狊 狅 犾 狌 狋 犻 狅 狀犿 狌 狊 狋犫 犲犳 狌 狉 狋 犺 犲 狉犱 犻 犾 狌 狋 犲 犱 狑 犻 狋 犺犘 犅 犛犫 狌 犳 犳 犲 狉犮 狅 狀 狋 犪 犻 狀 犻 狀 犵 犿 犲 狋 犺 犪 狀 狅 犾 犃 狆 狆 犪 狉 犪 狋 狌 狊犪 狀 犱犲 狇 狌 犻 狆 犿 犲 狀 狋 犅 犪 犾 犪 狀 犮 犲：犪 犮 狌 狉 犪 狋 犲 犻 狀 犵 犎 狅 犿 狅 犵 犲 狀 犻 狕 犲 狉 犞 犻 犫 狉 犪 狋 狅 狉 犕 犻 犮 狉 狅 狆 犻 狆 犲 狋 狋 犲 狊狑 犻 狋 犺犱 犻 狊 狆 狅 狊 犪 犫 犾 犲狆 犾 犪 狊 狋 犻 犮狋 犻 狆 狊：犔 犔， 犔 犔，犔 犔 犕 狌 犾 狋 犻 犮 犺 犪 狀 狀 犲 犾 狆 犻 狆 犲 狋 狋 犲 狊狑 犻 狋 犺狆 犾 犪 狊 狋 犻 犮狋 犻 狆 狊： 犔 犔 狏 狅 犾 狌 犿 犲 狋 狉 犻 犮犳 犾 犪 狊 犽： 犿 犔， 犿 犔 犈 犔 犐 犛 犃狉 犲 犪 犱 犲 狉犲 狇 狌 犻 狆 狆 犲 犱狑 犻 狋 犺犪 狀 犿犳 犻 犾 狋 犲 狉 犌 狉 犻 狀 犱 犲 狉 犆 犲 狀 狋 狉 犻 犳 狌 犵 犲： 狉犿 犻 狀 犘 狉 犲 狆 犪 狉 犪 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱狊 狋 狅 狉 犪 犵 犲狅 犳狊 犪 犿 狆 犾 犲 犘 狉 犲 狆 犪 狉 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳狊 犪 犿 狆 犾 犲犲 狓 狋 狉 犪 犮 狋 犻 狅 狀 犚 犲 犱 狌 犮 犲狋 犺 犲狊 犪 犿 狆 犾 犲狋 狅犽 犵犫 狔狇 狌 犪 狉 狋 犲 狉 犻 狀 犵，犌 狉 犻 狀 犱狑 犻 狋 犺狋 犺 犲犵 狉 犻 狀 犱 犲 狉狋 狅犾 犲 狋犪 犾 犾狆 犪 狊 狊狋 犺 狉 狅 狌 犵 犺犪 犿 犲 狊 犺 犛 犖犜 狊 犻 犲 狏 犲 犕 犻 狓狋 犺 狅 狉 狅 狌 犵 犺 犾 狔犪 狀 犱犱 犻 狏 犻 犱 犲 犱 犻 狀 狋 狅狋 狑 狅犲 狇 狌 犪 犾 狆 狅 狉 狋 犻 狅 狀 狊 犘 犾 犪 犮 犲 犻 狀犮 犾 犲 犪 狀狊 犪 犿 狆 犾 犲犮 狅 狀 狋 犪 犻 狀 犲 狉 狊，狊 犲 犪 犾 犪 狀 犱 犾 犪 犫 犾 犲 犐 狀狋 犺 犲犮 狅 狌 狉 狊 犲狅 犳狊 犪 犿 狆 犾 犻 狀 犵狆 狉 犲 狆 犪 狉 犪 狋 犻 狅 狀，狆 狉 犲 犮 犪 狌 狋 犻 狅 狀 狊狊 犺 狅 狌 犾 犱犫 犲狋 犪 犽 犲 狀狋 狅犪 狏 狅 犻 犱犮 狅 狀 狋 犪 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 狉 犪 狀 狔犳 犪 犮 狋 狅 狉 狊狋 犺 犪 狋犿 犪 狔犮 犪 狌 狊 犲狋 犺 犲犮 犺 犪 狀 犵 犲狅 犳 狉 犲 狊 犻 犱 狌 犲犮 狅 狀 狋 犲 狀 狋 犛 狋 狅 狉 犪 犵 犲狅 犳狊 犪 犿 狆 犾 犲 犛 狋 狅 狉 犲狊 犪 犿 狆 犾 犲犫 犲 犾 狅 狑 犪 狀 犱犽 犲 狆 狋犪 狑 犪 狔犳 狉 狅 犿犾 犻 犵 犺 狋 犃 狀 犪 犾 狔 狊 犻 狊狆 狉 狅 犮 犲 犱 狌 狉 犲 犈 狓 狋 狉 犪 犮 狋 犻 狅 狀狆 狉 狅 犮 犲 犱 狌 狉 犲 犠 犲 犻 犵 犺 犵狊 犪 犿 狆 犾 犲（犪 犮 狌 狉 犪 狋 犲狋 狅 犵）犪 狀 犱犪 犱 犱 犿 犔犿 犲 狋 犺 犪 狀 狅 犾 狑 犪 狋 犲 狉狊 狅 犾 狌 狋 犻 狅 狀（ ） ，狊 犺 犪 犽 犲 狉狏 犻 犵 狅 狉 狅 狌 狊 犾 狔犿 犻 狀 犿 犻 狀，犪 狀 犱犮 犲 狀 狋 狉 犻 犳 狌 犵 犲 狉犿 犻 狀犳 狅 狉 犿 犻 狀 犉 犻 犾 狋 犲 狉 狋 犺 犲犲 狓 狋 狉 犪 犮 狋狅 狏 犲 狉狆 犪 狆 犲 狉 犳 犻 犾 狋 犲 狉 犃 犱 犱 犔狊 犪 犿 狆 犾 犲犱 犻 犾 狌 狋 犻 狅 狀犫 狌 犳 犳 犲 狉 狋 狅 犔 犳 犻 犾 狋 狉 犪 狋 犲 犝 狊 犲 犔 犳 犻 犾 狋 狉 犪 狋 犲狆 犲 狉狑 犲 犾 犾 犻 狀 狋 犺 犲 狋 犲 狊 狋 犃 狋 犺 犻 犵 犺犜 狋 狅 狓 犻 狀犮 狅 狀 犮 犲 狀 狋 狉 犪 狋 犻 狅 狀 狊狋 犺 犪 狋犫 犲 狔 狅 狀 犱狋 犺 犲狉 犪 狀 犵 犲狅 犳狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱犮 狌 狉 狏 犲，狋 犺 犲犱 犻 犾 狌 狋 犲 犱犲 狓 狋 狉 犪 犮 狋狊 狅 犾 狌 狋 犻 狅 狀犿 狌 狊 狋犫 犲犳 狌 狉 狋 犺 犲 狉犱 犻 犾 狌 狋 犲 犱 犜 犲 狊 狋犮 狅 狀 犱 犻 狋 犻 狅 狀 犗 狆 犲 狉 犪 狋 犻 狅 狀犮 狅 狀 犱 犻 狋 犻 狅 狀 犃 犾 犾 狋 犺 犲狅 狆 犲 狉 犪 狋 犻 狅 狀狊 犺 狅 狌 犾 犱犫 犲犱 狅 狀 犲犪 狋狉 狅 狅 犿狋 犲 犿 狆 犲 狉 犪 狋 狌 狉 犲（ ）犜 犺 犲狉 犲 犪 犵 犲 狀 狋 狊狊 犺 狅 狌 犾 犱犫 犲 犫 狉 狅 狌 犵 犺 犲狌 狆狋 狅犪 犿 犫 犻 犲 狀 狋 狋 犲 犿 狆 犲 狉 犪 狋 狌 狉 犲（ ）犫 犲 犳 狅 狉 犲狊 狋 犪 狉 狋 犻 狀 犵狋 犺 犲狋 犲 狊 狋 犜 犺 犲狑 狅 狉 犽犮 狅 狀 犱 犻 狋 犻 狅 狀狅 犳狑 犪 狊 犺犿 犪 犮 犺 犻 狀 犲 犕 犪 狀 狌 犪 犾狑 狅 狉 犽：犃 犾 犾 狋 犺 犲狑 犲 犾 犾 狊犿 狌 狊 狋犫 犲狑 犪 狊 犺 犲 犱犿 犪 狀 狌 犪 犾 犾 狔犿 狅 狉 犲狋 犺 犪 狀狋 犻 犿 犲 狊 犈 犪 犮 犺狋 犻 犿 犲犻 狀 犼 犲 犮 狋 犔 狑 犪 狊 犺狊 狅 犾 狌 狋 犻 狅 狀狑 犻 狋 犺犿 狌 犾 狋 犻 犮 犺 犪 狀 狀 犲 犾犿 犻 犮 狉 狅 狆 犻 狆 犲 狋 狋 犲 犃 狌 狋 狅 犿 犪 狋 犻 狊 犿 狑 狅 狉 犽：犃 犾 犾 狋 犺 犲狑 犲 犾 犾 狊狊 犺 狅 狌 犾 犱犫 犲狑 犪 狊 犺 犲 犱 狋 犻 犿 犲 狊犫 狔狋 犺 犲狑 犪 狊 犺犿 犪 犮 犺 犻 狀 犲 犜 犺 犲狑 狅 狉 犽犮 狅 狀 犱 犻 狋 犻 狅 狀狅 犳犿 犻 犮 狉 狅 狆 犾 犪 狋 犲狉 犲 犪 犱 犲 狉 犜 犺 犲犿 犻 犮 狉 狅 狆 犾 犪 狋 犲狉 犲 犪 犱 犲 狉狊 犺 狅 狌 犾 犱犫 犲狌 狊 犲 犱犪 狋 狀 犿犳 犻 犾 狋 犲 狉 犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀 犐 狀 狊 犲 狉 狋犪狊 狌 犳 犳 犻 犮 犻 犲 狀 狋 狀 狌 犿 犫 犲 狉 狅 犳狑 犲 犾 犾 狊 犻 狀 狋 狅狋 犺 犲犿 犻 犮 狉 狅 狑 犲 犾 犾 犺 狅 犾 犱 犲 狉 犚 犲 犮 狅 狉 犱狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱犪 狀 犱狊 犪 犿 狆 犾 犲狆 狅 狊 犻 狋 犻 狅 狀 狊 犘 犻 狆 犲 狋 犔狅 犳 犲 犪 犮 犺狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱（、 、 、 、 、 狀 犵犿 犔）犪 狀 犱狊 犪 犿 狆 犾 犲犱 犻 犾 狌 狋 犻 狅 狀 狋 狅狊 犲 狆 犪 狉 犪 狋 犲 狑 犲 犾 犾 狊；狌 狊 犲犪狀 犲 狑狆 犻 狆 犲 狋 狋 犲狋 犻 狆犳 狅 狉犲 犪 犮 犺狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱狅 狉狊 犪 犿 狆 犾 犲 犛 犖犜 犃 犱 犱 犔狅 犳犲 狀 狕 狔 犿 犲犮 狅 狀 犼 狌 犵 犪 狋 犲狋 狅犲 犪 犮 犺狑 犲 犾 犾 犃 犱 犱 犔狅 犳 狋 犺 犲犪 狀 狋 犻 犜 狋 狅 狓 犻 狀犪 狀 狋 犻 犫 狅 犱 狔狊 狅 犾 狌 狋 犻 狅 狀 狋 狅犲 犪 犮 犺狑 犲 犾 犾 犕 犻 狓犵 犲 狀 狋 犾 狔犫 狔狊 犺 犪 犽 犻 狀 犵 狋 犺 犲狆 犾 犪 狋 犲犿 犪 狀 狌 犪 犾 犾 狔犪 狀 犱 犻 狀 犮 狌 犫 犪 狋 犲 犳 狅 狉 犺犪 狋 犻 狀 狋 犺 犲 犱 犪 狉 犽 犘 狅 狌 狉 狋 犺 犲 犾 犻 狇 狌 犻 犱狅 狌 狋狅 犳 狋 犺 犲狑 犲 犾 犾 狊犪 狀 犱狋 犪 狆狋 犺 犲犿 犻 犮 狉 狅 狑 犲 犾 犾 犺 狅 犾 犱 犲 狉狌 狆 狊 犻 犱 犲犱 狅 狑 狀狏 犻 犵 狅 狉 狅 狌 狊 犾 狔犪 犵 犪 犻 狀 狊 狋 犪 犫 狊 狅 狉 犫 犲 狀 狋狆 犪 狆 犲 狉狋 狅犲 狀 狊 狌 狉 犲犮 狅 犿 狆 犾 犲 狋 犲狉 犲 犿 狅 狏 犪 犾狅 犳 犾 犻 狇 狌 犻 犱犳 狉 狅 犿狋 犺 犲狑 犲 犾 犾 狊 犉 犻 犾 犾 犪 犾 犾 狋 犺 犲狑 犲 犾 犾 狊狑 犻 狋 犺 犔 犱 犻 狊 狋 犻 犾 犾 犲 犱狑 犪 狋 犲 狉犪 狀 犱狆 狅 狌 狉狅 狌 狋 狋 犺 犲 犾 犻 狇 狌 犻 犱犪 犵 犪 犻 狀 犈 犿 狆 狋 狔狋 犺 犲狑 犲 犾 犾 狊犪 犵 犪 犻 狀犪 狀 犱狉 犲 犿 狅 狏 犲犪 犾 犾 狉 犲 犿 犪 犻 狀 犻 狀 犵 犾 犻 狇 狌 犻 犱 犚 犲 狆 犲 犪 狋 狋 犺 犲狑 犪 狊 犺 犻 狀 犵狊 狋 犲 狆狋 狑 狅犿 狅 狉 犲狋 犻 犿 犲 狊 犃 犱 犱 犔狅 犳狊 狌 犫 狊 狋 狉 犪 狋 犲犮 犺 狉 狅 犿 狅 犵 犲 狀狋 狅犲 犪 犮 犺狑 犲 犾 犾 犕 犻 狓犵 犲 狀 狋 犾 狔犫 狔狊 犺 犪 犽 犻 狀 犵狋 犺 犲狆 犾 犪 狋 犲犿 犪 狀 狌 犪 犾 犾 狔 犪 狀 犱 犻 狀 犮 狌 犫 犪 狋 犲犳 狅 狉 犿 犻 狀犪 狋 犻 狀狋 犺 犲犱 犪 狉 犽 犃 犱 犱 犔狅 犳狋 犺 犲狊 狋 狅 狆狊 狅 犾 狌 狋 犻 狅 狀狋 狅犲 犪 犮 犺狑 犲 犾 犾 犕 犻 狓犵 犲 狀 狋 犾 狔犫 狔狊 犺 犪 犽 犻 狀 犵狋 犺 犲狆 犾 犪 狋 犲犿 犪 狀 狌 犪 犾 犾 狔犪 狀 犱 犿 犲 犪 狊 狌 狉 犲狋 犺 犲犪 犫 狊 狅 狉 犫 犪 狀 犮 犲犪 狋 狀 犿 犚 犲 犪 犱狑 犻 狋 犺 犻 狀 犿 犻 狀 狌 狋 犲 狊犪 犳 狋 犲 狉犪 犱 犱 犻 狋 犻 狅 狀狅 犳狊 狋 狅 狆狊 狅 犾 狌 狋 犻 狅 狀 犘 犪 狉 犲 犾 犾 犲 犾 狋 犲 狊 狋 犉 狅 犾 犾 狅 狑 犻 狀 犵狋 犺 犲犪 犫 狅 狏 犲狊 狋 犲 狆 狊，狋 犺 犲狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱 狊犪 狀 犱狊 犪 犿 狆 犾 犲狊 狅 犾 狌 狋 犻 狅 狀 狊犪 犾 狊 狅狊 犺 狅 狌 犾 犱犫 犲犿 犲 犪 狊 狌 狉 犲 犱犪 狋 狋 犺 犲狊 犪 犿 犲 狋 犻 犿 犲犳 狅 狉狆 犪 狉 犪 犾 犾 犲 犾 狋 犲 狊 狋 犅 犾 犪 狀 犽狋 犲 狊 狋 犜 犺 犲狋 犲 狊 狋狊 犺 狅 狌 犾 犱犫 犲犱 狅 狀 犲犳 狅 犾 犾 狅 狑 犻 狀 犵狋 犺 犲犪 犫 狅 狏 犲狊 狋 犲 狅 狊犲 狓 犮 犲 狆 狋 犳 狅 狉犪 犱 犱 犻 狀 犵狊 犪 犿 狆 犾 犲 狊 犘 狅 狊 犻 狋 犻 狏 犲犿 狅 狀 犻 狋 狅 狉 犻 狀 犵 犃 狀 犪 犾 狔 狊 犻 狊犪狉 犲 犮 狅 狏 犲 狉 犻 犲 狊犳 狅 狉 狋 犻 犳 犻 犲 犱犪 狋犿 犪 狓 犻 犿 狌 犿狉 犲 狊 犻 犱 狌 犲 犾 犻 犿 犻 狋（犕 犚 犔）犾 犲 狏 犲 犾 狌 狊 犻 狀 犵犫 犾 犪 狀 犽狊 犪 犿 狆 犾 犲犲 犪 犮 犺狋 犲 狊 狋 犆 犪 犾 犮 狌 犾 犪 狋 犻 狀 犵狋 犺 犲狉 犲 狊 狌 犾 狋 犜 犺 犲犗 犇狏 犪 犾 狌 犲 狊狅 犳 狋 犺 犲狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱 狊犪 狀 犱狋 犺 犲狊 犪 犿 狆 犾 犲 狊（犿 犲 犪 狀狏 犪 犾 狌 犲 狊狅 犳 狋 犺 犲犱 狌 狆 犾 犻 犮 犪 狋 犲 狊）犪 狉 犲犱 犻 狏 犻 犱 犲 犱犫 狔狋 犺 犲 犿 犲 犪 狀犗 犇狏 犪 犾 狌 犲狅 犳 狋 犺 犲狕 犲 狉 狅狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱（狑 犲 犾 犾 狊犃犪 狀 犱犃）犪 狀 犱犿 狌 犾 狋 犻 狆 犾 狔犫 狔 （犅犅） ；狋 犺 犲狕 犲 狉 狅狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱 犻 狊狋 犺 狌 狊犿 犪 犱 犲犲 狇 狌 犪 犾 狋 狅 （犿 犪 狓 犻 犿 犪 犾 犪 犫 狊 狅 狉 犫 犪 狀 犮 犲）犪 狀 犱狋 犺 犲狅 狋 犺 犲 狉犗 犇 犞 犪 犾 狌 犲 狊犪 狉 犲狇 狌 狅 狋 犲 犱犻 狀狆 犲 狉 犮 犲 狀 狋 犪 犵 犲 狊狅 犳 狋 犺 犲犪 犫 狊 狅 狉 犫 犪 狀 犮 犲 犈 狀 狋 犲 狉 狋 犺 犲犅犅狏 犪 犾 狌 犲犮 犪 犾 犮 狌 犾 犪 狋 犲 犱犳 狅 狉犲 犪 犮 犺狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱犻 狀犪狊 犲 犿 犻 犾 狅 犵 犪 狉 犻 狋 犺 犿 犻 犮 狊 狔 狊 狋 犲 犿狅 犳犮 狅 狅 狉 犱 犻 狀 犪 狋 犲 狊犪 犵 犪 犻 狀 狊 狋 狋 犺 犲狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱犜 犮 狅 狀 犮 犲 狀 狋 狉 犪 狋 犻 狅 狀；犱 狉 犪 狑狋 犺 犲狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱犮 狌 狉 狏 犲；犐 狀 狋 犲 狉 狆 狅 犾 犪 狋 犲 狋 犺 犲犮 狅 狉 狉 犲 狊 狆 狅 狀 犱 犻 狀 犵犮 狅 狀 犮 犲 狀 狋 狉 犪 狋 犻 狅 狀犳 狉 狅 犿狋 犺 犲犮 犪 犾 犻 犫 狉 犪 狋 犻 狅 狀犮 狌 狉 狏 犲；犆 犪 犾 犮 狌 犾 犪 狋 犲狋 犺 犲犮 狅 狀 犮 犲 狀 狋 狉 犪 狋 犻 狅 狀 狊狅 犳犜 犻 狀 狋 犺 犲狊 犪 犿 狆 犾 犲 狊犪 犮 犮 狅 狉 犱 犻 狀 犵狋 狅犳 狅 狉 犿 狌 犾 犪（） ： 犡犮犞 犿 （） 犠 犺 犲 狉 犲 犡狋 犺 犲犮 狅 狀 犮 犲 狀 狋 狉 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犜 犻 狀狋 犺 犲狊 犪 犿 狆 犾 犲 狊狌 狀 犻 狋 犻 狀 犵 犽 犵 ； 犛 犖犜 犮狋 犺 犲犮 狅 狀 犮 犲 狀 狋 狉 犪 狋 犻 狅 狀 狊犵 狅 狋 狋 犲 狀犳 狉 狅 犿狋 犺 犲狊 犲 犿 犻 犾 狅 犵 犪 狉 犻 狋 犺 犿 犻 犮狊 狔 狊 狋 犲 犿狅 犳犮 狅 狅 狉 犱 犻 狀 犪 狋 犲 狊狌 狀 犻 狋 犻 狀狀 犵犿 犔； 犞狋 犺 犲犳 犻 狀 犪 犾 狏 狅 犾 狌 犿 犲狅 犳 狋 犺 犲狊 犪 犿 狆 犾 犲狊 狅 犾 狌 狋 犻 狅 狀狌 狀 犻 狋 犻 狀犿 犔； 犿狋 犺 犲犳 犻 狀 犪 犾 狊 犪 犿 狆 犾 犲狑 犲 犻 犵 犺 狋狅 犳 狋 犺 犲狊 犪 犿 狆 犾 犲狊 狅 犾 狌 狋 犻 狅 狀狌 狀 犻 狋 犻 狀犵 犗 狋 犺 犲 狉犱 犪 狋 犪狆 狉 狅 犮 犲 狊 狊 犻 狀 犵狊 狅 犳 狋 狑 犪 狉 犲犮 犪 狀犪 犾 狊 狅犫 犲狌 狊 犲 犱 狋 狅犮 犪 犾 犮 狌 犾 犪 狋 犲 狋 犺 犲犮 狅 狀 犮 犲 狀 狋 狉 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犜 犜 犺 犲 狉 犲 狊 狌 犾 狋 狊 犻 狀 犱 犻 犮 犪 狋 犲狋 狅狅 狀 犲犱 犲 犮 犻 犿 犪 犾 犖 狅 狋 犲：犜 犺 犲犫 犾 犪 狀 犽狏 犪 犾 狌 犲狊 犺 狅 狌 犾 犱犫 犲狊 狌 犫 狊 狋 狉 犪 狋 犲 犱犳 狉 狅 犿狋 犺 犲犪 犫 狅 狏 犲 狉 犲 狊 狌 犾 狋狅 犳 犮 犪 犾 犮 狌 犾 犪 狋 犻 狅 狀 犜 犺 犲 狉 犲 狊 狌 犾 狋 狊犪 犮 犮 狌 狉 犪 狋 犲 狋 狅犱 犲 犮 犻 犿 犪 犾 狆 犾 犪 犮 犲 犆 狅 狀 犳 犻 狉 犿 犪 狋 狅 狉 狔犜 犲 狊 狋 犐 犳狊 犪 犿 狆 犾 犲狉 犲 狊 狌 犾 狋狅 狏 犲 狉犕 犚 犔，犻 狋狊 犺 狅 狌 犾 犱犫 犲犮 狅 狀 犳 犻 狉 犿 犲 犱狑 犻 狋 犺犮 狅 狀 犳 犻 狉 犿 犪 狋 犻 狅 狀犿 犲 狋 犺 狅 犱 犔 犻 犿 犻 狋狅 犳犱 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀，狉 犲 犮 狅 狏 犲 狉 狔犪 狀 犱狆 狉 犲 犮 犻 狊 犻 狅 狀 犔 犻 犿 犻 狋狅 犳犱 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀 犜 犺 犲 犾 犻 犿 犻 狋狅 犳犱 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳 狋 犺 犲犿 犲 狋 犺 狅 犱犳 狅 狉犜 犻 狊 犵 犽 犵 犚 犲 犮 狅 狏 犲 狉 狔 犜 犺 犲犲 狓 狆 犲 狉 犻 犿 犲 狀 狋 犪 犾 犱 犪 狋 犪狅 犳狋 犺 犻 狊犳 狅 狉 狋 犻 犳 狔 犻 狀 犵犮 狅 狀 犮 犲 狀 狋 狉 犪 狋 犻 狅 狀 狊狅 犳犜 犪 狀 犱狉 犲 犮 狅 狏 犲