分子标记SSR标记.ppt

SSR标记,一、简介、原理 二、多态性基础 三、开发、前景,主讲人： 高慧,一、SSR标记 原理,简单序列重复(single sequence repeat）简称SSR s)或微卫星(m icrosatellite)序列大量地存在于大多数真核生物及部分原核生物基因组的非编码区和编码区中，由串联的1- 6 个核苷酸重复片段构成，长度一般在100bp以下，具有长度的超变性。 原理:与微卫星序列相邻的两侧区域保守性通常较高，可以在此保守区域设计一对特异的PCR引物，扩增其中的微卫星序列，通过聚内酞胺凝胶电泳，即可显示出个体间在此位点的微卫星序列的多态性。,二、SSR标记 多态性基础,目前研究过的所有植物中均存在着SSR多态性。绝大多数作物，如大豆、水稻、小麦、玉米、大麦等中，SSR位点上的等位基因数目可多达十几个乃至几十个，个别作物多态性水平较低。和其他DNA分子标记相比，单个SSR位点检测到的等位基因个数和多态性指数(diversity index，用1- E可表示，其中P为某一位点第i个等位基因)是最高的。 对人类SSR的研究表明，核心序列的重复次数与SSR的长度多态性有密切关系。重复次数增加，SSR的长度多态性增高。这一趋势也在一些作物中得到证实。不同重复类型SSR多态性水平存在差异，二核苷酸重复构成的SSR多态性水平要高于其他类型。同一类型SSR的不同位之间，其多态性水平也不一样。有些种类SSR位点其多态性水平明显高于其它位点.如在大豆的研究中发现7个 (ATT) n位点等位基因数目可多达11-26个;由AT重复构成的SSR甚至可区分遗传基础极其狭窄的日本梗稻育成品种。 (TAA/ATT) n类型SSR是小麦基因组中最丰富、多态性最高的三核苷酸重复类型SSR。但因(AT)n类型寡聚核苷酸探针容易形成二级结构，降低了筛选效率，影响了这一类型SSR的分离.然而现有研究表明，(AT)n类型SSR仍是可以分离的。,SSR标记的优势,与其他分了标记如:如RAPD ,RFLP等相比，SSR标记具有以下的优点: （1）在植物基因组中大量地、随机地分布，具有广泛的位点变异，揭示比RAPD , RFLP更多的多态性. （2） SSR标记揭示的是单个位点上复等位基因的信息，为共显性标记，能够区分纯合型和杂合型，提供完整的遗传信息. （3）微卫星序列多态性可以用PCR方法检测，不需要过多的分了克隆乎段，对DNA模板的要求不高，重复性好.因此成为在植物中日前运用最广泛的分了标记之一，广泛地运用于植物种质鉴定、分了标记连锁图的构建和群体遗传学等诸多领域. 但是微卫星标记存在一个重要的局限性就是微卫星序列两侧区域在种间保守性往往较低.种间扩增微卫星标记仅仅局限于同一个属或相近的属的不同物种间的扩增，这大大限制了SSR标记在其他物种中的运用现在有一些从微卫星序列衍生而来的其他分了标记，不用分离单个微卫星位点而获得多个位点指纹图谱，如LSSRs、SAM 等，但由于多位点微卫星指纹图谱带型复杂，难以确定等位基因，大多为显性标记，这限制了它们的运用的范围,三、SSR标记的开发,传统用于克隆单位点微卫星序列的方法包括以下步骤: (1)构建小片段或大片段的基因组. (2)筛选阳性克隆.通过传统的影印或挑单菌落点膜的方法，把克隆转移到尼龙膜上，经过固定后，用标记过的序列重复寡核有酸或含微卫星序列的探针与尼龙膜上的克隆点杂交，筛选出其中的阳性克隆. (3)测序、设计引物、优化PCR反应条件.获得的阳性克隆经过确认后，全部或经过随机挑选后测序，然后根据微卫星序列两侧保守区域的序列设计引物，优化PCR扩增的条件，获得稳定、可靠的SSR标记。,微卫星标记分离技术,为了避免筛选文库，现在有一些与其他成熟技术结合的分离微卫星标记的方法，包括: （1）运用RAM P和RA PD技术分离单位点微卫星标记 RAM P 利用5含有四个锚定碱基的微卫星引物结合不同的RA PD引物在基因组DNA中扩增，获得片段包括两头带反向微卫星序列的扩增片段(为USSR产物)、随机扩增的片段(RA P产物)、随机引物与微卫星基因座间的片段(SSR产物).用标记的5锚定引物扩增或经Southern 后在用标记的微卫星探针与之杂交后，再经过自显影，可以得到只含微卫星标记的指纹图谱.在RAM P和RAPD技术的基础上，人们运用RAM P技术和RA PD技术扩增基因组DNA，得到扩增产物，然后用标记的微卫星的探针与PCR产物Southern杂交或用标记微卫星锚定引物，在PCR扩增后胶上直接观测，选择阳性条带克隆22 i、或者首先克隆所有的PCR产物，制成微列阵，然后筛选克隆。 ( 2)利用1SSR技术分离单基因座微卫星序列 1SSR是1994报道的一种方法.这种方法是用3或5端带有1一4个锚定碱基的微卫星引物，来扩增基因组获得在两端带有相反排列的微卫星序列的DNA片段，经电泳后，显示复杂的指纹图谱.用1SSR引物在基因组DNA中扩增，获得1SSR DNA片段，然后克隆，经测序后，根据微卫星序列间的DNA序列设计两个巢式引物.然后运用巢式引物用“步查”的方法在不同酶切片段的基因组文库中扩增，直至获得微卫星序列的另外一侧的序列，再设计微卫星位点另一端的引物。,5锚定PCR 分离SSR标记,（3）采用5锚定PCR ( 5-anchored PCR)分离SSR标记 采用的5带有六个简并碱基锚定的微卫星序列引物.这种引物锚定效果要比1SSR技术中的随机锚定引物的特异性好，避免了引物在微卫星序列上的滑动.然后用这个单引物在基因组DNA中扩增，得到两端带有反向微卫星序列DNA片段，用T载体克隆PCR产物，然后用Southern杂交的方法，在高严谨度的条件下，获得含微卫星序列的克隆，然后对这些阳性克隆进行测序，根据获得的序列，在微卫星序列的侧翼设计引物，用5锚定简并引物结合微卫星特异性引物，经扩增后获得单位点的SSR标记. 也可以通过步查获得微卫星序列另一侧的序列，并设计另一个引物，然后用成对的特异性引物来扩增单个微卫星位点. 5锚定PCR技术有两个明显的优势，其一，可以简单而快捷地建立SSR富集文库.第二，对于大多数位点仅仅需要一个特异性引物就可以获得位点特异的共显性标记。因此在以后开发的分离单位点微卫星序列的方法中很多都运用了这种引物.,SAM PL技术分离SSR标记,SAMP是Witsenboer等1997创立的一种分离微卫星标记的技术.它同AFLP一样具有择性碱基的AFLP引物接头的连接和预扩增的过程.但是在第二步选择性扩增时，运用的是一个末端带有3个选物和5锚定微卫星引物的组合进行PCR扩增，通过电泳获得多位点的微卫星图，通过不同的A FLP引物和5锚定引物的组合，可以揭示基因组DNA的所有微卫星位点的多态性. 然而用这种方法获得的大多是显性标记，共显性标记占少数，因此有必要把具有重要信息的位点转化为带有有用信息的微卫星标记，基于这种想法H ayden Sharp( 2001)发表了一种改良SAM PL程序，获得SAM PL图谱，在分了标记连锁图上定位SAIVI(se-ectively anplified m icnsatellite)位点选择有兴趣的SAP位点，然后有选择的克隆、测序，根据这个微卫星序列一侧设计一个特异性引物，用与F fisher( 1996)相同的方法来获得单位点的共显性的微卫星标记.,构建富集微卫星序列的基因组文库,构建富集微卫星序列的基因组文库是现在分离单微卫星位点的主要方法，它与传统方法不同在于有一个富集微卫星序列的步骤，按照富集方法的不同，主要有两种方法: 引物延伸反应富集微卫星序列 它的大致步骤为:首先建立以噬菌粒或M13噬菌体为载体的小片段基因组文库这种文库叫初级文库.然后用辅助噬菌体、超感染初级文库，产生单链环状DNA，以单链DNA为摸板，用微卫星序列为引物合成双链DNA，然后富集双链.其卞要步骤如下: （1）经酶切的基因组DNA与噬菌粒相连，连接产物转化大肠杆菌菌株，构建初级文库.在这种菌株.由于缺乏(IUT-P ase和UDG(尿哈陡一DNA糖基化酶)，在复制过程中(IUTP可以有效地代替cIITP掺入DNA中而不会被修复系统修复，因此可以积累含(IUTP的DNA. （2）用M13辅助I体超感染初级文库，产生富含(IUTP的单链环状DNA，并分离出这种单链环状DNA. （3）以单链环状DNA为模板，以微卫星序列为引物用PCR方法对含微卫星序列的DNA进行延仲，这样双链DNA大多数是含微卫星序列的. （4）转化这种反应产物到(dut ung的野生型菌株，由于单链DNA的转化率低，转化得到的克隆大部分为双链DNA.由于在此菌株存(IUTPase和U DG,可以利用自身的修复系统以双链DNA n1:常链为模板替换另一条链中(IUTP替换为cITP,可以得到复制.而经转化而来的少量的单链环状DNA由于尿哈陡一DNA糖基化酶降解cIUTP的作用，得不到有效的复制.这样构建出的文库中就富集了很高比率的含微卫星序列的克隆. 选择杂交法富集微卫星序列 这是现在很多研究人员采用的方法.它在传统构建基因组文库的基础上加上了选择杂交富集含微卫星序列的片段、PCR扩增的过程.杂交的方法有两种:1)把含有核有酸重复的探钊或寡核有酸重复序固定在尼龙膜9.2)把核有酸重复的探针1、寡核有酸重复序列的5端生物素化，然后固定在带有链霉亲和素的磁珠上.通过杂交、洗脱非特异杂交DNA片段后，再用PCR扩增富集洗脱的特异杂交的片段，然后转化大肠杆菌，构建富集微卫星序列的基因组文库。,STMP,STMP技术一种快速、高效分离SSR标记的技术 STMP(Sequence一tagged m icnsatellite pnfiling)是H ayden ( 2001年)在Nucleic acxlresearch发表的文章中介绍的一种方法.它利用SAGE ( serial analysis of gene expressxn)原理，建立含微卫星序列标签文库，可以快速大通量(比常规高25倍)的分离单位点微卫星序列.它通过扩增含有微卫星序列片段，再用限制性内切酶在识别位点下游酶切这些片段，产生了标签序列.虽然这段序列仅有16饰但却可以区分4 3x10倒6)个不同的微卫星位点，大大超过了在植物中估计含有的微卫星位点的数日.然后把这些标签序列连接起来形成串联体，再把它连接到载体上，经测序后，获得串联体中各个标签的序列.由于在一个载体上串联有平均25个左右的标签，所以一个克隆就可以鉴定出多个微卫星位点.在串联体中标签和标签间由一段序列(内切酶识别序列)来标志，这样就可以分辨每个标签和标签的方向.每个标签长度足够设计引物可以用在基因组DNA或在酶切的基因组DNA扩增片段池中分离SSR标记了.它包括:双酶切、加接头经PCR扩增产生带有PstI,M seI头的扩增片段、用接头引物与微卫星锚定引物扩增带有微卫星序列的片段、富积带有微卫星序列的扩增片段、用且s型限制性内切酶酶切产生标签序列(啤)、在3一端加上B sgl接头并扩增、用单酶切(EcoRl)在标签两端产生粘端、连接标签形成串联序列、克隆及测序.,前景计算机自动化,以前寻找SSR的方法是通过构建文库，合成短重复序列分子标记做Southem杂交，然后将SSR两端序列测出来，再设计引物，筛选多态性，将分子标记整合到遗传图谱上.周期长，费用大，所以有必要在以后基因组时代使用基于全基因组的计算机自动化SSR标记筛选方法。因而有必要充分的利用不断增加的基因组序列数据资源。通过这个项目能够建立一整套的SSR分析方法及软件开发的流程，并且绘制出水稻全基因组的遗传图谱。SSR标记与AFLP、RAPD等标记均是以PCR为基础的分子标记，但SSR标记的特殊之处在于其具有针对性的微卫星结构域，不象其他属于随机多态性标记，重复率要受到影响，所以寻找SSR标记的方法也是不一样的。这样就可以在进行SSR在基因组中的分布及其与基因组结构进化关系的研究的同时，得到一套反映等位基因片段多态性极高的SSR标记:从另一个角度，这又为其他特异PCR标记的研究和开发提供了许多借鉴和有价值的参考。SNP具有比SSR更高的多态性，大约高10一100倍，但寻找和研究SNP的技术和方法还在发展之中，一般需要依赖DNA芯片等设备，近阶段还不能象SSR一样在普通实验室中得到应用，也不现实.如果要完整开发、研究SNP，和STS、sCAR、Es