免疫共沉淀原理及注意事项.ppt

免疫共沉淀,（Co-Immunoprecipitation， Co-IP）,单系金,一 实验原理,以（抗体和抗原）之间的专一性作用为基础的用于研究（蛋白质相互作用）的经典方法。是确定两种蛋白质在完整（细胞内生理性）相互作用的有效方法。 如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。,问题：细胞怎样保持生理状态-不变性？,Y-X-抗X,CO-IP应用与IP区别,测定两种目标蛋白质是否在体内结合 确定一种特定蛋白质的新的作用搭档 CO-IP与IP只取决于检测焦点是初级靶分子（抗原）还是次级靶分子（相互作用蛋白）,实验基本原理,1.提取蛋白 2.在细胞裂解液中加入抗X的抗体 3.孵育后再加入Protein A或G(于Agarose bead上) 若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成复合物：“YX抗X抗体Protein A或G“ 3.经变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。（xy抗原、x抗体）,proteinA/G有一个很重要的特性就是能与抗体的Fc段结合,agarose bead 琼脂糖珠,CO-IP原理图解,proteinA/G-琼脂糖珠复合物,Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合。 目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上。,ProteinA/G的作用及具体原理,“捕获”抗体，形成复合物， 抗体-目的蛋白-ProteinA/G beads 非共价健结合 ProteinA/G-garose beads 共价结合 加样缓冲液-煮沸变性-离心 Protein A/G beads EP管（抗体-目的蛋白-少量非特异性吸附蛋白）。,二 CO-IP特征,优点 （1 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态 （2 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响 （3 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物,二 CO-IP特征,局限性 （1 可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用 （2 两种蛋白质的结合可能不是直接结合，有第三者在中间起桥梁作用； （3 必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果。,三 实验流程,提取细胞总蛋白 离心，上清电泳(抗原抗体) 准备PA珠子，PBS洗3遍 PA珠子加入蛋白裂解液（去除非特异性蛋白背景) 离心去PA珠子，取上清 测蛋白浓度 (BCA法) 加一抗反应(4过夜) 加PA珠子捕捉复合物 (室温1h或4过夜) 离心，收集沉淀，预冷RIPA Buffer洗3遍 上样缓冲液悬浮沉淀，加热游离抗原、抗体、珠子 ,四 实验结果分析,SDS-PAGE Western blotting分析 质谱分析检测目的蛋白,SDS-PAGE结果分析,标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。,以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量。,一抗,一抗,一抗(兔抗Actin),曝光后的蛋白条带,二抗 (辣根酶标记的羊抗兔IgG),ECL,X光片曝光显影,ECL 试剂,含有转印蛋白的PVDF膜,+,+,转印膜上蛋白检测示意图,WB结果分析,CO-IP与质谱分析流程,三 实验的关键,1. 实验最需要注意点就是抗体的性质。特别是多抗的特异性是问题。 2. 为防止蛋白的分解、修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。 3. 考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。 4. 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。？,注意的问题：1.裂解液,细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。 不能用高浓度的变性剂（0.2SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。,RIPA裂解液-普利莱基因技术有限公司,100ml RIPA Buffer： 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS.（100元） 说明： 1. 裂解液临用前可新鲜加入最终浓度为1mM的PMSF或其它蛋白酶抑制剂。 2. RIPA裂解液中蛋白样品含有较高浓度的去垢剂，不能用Bradford法但可用BCA法或改良Lowry法测定蛋白浓度,裂解液成分,国内博士： 细胞裂解液： 50mM Tris-HC（lpH7.5）， 150 mM NaCl, 0.5%NP-40, 1mM EDTA 使用前加入PMSF至终浓度1mM、 proteinase inhibitor cocktail（混合物）。 刘岩 BC300 buffer 20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 300mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 10% glycerol（甘油）, 0.2 mM PMSF, 0.2%Tween 20,2.1免疫沉淀中抗体的选择,注意的问题：2.2抗体,使用对照抗体：（阴性和阳性） 阴性：单克隆抗体：同一种属的IgG 兔多克隆抗体：正常兔IgG 阳性：细胞内某种蛋白的抗体（做膜蛋白A，用膜蛋白B）,未检测到目得蛋白或蛋白很少,可能原因 处理方法 1.样品被蛋白酶降解： 添加蛋白酶抑制剂；所有操作保持4以下冰上操作并防止冻融 2.抗体浓度太低：调整抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度 3.抗抗体亲合力太低： 选用适合于IP和/或IB的相应抗体 4.IP抗体未与agarose珠子结合： 选用适合于IP的相应珠子，正确保存防止变质或干燥 5.Tag未暴露在融合蛋白构象的表面：改变tag融合表达部位 6.裂解液严谨度太高： 改用低严谨度裂解液,目得蛋白高背景：,可能原因 处理方法 非特异蛋白结合 在无血清培养液中裂解细胞； 在免疫沉淀前用protein (G/A)珠子预洗， 免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度（高盐或去垢剂） 裂解液严谨度太低 改用高严谨度裂解液 实验仪器或液体被污染 使用洁净的仪器或液体 转移膜上的非特异吸附 戴手套， 用镊子夹取， 不要接触膜转移面,试剂,RIPA