DB33 T 432-2003 畜禽产品质量安全监督抽查检验细则.pdf

77ICS 65.020.01 B 00 备案号：14143- 2003 浙江省地方标准 DB33/T 432- 2003 畜禽产品质量安全监督抽查 检验细则 Test regulation on quality safety supervision of live stack and poultry products 2003- 08- 12 发布 2003- 08- 15 实施 浙江省质量技术监督局 发布 DB33 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册, 即可下载 DB33/T 4322003 2 前 言 为保障人民群众身体健康，全面推进“无公害农产品行动计划” ，保证畜禽产品质量安全， 指导有关检验机构进行畜禽产品质量安全监督抽查检验工作， 特制定本检验细则，作为组织监督 抽查的依据。 本标准所列的检验项目与法律、法规、规章有不一致时，应以法律、法规、规章的规定为 准。 本标准的附录 A、附录 B、附录 C、附录 D、附录 E 为规范性附录。 本标准由浙江省农产品质量安全监督检测协调会议办公室提出。 本标准起草单位：浙江省畜产品质量安全检测中心。 本标准主要起草人：朱聪英、宣士荣、陆春波、周文海、汪刚 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册, 即可下载 DB33/T 4322003 3 畜禽产品质量安全监督抽查检验细则 1 范围范围 本标准规定了畜禽产品的检验项目、检验方法、抽样方法、判定原则及复检。 本标准适用于浙江省境内生产、屠宰或销售的畜、禽产品的质量安全监督抽查。 本标准不适用于经深加工的畜、禽产品质量安全监督抽查。 2 规范性引用文件规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。 凡是注日期的引用文件， 其随后 所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协 议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本 标准。 GB/T 4789.2 食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定 GB/T 4789.4 食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验 GB/T 5009.12 食品中铅的测定方法 GB/T 5009.15 食品中镉的测定方法 GB/T 14931.1 畜禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留测定方法（高效液相色谱法） GB/T 14931.2 畜禽肉中己烯雌酚的测定方法 NY 5029-2001 无公害食品 猪肉 DB33/T 307-2001 可食性动物组织中盐酸克仑特罗残留量的测定方法 DB33/T 309-2001 动物尿液中盐酸克仑特罗残留量的检测方法 3 抽检产品和检验项目抽检产品和检验项目 3.1 猪尿样检验项目见表 1。 表 1 猪尿样检验项目 样品名称 检验项目 要 求 盐酸克仑特罗 不得检出(检出限 0.005 mg/kg) 猪尿样 莱克多巴胺 不得检出(检出限 0.005 mg/kg) 注：检验项目可以根据质量安全现状和管理的需要调整 3.2 畜禽肉类检验项目见表 2。 表 2 畜禽肉类检验项目 样品名称 检验项目 要 求 盐酸克仑特罗（猪肉） 不得检出(检出限 0.01 mg/kg) 金霉素（mg/kg） 0.10（猪肉、羊肉、牛肉） 1（鸡肉） 土霉素（mg/kg） 0.10 氯霉素 不得检出(检出限 0.01 mg/kg) 磺胺类(以磺胺类总量计)（mg/kg） 0.10 猪肉、羊肉、牛肉、 鸡肉、鹅肉、鸭肉、 兔肉 呋喃唑酮 0.1（鸡肉、兔肉） 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册, 即可下载 DB33/T 4322003 4 表 2 （续） 己烯雌酚 不得检出(检出限 0.05 mg/kg) 铅（mg/kg） 0.10 0.50(猪肉、牛肉) 镉（mg/kg） 0.10 沙门氏菌 不得检出 注 1：检验项目可以根据质量安全现状和管理的需要调整 注 2：磺胺类总量指磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺 胺喹恶啉含量之和 3.3 畜禽肝脏检验项目见表 3。 表 3 畜禽肝脏检验项目 样品名称 检验项目 要 求 盐酸克仑特罗（猪肝） 不得检出(检出限 0.01 mg/kg) 磺胺类(以磺胺类总量计)（mg/kg） 0.10 四环素（mg/kg） 0.3 铅（mg/kg） 0.10（猪肝） 镉（mg/kg） 0.10（猪肝） 畜、禽肝脏 沙门氏菌 不得检出（猪肝） 注 1：检验项目可以根据质量安全现状和管理的需要调整 注 2：磺胺类总量指磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺 胺喹恶啉含量之和 3.4 蛋类检验项目见表 4。 表 4 蛋类检验项目 样品名称 检验项目 要 求 土霉素（mg/kg） 0.1 0.2（皮蛋、咸鸭蛋） 呋喃唑酮 0.1（鸡蛋） 磺胺类(以磺胺类总量计)（mg/kg） 0.1（鸡蛋） 铅（mg/kg） 0.1（鸡蛋、咸鸭蛋） 0.5（无铅皮蛋） 2.0（普通皮蛋） 镉（mg/kg） 0.05 大肠菌群(MPN/100g) 100（鸡蛋、咸鸭蛋） 30（皮蛋） 鸡蛋、皮蛋、咸鸭蛋 沙门氏菌 不得检出 注 1：检验项目可以根据质量安全现状和管理的需要调整 注 2：磺胺类总量指磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺 胺喹恶啉含量之和 4 检验方法检验方法 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册, 即可下载 DB33/T 4322003 5 4.1 盐酸克仑特罗 4.1.1 猪尿样中盐酸克仑特罗：按 DB33/T 309-2001 规定检验。 4.1.1.1 按 DB33/T 309-2001 中第一篇的规定筛选。 4.1.1.2 筛选结果为阳性的样品按 DB33/T 307-2001 中第二篇的规定重新检验，结果判定以本次 检验结果为准。 4.1.2 猪肉和肝脏中的盐酸克仑特罗 4.1.2.1 按 DB33/T 307-2001 中第三篇的规定筛选。 4.1.2.2 筛选结果为阳性的样品按 DB33/T 307-2001 中第二篇的规定重新检验，结果判定以本次 检验结果为准。 4.2 莱克多巴胺 4.2.1 按本标准附录 A 中方法 1 筛选。 4.2.1 筛选结果为阳性的样品按本标准附录 A 中方法 1 的规定重新检验，结果判定以本次检验结 果为准。 4.3 土霉素、金霉素、四环素 4.3.1 按本标准附录 B 的规定筛选。 。 4.3.2 筛选结果为不合格的样品按 GB/T 14931.1 的规定重新检验，结果判定以本次检验结果为 准。 4.4 呋喃唑酮 按 NY 5039-2001 中附录 A 规定检验。 4.5 氯霉素 4.5.1 按本标准附录 C 的规定筛选。 。 4.5.2 筛选结果为阳性的样品按 NY 5029-2001 中附录 D 的规定重新检验，结果判定以本次检验 结果为准。 4.6 磺胺类 4.6.1 按本标准附录 E 的规定筛选。 4.6.2 筛选结果为不合格的样品按 NY 5029-2001 中附录 E 的规定重新检验，结果判定以本次检 验结果为准。 4.7 己烯雌酚 4.7.1 按本标准附录 D 的规定筛选。 。 4.7.2 筛选结果为阳性的样品按 GB/T 14931.2 的规定重新检验，结果判定以本次检验结果为准。 4.8 铅 按 GB/T 5009.12 规定检验。 4.9 镉 按 GB/T 5009.15 规定检验。 4.10 大肠菌群 按 GB 4789.3 规定检验。 4.11 沙门氏菌 按 GB 4789.4 规定检验。 5 抽样方法抽样方法 5.1 组批 产地检验以同一养殖场、同一品种、同一批饲养的动物或动物产品为一抽样批次。屠宰、加 工环节的抽样以同群动物或动物产品为一抽样批次。市场抽检以同一产地、同一品种、同一批号 的产品为一批次。 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册, 即可下载 DB33/T 4322003 6 5.2 抽样方法 采取随机多点抽样，样品数量：猪尿样不少于 50ml，肉不少于 1000g，肝脏不少于 500g(鸡 鸭肝脏不少于 6 只完整的肝脏)，蛋类不少于 20 个。混合后平均分成二份。 5.3 注意事项 5.3.1 抽样时抽样人员应认真填写浙江省农产品质量监督检查抽样单 ，样品一式二份，其中 一份用于检验，一份为备样。 抽取的样品应采用干净容器妥善保存，尿样和蛋类应保存于 4条件下，肉和肝样品于-10 以下保存。 5.3.2 抽样后应及时将样品送至相应的检验机构检验。 5.3.3 抽样单位或人员应采取必要的措施，保证送检样品满足检验需要。 6 判定原则判定原则 6.1 药物残留项目盐酸克仑特罗、莱克多巴多胺、土霉素、金霉素、四环素、氯霉素、己烯雌酚 可按本标准规定用酶联免疫法筛选。筛选结果在规定限量范围内的，单项判定为合格，超出规定 范围的，必须按本标准规定的第二种方法重新检验，检验结果仍不合格的，单项判定为不合格； 本法检验结果合格的，则单项判定合格。 6.2 按本标准检验，所有项目均符合标准要求，判定该批样品为合格；有一项或一项以上不符合 标准要求的，判定该批样品不合格。 7 复检复检 检验结果有异议时，可申请复检（微生物指标除外） ，微生物指标不予复检。复检申请向原 检验机构提出。原检验机构应在三个工作日内做出受理或不受理决定。 若受检方对不受理决定仍 有异议的，可由受检单位向农产品质量安全监督检测协调会议办公室提出。不合格结果以检验结 果通知书方式送达受检方。 受检方应在收到不合格通知之日起三日内提出复检申请，逾期不予受 理。 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册, 即可下载 DB33/T 4322003 7 附 录 A （规范性附录） 动物尿样中莱克多巴胺残留量的检测方法 方法 1 酶联免疫色谱法 A.1 原理 利用固相酶联免疫吸附原理，加入尿样及酶标莱克多巴胺抗原（已知抗原）与抗体进行免疫 竞争反应，未反应的酶标物在洗涤中被清除，结合了的酶可以由显色物显示出来。用目测法或酶 标法来判断。显色的强弱与样品中的莱克多巴胺成反比。 A.2 试剂与材料 美国 TCC 莱克多巴胺酶联免疫试剂盒或类似产品。 A.3 仪器与设备 A.3.1 微孔板酶标仪(450nm)。 A.3.2 振荡器。 A.3.3 离心机（0 rpm - 10000rpm） 。 A.3.4 20ul, 50ul, 100ul, 200ul 微量加样器及配套吸头。 A.3.5 冰箱（2- 8） 。 A.3.6 洗板机。 A.4 测定步骤 A.4.1 样品处理 用 PBS 缓冲液以 1：3 稀释尿液样品，4000 转离心 5 分钟，取上清液测定。 A.4.2 使用之前将所有试剂回升至室温 20- 24。 A.4.3 将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架,标准和样品做两个平行实验， 记录下标准和 样品的位置。 A.4.4 加入 50ul 的标准和处理好的样品到各自的微孔中，标准和样品做两个平行实验。 A.4.5 加入 100ul 第一抗体溶液到每一个微孔中底部， 在 37孵育 30 分钟后用工作洗液洗板，最 后用洗水纸洗干。 A.4.6 加入 150 ul 稀释的酶标记的第二抗体 37孵育 30 分钟后用工作洗液洗板，最后用洗水纸 洗干。 A.4.7 加入 100ul 底物液到微孔中，充分混合并在室温孵育 3 分钟- 8 分钟。 A.4.8 加入 50ul 反应终止液到微孔中，混合好在 450nm 处测量吸光度值。 A.5 结果计算 以 0 标准吸光度值为 100%计算，折算出各标准和样品的相对吸光度值。 标准的吸光度值(或样品) 相对吸光度值（%） = - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - x 100 0 标准的吸光度值 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册, 即可下载 DB33/T 4322003 8 计算出的标准相对吸光度值绘成为一个对应浓度(ng/L)的半对数坐标系统曲线图，校正曲线在 200 ng/L - 2000ng/L(ppt)范围内应当成为线性。相对应每一个样品的浓度(ng/L)可以从校正曲线上 读出。 本方法检测限为 500ng/L。 A.6 注意事项 A.6.1 试剂盒应放在 2- 8保存。 A.6.2 为分析人员安全，操作时要戴上医用乳胶手套。 方法二 气相色谱质谱法测定 A.7 原理 动物尿样中总的莱克多巴胺需要通过-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶酶解，本方法仅测定尿 样中游离的莱克多巴胺含量。用乙酸乙酯提取后，提取液蒸发至干，用乙酸乙酯溶解后加到 SPE-SLH 净化柱上，先用乙酸乙酯溶液洗脱除杂，然后用 10%乙醇/乙酸乙酯将莱克多巴胺洗脱， 洗脱液蒸发至干后，用 BSTFA（双三甲基硅基三氟乙酰胺）+1%TMCS（三甲基氯硅烷）衍生，然 后用 GC/MS 法测定 OH NH OH OH 图 A.1 标准莱克多巴胺分子结构式 A.8 试剂 莱克多巴胺标准品（纯度大于 98%） ； 甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氨水、无水硫酸钠等均为分析纯； BSTFA（双三甲基硅基三氟乙酰胺） 、TMCS （三甲基氯硅烷） 。 CLESLH 型 SPE 净化柱或同等效果的净化柱。 莱克多巴胺标准储备溶液（5mg/mL） ：准确称取 50mg 莱克多巴胺于 10 ml 容量瓶中，用甲醇溶 解并定容至刻度，存放在冰箱中备用。使用时稀释到一定浓度。 A.9 仪器设备 色质联用仪 ； 旋转蒸发仪； A.10 试验方法 A.101 样品处理 A.101.1 莱克多巴胺的提取 ：取 10.0mL 动物尿样，加 10 ml 乙酸乙酯，振荡萃取，重复 2 次，有机相过无水硫酸钠在 60水浴中真空蒸发，氮气吹干。 A10.1.2 加 4.0 ml 乙酸乙酯溶解剩余物，移 2mL 到 CLE-SLH 型 SPE 净化柱上，然后用 10mL 乙酸 乙酯淋洗除杂，最后用 10mL10%乙醇/乙酸乙酯（V：V）洗脱，洗脱液在水浴中蒸干，氮气吹干。 A.10.1.3 莱克多巴胺的衍生 蒸发剩余物,加 0.12ml BSTFA+1%TMCS，加盖于旋涡混合器上震荡， 氮气吹干，加 0.2mL 甲苯溶解，在 4000r/min 下离心 10 min。取适量的莱克多巴胺标准溶液， 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册, 即可下载 DB33/T 4322003 9 氮气吹干，同时进行衍生化。取离心后 1.0L 甲苯溶液进行 GC-MS 分析。 A.10.2 检测 A.10.2.1 色谱条件 色谱柱：HP5 MS 5%苯基甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱(30 m0.25 mm0.25m)； 进样口温度 300， 柱温程序：初温 150，保持 3 min，然后以 10min 升至 230，保持 10min，再以 20 min 升至 280保持 10min ； 载气为高纯氦气（99.999%） ，流速 1.0mL/min，不分流进样。 A.10.2.2 质谱条件 EI 源 源温 230； 电子能量 70eV； 接口温度 280； 电子倍增器电压 1506V ； 质量扫描范围 30 U550U； 选择离子监测方式（SIM） ；监测离子（m/z） ：267、250 、179、502。 溶剂延迟：5 min 。 A.10.3 结果计算：结果计算： 定量方法：采用单点或多点校准法定量 。 莱克多巴胺（以莱克多巴胺计）X=m1*D/m 。 X ：尿样中莱克多巴胺含量 ng/ml。 m1：质谱测定对应的莱克多巴胺含量 ng/ml。 m ：取样量 ml。 D ：稀释倍数 。 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册, 即可下载 DB33/T 4322003 10 附 录 B （规范性附录） 可食性动物组织中四环素的检测方法（ELISA 法） B.1 测定原理 测定的基础是抗原抗体反应。微孔板包被有结合到蛋白上的四环素（固相） 。 四环素抗体, 四 环素标准或样品溶液被加入， 游离的四环素与固相四环素竞争四环素抗体，没有连接的四环素抗体在洗涤步骤中被除去。 加入酶标记物（过氧化物酶标记的第二抗体，针对四环素抗体） 。然后在洗涤步骤除去未结合的 酶标记物。将酶基质（过氧化尿素）和发色剂（四甲基联苯胺）加入到孔中并且孵育。结合的酶 标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色。在 450nm 处测量（可选择大于 600nm 的波长作为参比波长） ，吸收光强度与样品中的四环素浓度成反比。 B.2 试剂和材料 B.2.1 四环素酶联免疫试剂盒：德国 R-Biopharm 公司生产或类似产品。 B.2.2 RIDA C18 柱。 B.2.3 甲醇。 B.2.4 Mcllvain-buffer：12.9g Citric acid monohydrate，10.9g Na2HPO4，37.2g EDTA-Sodium salt，调 pH3.8，加蒸馏水至 1000ml。 B.2.5 洗脱液：甲醇含 20mM Oxalic acid （=1.8g/l） 。 B.3 仪器和设备 B.3.1 离心机。 B.3.2 组织均质仪。 B.3.3 酶标仪（含 450nm 滤光片） 。 B.3.4 适宜的微量进样器和吸头。 B.4 样品处理 -5g 粉碎的样品与 25ml Mcllvain-buffer 混合 30 分钟，然后 10 0C 离心 10 分钟 （3500g） ，保存上清液，沉淀物重复提取一次，将两次的提取液合二为一（50ml）用折叠 滤纸过滤。取 5ml 滤液用 RIDA C18 柱按以下步骤纯化： -用 4ml 甲醇(100%)洗涤柱子。 -用 3ml 蒸流水洗涤柱子。 -取 5ml 滤液样品进柱。 -用 3ml 蒸流水洗涤柱子。 -小心的压出所有的液体。 -用 2ml 甲醇/ Oxalic acid 洗脱样品,流速为 15 滴/分钟。 -洗脱液用样品稀释缓冲液以 1：10 稀释，取 50ul 进行分析。 B.5 工作液的准备 B.5.1 标准浓缩液标准浓缩液 制备四环素标准应用液：50ul 标准浓缩液用 450ul 缓冲液 1 稀释并混合均匀，不要用塑料瓶而 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册, 即可下载 DB33/T 4322003 11 用玻璃瓶。 标准液 1：50ul 标准浓缩液 1 用 450ul 缓冲液 1 稀释 0ppt。 标准液 2：50ul 标准浓缩液 2 用 450ul 缓冲液 1 稀释 50ppt。 标准液 3：50ul 标准浓缩液 3 用 450ul 缓冲液 1 稀释 150ppt。 标准液 4：50ul 标准浓缩液 4 用 450ul 缓冲液 1 稀释 450ppt。 标准液 5：50ul 标准浓缩液 5 用 450ul 缓冲液 1 稀释 1350ppt。 标准液 6：50ul 标准浓缩液 6 用 450ul 缓冲液 1 稀释 4050ppt。 B.5.2 洗涤缓冲液，PBS-T（含有土温 20 的磷酸缓冲液盐水） (0.55g NaH2PO4 X H2O+ 2.85g Na2HPO4 X2H2O+9gNaCl + 1ml Tween20, 加入蒸流水至 1000ml)； pH7.2-7.4。 B.6 实验步骤 B.6.1 使用前将试剂盒恢复到室温（约 1 小时） 。 B.6.2 预先进行编号，标记 B0、标准品和样品的位置，推荐进行双孔检测。 B.6.3 加入 50ul 的标准或处理好的样品到各自的微孔中。标准和样品做两个平行实验。 B.6.4 加入 50ul 四环素抗体溶液到每一个微孔底部，在室温孵育 60 分钟，覆盖上薄膜（防止蒸 发） 。 B.6.5 倒出孔中的液体， 将微孔架倒置在吸水纸上拍打(每行拍打 3 次)以保证完全除去孔中的液 体。用 250ul PBS-T 缓冲液充入孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作两遍以上。 B.6.6 加入 100ul 酶标记物到微孔中， 手动充分混合并室温敷育 15 分钟。 B.6.7 倒出孔中的液体， 将微孔架倒置在吸水纸上拍打(每行拍打 3 次)以保证完全除去孔中的液 体。用 250ul PBS-T 缓冲液充入孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作两遍以上。 B.6.8 加入 50ul 基质和 50ul 发色试剂到微孔中，充分混合并在室温暗处孵育 15 分钟。 B.6.9 加入 100ul 反应停止液到微孔中。混合好在 450nm 处测量吸光度值以空气为空白， 必须在 加入停止液后 60 分钟内读取光度值。 B.7 结果计算 以 0 标准吸光度值为 100%计算，折算出各标准和样品的相对吸光度值。 标准的吸光度值(或样品) 相对吸光度值（%） = - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - x 100 0 标准的吸光度值 计算出的标准相对吸光度值绘成为一个对应浓度(ng/L)的半对数坐标系统曲线图，校正曲线 在 150-1350ng/l(ppt)范围内应当成为线性。相对应每一个样品的浓度(ng/l)可以从校正曲线上 读出。 本方法四环素，金霉素的检测下限为 6ng/g，土霉素的检测下限为 60 ng/g。 B.8 注意事项 B.8.1 试剂盒应放在 2-8保存。 B.8.2 为分析人员安全，操作时要戴上医用乳胶手套。 B.8.3 温浴时请避免光线直照，应该用盖子盖住微孔板。 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册, 即可下载 DB33/T 4322003 12 附 录 C （规范性附录） 可食性动物组织中氯霉素的检测方法（ELISA 法） C.1 原理 基本的原理就是抗原-抗体反应。微孔中用羊抗兔 IgG 包被，抗氯霉素抗体、氯霉素的酶标 物、 氯霉素标准品或样本加入后， 4下温浴 2 小时， 清洗去除未结合的酶标物， 加入酶底物 （H2O2） 和显色剂 （TMB） ， 室温下避光温浴 30min， 加入反应中止液会使微孔中的兰色转变为黄色， 在 450nm 处进行吸光度测量，通过计算比例可以获得氯霉素的浓度值。 C.2 试剂和材料 C.2.1 磺胺类药物酶联免疫试剂盒：意大利 Tecna 公司生产或类似产品。 C.2.2 样品抽提液（PBST） 试剂盒没有提供样品抽提液，请按下面的成分配置（1L） ： Na2HPO42H2O 0.96 g KH2PO4 0.17 g NaCl 9 g Tween 20 0.5 ml 蒸馏水 1000 ml C.3 仪器和设备 C.3.1 离心机。 C.3.2 组织均质仪。 C.3.3 酶标仪（含 450nm 滤光片） 。 C.3.4 适宜的微量进样器和吸头。 C.4 样品处理 称取 3g 均质化后的组织样本加入一试管，加 6ml 醋酸乙酯混匀抽提 30min，离心 （2000g,10min）后 6ml 醋酸乙酯转移到另一试管并在氮气中 50蒸干，脂质残留物用 1.5ml 异辛烷/氯仿（2:3；v/v）重新溶解，加 0.75mlPBST 后混匀 30min，离心（2000g,10min） ，注意： 为避免上层液乳化，试管在 80短暂水浴（约 2min）然后离心。取 50ul 上层液体进行检测。 C.5 工作液的准备 C.5.1 标准品溶液 已经备用。 C.5.2 酶标物 本品是浓缩物，酶标物经过稀释以后稳定性降低，因此要根据用量进行稀释。本 浓缩物可以用稀释液稀释 100 倍（即 10ul 酶标物+990ul 稀释液） 。 C.5.3 清洗液 用蒸馏水 10 倍稀释。 C.5.4 稀释液 用蒸馏水 10 倍稀释。 C.5.5 中止液 已经备用。 C.5.6 显色底物溶液 本溶液应该在使用前根据用量由 H2O2和 TMB 等体积混合得到。 C.6 实验步骤 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册, 即可下载 DB33/T 4322003 13 C.6.1 使用前将试剂盒恢复到室温。 C.6.2 预先进行编号，标记 B0、空白、标准品和样品的位置，推荐进行双孔检测。 C.6.3 用可挤压的瓶子将清洗液加满微孔，翻转微孔板倒去液体，如此重复 3 次，在吸水纸上拍 打将微孔中的液体去除。 C.6.4 空白孔加 150ul 稀释液，标准孔加 50ul 标准品溶液，样品孔加 50ul 样品。 C.6.5 所有微孔加 100ul 稀释的酶标物。 C.6.6 除空白孔外，每个微孔加入 100ul 氯霉素抗体溶液。 C.6.7 混匀后在 2-8温浴 2 小时并轻轻晃动微孔板（温浴过程中必须要晃动） 。 C.6.8 温浴完成后清空微孔，并清洗 3 遍（按 A6.3） 。 C.6.9 每个微孔加 150ul 配好的显色底物溶液，混匀后避光室温下温浴 30min。 C.6.10 每个微孔加入 50ul 中止液，混匀后 30min 内在 450nm 检测吸光度。 C.7 结果计算 根据下列公式进行结合率的计算： 标准的吸光度值(或样品)空白孔的吸光度值 -x 100= （B/B0）%吸光度值 零标准的吸光度值空白孔的吸光度值 将标准品的 B/B0值在半对数曲线中作出一标准曲线，纵坐标为结合率（%） ，横坐标为浓度 （ng/ml） 。各样品的结合率通过该曲线都可以定量到一个浓度值。 而要获得样品中氯霉素的 ppb（ng/g）浓度值还需要乘上相应的稀释因子（1:10） 。 本方法检测限为 50ng/ kg。 C.8 注意事项 C.8.1 试剂盒应放在 2-8保存。 C.8.2 为分析人员安全，操作时要戴上医用乳胶手套。 C.8.3 温浴时请避免光线直照，应该用盖子盖住微孔板。 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册, 即可下载 DB33/T 4322003 14 附 录 D （规范性附录） 可食性动物组织中己烯雌酚的检测方法（ELISA 法） D.1 测定原理 分析反应在羊抗兔 IgG 包被的微孔中进行，抗己烯雌酚抗体、己烯雌酚的酶标物、己烯雌 酚标准品或样本加入后，4下温浴过液，清洗去除未结合的酶标物，加入酶标底物（H2O2）和 显色剂（TMB） ，温室下避光温浴 30min，加入反应终止液会使微孔中的兰色变黄色，在 450nm 处 进行吸光度测量，通过计算比例可以获得样本中己烯雌酚的浓度值。 D.2 试剂和材料 D.2.1 己烯雌酚酶联免疫试剂盒：意大利 Tecna 公司生产或类似产品。 D.2.2 醋酸乙酯。 D.2.3 叔丁基甲基醚（Tert-butyl methyl ether） 。 D.3 仪器和设备 D.3.1 离心机。 D.3.2 组织均质仪。 D.3.3 酶标仪（含 450nm 滤光片） 。 D.3.4 适宜的微量进样器和吸头。 D.4 样品处理 -一份肌肉或肝脏切碎与三份水一起均质化 -1g 均质物（相当于 0.25g 肌肉）用 2ml 叔丁基甲基醚（Tert-butyl methyl ether）涡 旋混合提取。 -20，000g 离心 30 分钟，冷冻。 -分离有机液相并蒸干。 -用 1ml 稀释液溶解，涡旋后，用于分析检测（最后的稀释度 1：4） 。 D.5 工作液的准备 D.5.1 标准品溶液 浓度序列如下：0; 0.1; 0.2; 1; 2; 10; 20ng/ml。 D.5.2 已烯雌酚酶标物 本品是浓缩物， 酶标物经过稀释以后稳定性降低， 因此要根据用量进行 稀释。本浓缩物可以用稀释液稀释 100 倍（即 10ul 酶标物+990ul 稀释液） 。 D.5.3 清洗液 清洗液经过 10 倍的浓缩，请用蒸馏水稀释。 D.5.4 稀释液 经过 10 倍的浓缩，请用蒸馏水稀释。 D.5.5 中止液。 D.5.6 已烯雌酚抗体 冻干的抗体用 6ml 稀释液溶解后彻底混匀，使用后请立即在 2-8避光 保存。 D.5.7 显色底物溶液 本溶液应该在使用前根据用量由 H2O2和 TMB 等体积混合。 D.6 实验步骤 D.6.1 使用前将试剂盒恢复到室温（约 1 小时） 。 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册, 即可下载 DB33/T 4322003 15 D.6.2 预先进行编号，标记 B0、空白、标准品和样品的位置，推荐进行双孔检测。 D.6.3 用可挤压的瓶子将清洗液加满微孔，翻转微孔板倒去液体，如此重复 3 次，在吸水纸上拍 打将微孔中的液体去除。 D.6.4 空白孔加 150ul 稀释液，标准孔加 50ul 标准品溶液，样品孔加 50ul 样品。 D.6.5 所有微孔加 100ul 稀释的酶标物。 D.6.6 除空白孔外，每个微孔加入 100ul 已烯雌酚抗体溶液。 D.6.7 混匀后在 2-8温浴过夜。 D.6.8 温浴完成后清空微孔，并清洗 3 遍（按 5.3） 。 D.6.9 每个微孔加 150ul 配好的显色底物溶液，混匀后避光室温下温浴 30min。 D.6.10 每个微孔加入 50ul 中止液，混匀后 30min 内在 450nm 检测吸光度。 D.7 结果计算 根据下列公式进行结合率的计算： 标准的吸光度值(或样品)空白孔的吸光度值 -x 100= （B/B0）%吸光度值 零标准的吸光度值空白孔的吸光度值 将已烯雌酚标准品的 B/B0值在半对数曲线中作出一标准曲线，纵坐标为结合率（%） ，横坐 标为浓度（ng/ml） 。各样品的结合率通过该曲线都可以定量到一个浓度值。 而要获得样品中已烯雌酚的 ng/ml 浓度值还需要乘上相应的稀释因子（1:4） ，这是基于抽提 回收率为 100%的假设。 本方法检测限为 100ng/ kg。 D.8 注意事项 D.8.1 试剂盒应放在 2-8保存。 D.8.2 为分析人员安全，操作时要戴上医用乳胶手套。 D.8.3 温浴时请避免光线直照，应该用盖子盖住微孔板。 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册, 即可下载 DB33/T 4322003 16 附 录 E （规范性附录） 可食性动物组织中磺胺类的检测方法（ELISA 法） E.1 测定原理 分析反应在抗磺胺类药物抗体包被的微