生化工程第五章微生物培养及发酵动力学.ppt

第五章 微生物培养及发酵动力学,内容,1 基本概念 2 微生物反应的物料衡算 3 微生物反应的能量衡算 4 微生物反应动力学,微生物生长的基质,微生物反应的特点,二 微生物反应过程的质量衡算,例题：(选自贾士儒4869页) 1.葡萄糖为基质进行面包酵母（S.cereviseae）培养，培养的反应式可用下式表达，求计量关系中的系数a、b、c、d。 反应式为： C6H12O63O2aNH3 bC6H10 NO3(面包酵母)cH2OdCO2,解：据平衡方程式,可得： C: 6=6b+d H: 12+3a=10b+2c O: 6+6=3b+c+2d N: a=b 方程联立求解为：a=b0.48 c=4.32 d=3.12 上述反应计量关系式为: C6H12O63O20.48NH3 0.48C6H10NO34.32H2O 3.12CO2,练习 1葡萄糖为碳源，NH3为氮源进行酿酒酵母发酵。呼吸商1.04。消耗100mol葡萄糖和48mol NH3生产了48 mol菌体、312 mol CO2和432molH2O。求氧的消耗量和酵母菌体的化学组成。（呼吸商RQCO2 生成速率/O2消耗速率）,第二节 微生物反应过程的得率系数 研究得率系数的意义： 对碳源等物质生成细胞或其他产物的潜力进行定量评价的重要参数。 分为以下几类：,部分菌体得率与产物得率 得率 定义单位 YX/S消耗1g或1mol基质获得的干菌体克数，g/g, g/mol YATP消耗1molATP获得的干菌体克数，g/mol YKJ消耗1KJ热量获得的干菌体克数， g/KJ YX/O消耗1gO2获得的干菌体克数，g/g YX/H 1mol氢受体产生的干菌体克数，g/mol YX/N 消耗1g氮产生的干菌体克数，g/mol YX/NO3-消耗1mol NO3获得的干菌体克数，g/mol YCO2/S消耗1mol基质产生的CO2的摩尔数，mol /mol YCO2/O消耗1mol O2产生的CO2的摩尔数，mol /mol YATP/S消耗1mol基质获得的ATP的摩尔数，mol /mol Yave-消耗1个有效电子获得的干菌体克数，g/ave,细胞得率（生长得率）: YX/S生产细胞的质量g / 消耗基质的质量g X/（-S） 碳元素的细胞得率: YC 细胞生产量细胞含碳量/基质消耗量 基质含碳量 YX/S(Xc/Sc),1葡萄糖为碳源，NH3为氮源进行某细菌的好氧培养。消耗的葡萄糖有2/3的碳源转化为细胞中的碳。反应式为： C6H12O6aO2bNH3 c(C4.4OH7.3N0.86O1. 2)dH2O eCO2 计算上述反应中的得率系数YX/S 和YX/O 解：据平衡方程式,可得： C: 6=4.4ce H: 12+3b=7.3c+2d O: 6+2a=2.2c+d +2e N: b=0.86c 由于1mol葡萄糖中含碳72g, 转化为细胞内的碳为722/3=48(g) 故：（4.412）c=48 得： c= 0.91,转化为CO2的碳为724824（g） 故： 12e=24 e=2 解平衡方程中其他未知数，得： b=0.78; d=3.85; a=1.47 故平衡方程为： C6H12O61.47O20.78NH3 0.91(C4.4OH7.3N0.86O1.2)3.85H2O2CO2 YX/S0.91（124.4167.3140.86161.2）/ 1800.46(g/g)(以细胞/葡萄糖计) YX/O83.1/（1.4732）1.77(g/g)(以细胞/氧计),第三节 微生物反应过程的能量衡算 微生物反应是放热过程。 微生物利用碳源，通过呼吸（有氧）或发酵（无氧）将能量转化为ATP，供微生物生长、代谢，其余能量作为热量排出，进行微生物优化培养时，必须进行适宜的温度控制。 从反应热的角度考虑反应过程中的能量代谢，进行能量衡算。,一 菌体得率 1YKJ ：微生物对能量的利用(消耗1KJ热量获得的干菌体克数， g/KJ) YKJ X (细胞生产量) Ea(细胞贮存自由能)+Eb(分解代谢释放自由能) (-Ha)(X)+(-Hc) Ha :菌体X的燃烧热为基准的焓变，因菌体不同，一般 取值Ha22.15kJ/g Hc :所消耗基质的焓变与代谢产物焓变之差， Hc (-Hs)(-S)- (-Hp)( P) (-H0*)(-O2) Hs :碳源氧化的焓变，kJ/mol； Hp :产物氧化的焓变，kJ/mol； H0*:为呼吸反应焓变444 kJ/mol-O2,故总表达式可写为： YKJ X (-Ha)(X)+ (-Hs)(-S)- (-Hp)( P) Yx/s (-Ha) Yx/s + (-Hs) - (-Hp) Yp/s,干酪乳杆菌在蛋白胨、牛肉膏为主要成分的复合培养基 中，分别以葡萄糖、甘露醇为能源进行培养，计算YKJ 由化工手册查知： H葡萄糖2816 kJ/mol，H乙酸870 kJ/mol， H乙醇1368 kJ/mol， H甲醇264 kJ/mol，H乳酸1363 kJ/mol， H甘露醇3038 kJ/mol， Ha22.15 kJ/mol,解：以葡萄糖为能源时， YKJ Yx/s (-Ha) Yx/s + (-Hs) - (-Hp) Yp/s 其中: (-Hp) Yp/s13630.05 8701.05 13680.94 2641.76 2732（kJ/mol） YKJ 62.0 22.1562.0 + 2816 - 2732 0.043 （g/kJ） 以甘露醇为能源时, (-Hp) Yp/s13630.4 8700.22 13681.29 2641.6 2925（kJ/mol） YKJ 40.5 22.1540.5 + 3038 - 2925 0.041 （g/kJ）,2 反应热（代谢热或发酵热） Hh 基质燃烧热菌体燃烧热产物燃烧热 = HsS- HxX -HpP 例题： 葡萄糖为惟一碳源进行酵母培养。反应式为： 1.11C6H12O62.10O2 C.3. 92 H6. 5O 1. 943.42H2O 2.75CO2 求（1）Yx/s; (2) 生成1kg细胞量时的Hh。已知酵母细胞和葡萄糖的燃烧热分别为1.50104kJ/kg和1.59104kJ/kg。,解： Yx/s酵母细胞分子质量/1.11葡萄糖分子质量 3.92126.51.9416 / 1.11180 84.58/199.8 0.42（kg/kg） 生成1kg酵母细胞需要葡萄糖1/0.42=2.38(kg) Hh HsS- HxX 1.591042.381.501041 2.25104（kJ）,2.分别采用含有蛋白胨和牛肉膏的复合培养基、含有多种氨基酸合成培养基和基本培养基进行单胞菌的厌氧培养。碳源为葡萄糖，获得如下结果(下表)。已知菌体的含碳量（以碳源/细胞计）为0.45g/g ,求采用不同培养基时的YkJ. 化工手册可知H葡萄糖2816kJ/mol, H乙醇1368kJ/mol, H乳酸1363kJ/mol, Ha22.15kJ/mol.,一 发酵动力学研究内容： 研究细胞生长速度与产物生成速 度的关系及环境条件对速度的影响。 二 发酵过程的反应描述：,X S（底物） X（菌体） P（产物）,发酵反应动力学的研究内容,研究反应速度及其影响因素并建立反应速度与影响因素的关联,反应动力学模型,反应器特性,+,反应器的操作模型,操作条件与反应结果的关系，定量地在线控制反应过程,调整期,对数期,稳定期,衰亡期,二 微生物生长曲线,第一节 微生物生长动力学的基本概念,一、微生物在一个密闭系统中的生长情况：,时间,菌体浓度,延迟期,指数生长期,减速期,静止期,衰亡期,延迟期：,指数生长期:,倍增时间：td,静止期： ;,衰亡期:,一 指数生长方程 dX/dt = （ ）X X为微生物的菌体浓度，单位体积内干细胞质量（g/L）； 比生长速率，每单位细胞浓度的生长速率(1/min;1/h)； 为细胞自溶或内源代谢速率，其导致细胞量的损失. 在 指数生长期，,故上式可改写为： dX/dt = X， 积分变形为： ln (X/X0) =t 或 t = ln (X/X0) / 或 X=X0 et,第二节 微生物生长动力学,注： 1）一般情况下，在微生物生长的各阶段，细胞增值规律均符合指数生长定律，但值随时间变化； 2）在指数生长期，值达最大m ，且保持稳定；其他生长期， 值随时间变化。 3）表示微生物生长快慢的另一方法： 倍增时间td：菌体细胞质量增加一倍所需的时间 td =0.693/,例： 以乙醇为碳源进行产气杆菌培养，菌体初始浓度X0=0.1kg/m3,培养至3.2h,菌体浓度为8.44kg/m3 ，若不考虑延迟期，而且一定，求td,二 Monod方程 随温度、pH、基质浓度、产物浓度、溶氧等条件而变化. f(s,p,T,pH,) Monod发现：在一定条件下(基质限制) f(S) 经验公式：m S/ (Ks + S),：菌体的生长比速（1/h） S：限制性基质浓度（g/L） Ks：饱和常数(相当于1/2m时的限制性基质浓度, g/L ) max: 最大生长比速（1/h）,：菌体的生长比速 S：限制性基质浓度 Ks：饱和常数(相当于1/2m时 的限制性基质浓度, g/L ) max: 最大生长比速（1/h）,S Ks时，S直线关系 S Ks 时，m， Ks与m反映了微生物的特征：基质 Ks反映微生物对基质的亲和力：Ks小，亲和力大,Monod方程的参数求解(双倒数法)： Ks与m,将Monod方程取倒数可得：,或：,这样通过测定不同限制性基质浓度下，微生物的比生长速度，就可以通过回归分析计算出Monod方程的两个参数。,例：在一定条件下培养大肠杆菌，得如下数据：,S(mg/l) 6 33 64 153 221 (h-1) 0.06 0.24 0.43 0.66 0.70,求在该培养条件下，求大肠杆菌的max，Ks和td?,解：将数据整理：,S/ 100 137.5 192.5 231.8 311.3 S 6 33 64 153 221,max，1.11 (h-1); Ks97.6 mg/L,tdln2/ max0.64 h,第三节 产物形成动力学,一、初级代谢产物和次级代谢产物,次级代谢产物：还有一类产物，对细胞的代谢功能没有明显 的影响，一般是在稳定期形成，如抗生素等 这一类化合物称为次级代谢产物。,初级代谢产物：微生物合成的主要供给细胞生长的一类物质。 如氨基酸、核苷酸等等，这些物质称为初级 代谢产物。,二、发酵动力学类型（产物形成和菌体生长关系）：,一类发酵偶联型 产物的形成和菌体的生长相偶联,x,p,t,二类发酵混合型 产物的形成和菌体的生长部分偶联,x,p,t,三类发酵非偶联型 产物的形成和菌体的生长非偶联,x,p,t,浓 度,三 在分批发酵过程中，微生物生长、产物形成均与基质利用 有关，因此可建立平衡方程： 微生物生长：细胞积累生长 dX/dt = X 产物形成：产物积累产物合成 dP/dt = X Yp/x = qpX 基质利用：基质积累生长消耗产物消耗维持 dS/dt =X/Yx/sqpX / Yp/s mX = qs X qpX / Yp/s mX 比速率（、qp、qs）：单位时间内单位细胞浓度所引起的细胞生长或产物形成或底物消耗的量。（g /g细胞.h） 生长得率Yx/s ；产物得率 Yp/s,四. 生产得率系数和产物得率系数 1. 生产得率系数： Yx/s表示每消耗1mol的基质所形成的菌体质量（g） Yx/s X/SX-X0/S0-S Yx/o2 表示每消耗1mol的O2所形成的菌体质量（g） Yx/s X/O2 Yx/ATP 表示每消耗1mol的ATP所形成的菌体质量（g） Yx/s X/ATP 2. 产物得率系数： Yp/s表示每消耗1mol的基质所生成的产物质量（g） Yp/s P/SP-P0/S0-S,五. 分批培养的生产率 1.分批培养的生产率（Productivity）： 生产率P=细胞或产物浓度（g/ L）/发酵时间t(h） 其中：发酵时间t = 1/m ln Xf/X0 + tc + tf + tl tc 为放罐清洗时间； tf 为装料消毒时间； tl为生长停滞时间。 X0 、Xf 分别为细胞最初与最终浓度。 若令: tc + tf + tltL 则： P （Xf X0 ） m /ln（Xf /X0）+m tL,1. 在5m3的培养液中按5%接种量接种，原接种液含菌5106（个/mL），求菌含量为4109（个/mL）的培养时间。（假定培养期间均SKs, m=0.8 h1） 2. 采用合成培养基，在1m3的反应器中对大肠杆菌进行分批培养，菌体生长可用Monod方程描述。已知m=0.935 h1，Ks=0.71 kg/m3,基质初始浓度S=50 kg/m3，菌体初始浓度X0=0.1 kg/m3,菌体得率YX/S=0.6kg/kg(细胞/基质)。问:当80基质已消耗所需时间。 3.以甘油为基质进行阴沟气杆菌分批培养。时间t=0，X0=0.1g/L, S0=50g/L.，菌体生长可用Monod方程描述，m=0.85 h1，Ks=1.23102g/L，YX/S=0.6kg/kg(细胞/葡萄糖)。 不考虑诱导期和死亡期，求培养6h后的菌体浓度及底物浓度。,第三节 连续培养及其动力学 连续培养（cintinuous culture）有称连续发酵，以一定速度向发酵罐注入新鲜培养基，同时以同速排出培养液。使罐内液量维持恒定，使培养物在恒定状态下生长的培养方法。 连续培养与分批培养的区别：维持恒定状态环境条件如基质浓度S、产物浓度P、细胞浓度X、比生长速率、pH等始终维持不变 维持恒定状态目的：稳定高效的培养微生物或产生大量代谢产物。,一 单罐连续发酵的前提和假设： 稳定状态下物料平衡，参数变化为零：dX/dt=0, dS/dt=0, dP/dt=0； 培养基混合均匀，菌体、基质、含氧等均匀一； 微生物无死亡（比死亡速率0）,单罐连续培养,流入速度=流出速度=F,反应器内(V)全混流溶质浓度处处相等,连续反应器：,二 单罐连续发酵的动力学 通过连续培养的物料衡算来推导其动力学方程： 微生物细胞的物料平衡： 积累细胞（进入流出）细胞（生长死亡）细胞 dX/dt = F（X0X）/V()X 由于流入细胞浓度X00，0，故简化为: dX/dt = FX / VX（F/ V）X 稳定态下: dX/dt =0 则：F/ V,连续培养中，稀释率（dilution rate）D = F/V, 故：D D (1/h)：单位时间内新进入的培养液体积（F）占罐内培养液总体积(V)的分数。 1/D (h)：培养液在罐内的平均停留时间，可用t表示 注： D =F/V，可通过改变F（流加速率）调节值： D0, 微生物浓度将随时间而增加； D, 则dX/dt 0, 微生物浓度将随培养物被洗出（wash out）而减少； D, 则dX/dt 0，微生物浓度不随时间而变化，处于恒态 连续培养稳定状态,限制性底物的物料平衡： 底物积累（进入流出）底物（生长形成 产物维持代谢）底物 dS/dt = F（S0S）/V（X/Yx/sqpX/Yp/smX） 由于mXX/Yx/s，产物形成的需求（qpX/YP/s）忽略时，该式简化为： dS/dt = F（S0S）/VX/Yx/s 稳定态下 dX/dt =0 则：D（S0S）=X/Yx/s 当稳定态D=时，XYx/s（S0S） （1）,其中： S0，S流入和流出的营养底物的浓度（g/L）； F培养液体积流量（L/h）； V反应器容积(L)； m维持系数（g基质/g细胞.h）； 比生长速率（h1）； Yx/s以消耗基质为基准的细胞得率 （g细胞/g基质）； Yp/s以消耗基质为基准的产物生成率 （g产物/g基质）,3）细胞浓度与稀释率的关系 据Monod方程: m S/ (Ks + S) 当稳定态D=时, D Dc S /(Ks + S) Dc:临界稀释速率（Dc=m）,代表能运行的最大稀释 速率。 一般情况下DDc；DDc, 则菌体将被洗出 上式变形为： SDKs / (m - D) (2) (1),(2)合并：XYx/sS0DKs / (m - D) （3）,注： 连续培养的稳定状态下，Yx/s、S0、Ks及m均定值，故菌种浓度X、底物浓度取决于稀释率D。 连续培养的稳定状态下，X、S0、D为主要变量，其他属于因变量。但当D发生改变，均会造成X、S、的变化。 菌种浓度X、基质浓度S、细胞产率P及稀释率D 的变化关系如图：,菌种浓度X与稀释率D的关系： 随D增加，X逐渐减少，起初 不明显，当D渐接近Dcm， X急跌至0，微生物全部洗出。 基质浓度S与稀释率D的关系： S变化与X相反：一般当D0.8 时,S很小；随D再增大，S急剧 上升，当D渐接近Dcm时， SS0。 细胞产率P=DX与稀释率D的关 系： 随D的增加P逐步增大，可达最 大DX值（DmXm），Dm为理论上 的最适宜稀释速率。,菌种浓度X、基质浓度S、细胞产率P及稀释率D的关系 Dc为临界稀释速率； Dm为理论上的最适宜稀释速率。,三 连续发酵与分批发酵生产率的比较 1分批培养的生产率 P分=(Xf X0) / 1/m* ln(Xf / X0) + tL 2连续发酵的生产强度P连为稀释率D与菌体浓度X 之积 P连DXD Yx/sS0DKs / (m - D) 3连续培养与分批培养之比： P连/P分=