蛋白酪氨酸磷酸酶1B的缺陷抵抗TGF-β在肝细胞中引起的抑制作用.ppt

蛋白酪氨酸磷酸酶1B的缺陷抵抗TGF-在肝细胞中引起的抑制作 用,2110430 何顺漪,目的 研究PTP1B在对TGF-进行细胞应答过程中的作用 意义 对研究磷酸酶在TGF-信号通路中的作用开拓了新思路,简 介 实验相关技术 实验过程及结果 结 论,内容,简 介,在肝脏中，转化生长因子(TGF-）是一种重要的调节细胞因子。它在调节肝细胞的增殖和死亡过程中发挥重要作用。然而，TGF-也可调节形成肿瘤的过程，例如，上皮细胞向间叶细胞的转变，此过程可导致细胞迁移、生存、细胞入侵，免疫调节或微环境的调节。,TGF-最终的作用是通过生存信号的活化而被调节，这些信号依赖于不同的蛋白激酶，例如，表皮生长因子受体（EGFR）或Ras/ERK途径。这些激酶通常是通过蛋白磷酸酶将其磷酸化来调节。在这些酶中，蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）是无受体PTP中能广泛表达的一员，主要位于有细胞内膜的细胞器中，如内质网。它的缺乏可抵抗由不同刺激物引起的细胞死亡 。,TGF-信号途径中涉及到的酶,活性氧组分（ROS）,NADPH氧化酶(NOX),PTP1B,NF-B,TGF-,NOX1,实验方法,1、细胞培养 -DEME 2、细胞数量分析-crystal violet staining 3、细胞周期的分析-flow cytometry 4、细胞增殖的测量-3H-thymidine 5、细胞内氧化还原状态的测量氧化作用敏感的荧光探针 6、分析凋亡的细胞核,实验方法,7、caspase-3 活性的分析 8、基因表达的分析semiquantitative PCR Real Time PCR 9、蛋白印迹 10、免疫细胞化学研究 11、沉默实验分析-siRNA,real-time quantitative PCR,指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。 应用： 1. DNA 或RNA 的绝对定量分析：包括病原微生物或病毒含量的检测, 转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等 。 2. 基因表达差异分析：例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等 )，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA 芯片或差显结果的确证 。 3. 基因分型：例如SNP 检测，甲基化检测等 。,常 用 方 法,SYBR green: 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 Taqman Probe: PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。,为了研究PTP1B在TGF-信号途径中的作用，首先比较野生型和缺陷型细胞中几种激酶的基本活性。,对照,ERK：细胞外调节蛋白激酶，将信号从表面受体传至核内，参与细胞增殖分化、细胞凋亡等。 AKT：是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞存活和凋亡中起重要作用。,结果：缺陷型细胞的ERK和AKT 磷酸化水平较高,野生型和缺陷型细胞对TGF-应答进行比较,结晶紫染色,结果：经36h处理后，野生型细胞数量减少， 缺陷型细胞数量没有变化,据报道，经TGF-处理后细胞数量减少是由于细胞凋亡和生长抑制的组合效应，所以测定它在应答细胞因子过程中的作用。,结果：野生型细胞中TGF- 能够抑制EGF诱导的DNA合成。,EGF：表皮生长因子,测定caspase3的活性，研究细胞凋亡情况。,小结： 缺陷型肝细胞 能够抵制TGF- 的抑制作用， 如：生长抑制 细胞凋亡。,考虑到PTP1B缺乏的肝细 胞能够抵制TGF-的作用， 对参与细胞因子信号传导 过程的分子进行研究。,首先，证明这些肝细胞能够表达所有参与TGF- 介导的信号传导过程的蛋白，如，受体，smad蛋白。,对照,RT-PCR,检测smad2和smad3磷酸化水平,total,Nuclear extracts,结果：缺陷型细胞中 两者均减少。,结果：磷酸化的Smads转移至核中的量减少。,DAPI染色,染色原理： 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用与荧光显微镜观测。因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。,寻找在抵制TGF-信号过程中起作用的蛋白激酶，将细胞与不同蛋白激酶抑制剂共孵育：,PD98095,LY294002,PP2,ERK1/2,PI3K/AKT,SRC,结果：不能使缺陷型细胞对TGF-敏感。,发现： 当一种酪氨酸蛋白激酶抑制剂，gentistein, 加到培养基中时，表现出对TGF-产生应答。,PTP1B缺陷型,结果：genistein能够抑制AKT和 ERK的磷酸化。,T+Gen使细胞数量降低，并伴随caspase-3活性增高。 Smad2/3磷酸化水平增高。,结果：TGF-的抵制作用与smad2/3的磷酸化降低有关，但可在酪氨酸蛋白激酶存在下恢复。,相关报道认为，NF-B在TGF-信号途径中起作用。将p65亚基转移至核中作为NF-B激活的标志。,结果：缺陷型细胞中 p65核转移增加。,为了研究NF-B途径在缺陷型细胞中对TGF-的抵制作用，用siRNA定向沉默p65。,P65的沉默使两种细胞对TGF-作用都敏感。,P-Smad2/3增加，smad7下降。,核中P-smad2/3 显著增加。,然而，在野生型细胞中，Smads磷酸化水平没有受到p65沉默的影响。说明，在PTP1B缺陷型细胞中，当TGF- 存在时，NF-B活性增加会抵制TGF-的作用。,NOX酶产生的ROS产物是TGF-诱导的细胞凋亡过程中重要的调节因子。 此外，先前已提出在应答TGF-过程中，NF-B与NADPH的关系。 由于这些原因，研究它们在PTP1B缺陷细胞对TGF-的作用是否有影响。,分别测量NOX1和NOX4表达量,下降,上升,缺陷型细胞中，经TGF-处理后，NOX酶表达量不平衡。,NOX1表达下降,缺陷型细胞中以NOX1为目标的沉默实验,表达量下降,凋亡的细胞核增加,P65核转移减少,smad2磷酸化增加,smad7减少,以上结果表明，NOX1活化上调NF-B的活性。然而，当p65被沉默时NOX1表达水平下降说明存在一种依赖于NF-B的NOX1表达的正反馈环。,讨 论,TGF-在肝脏病理生理学中起到双重作用：抑制和促进肿瘤的生长。 PTP1B的缺乏抵制TGF-的抑制作用，并且与ERK和AKT磷酸化水平升高有关。 经TGF-处理后，在缺陷型细胞中，smad2&3的磷酸化水平下降。 PTP1B缺乏时，由激酶引发的TGF-抑制作用的损害不能通过简单的抑制几种酶来克服，而当一种酪氨酸蛋白激酶抑制剂存在时，可以观察到细胞凋亡。,TGF-不仅诱导凋亡前信号也诱导生存前信号，而且这些信号是依赖于NF-B活性。 P65沉默实验证明了NF-B对TGF-信号途径有抑制作用。 NOX1被TGF-调节似乎与Smads无关，但与NF-B有关。 NOX1