食品中真菌毒素的分布及其检测.ppt

2019/7/17,1,食品中真菌毒素的分布及其检测方法研究进展,上海市药品检验所中药室 郑 荣,2019/7/17,2,真菌毒素简介（种类，产生，危害，限度，检测方法等） 几种真菌毒素（黄曲霉素，赭曲霉素，呕吐毒素，伏马毒素，玉米赤烯酶酮，T-2毒素）,2019/7/17,3,真菌毒素的种类,真菌毒素（Mycotoxin），也称霉菌毒素，是真菌产生的次级代谢产物。 已知有200多种不同的真菌毒素，一般同时具有毒性强和污染频率高的特点。 其中包括黄曲霉毒素B1和M1（Aflatoxins，FB1、FM1）； 赭（棕）曲霉毒素A（Ochratoxin A，OA）； 脱氧雪腐镰刀菌烯醇（呕吐毒素）（Deoxynivalenol,DON）； 玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN(F-2)）； T-2毒素（T-2 toxin,T-2）； 伏马霉素； 展青霉素（棒曲霉毒素）（Patulin,PTL）； 杂色（柄）曲霉毒素（terigmatocystin）；串珠镰刀菌素（Moniliformin,MF）三硝基丙酸；二乙酰镳草镰刀菌烯醇（Diacetoxyscirpenol DAS）、麦角碱、黄米毒素、岛青霉毒素、橘青霉素、皱褶青霉素、黄绿青霉素、红矢精、黄绿素、圆弧青霉偶氮酸和F-2毒素等。,2019/7/17,4,产生真菌毒素的霉菌,曲霉属（Aspergillus Link）：黄曲霉（A. flavus）、寄生曲霉（A. parasiticus）、赭曲霉（A. ochraceus）、杂色曲霉（A. flavus）、烟曲霉（A. flumigatus）、构巢曲霉（A. nidulans）和棒曲霉（A. clavus）等。 青霉属（Penicillium Link ex Fr）：岛青霉（P. islandicum）、橘青霉（P. citrinum）、红色青霉（P. rubrum）、展青霉（P. patulum）和黄绿青霉（P. citreo-vinide）等。 镰刀菌属（Fusarium Link ex Fr）：禾谷镰刀菌（F. graminearun）、串珠镰刀菌（F. moniliforme）、木贼镰刀菌（F. equiseti）、茄病镰刀菌（F. solani）、三线镰刀菌（F. tritinctum）和镳草镰刀菌（F. sporotrichioides）等。,2019/7/17,5,真菌毒素的危害 经济危害,由于真菌的寄生和真菌毒素的产生，严重影响农作物的产量，降低农产品和饲料品质，造成巨大经济损失。全世界每年由于霉变污染真菌毒素引起的农产品和工业原料的损失达数百亿美元。 在我国北纬31线以南地区采集的玉米、花生、花生油样品的阳性检出率为22.968.1%，每年使粮食减产37。1973年，小麦赤霉病大流行，穗发病率50以上，产量损失1040。据调查，除粮食、饲料以外，在油料作物种子、水果、干果、蔬菜、调味品、烟草、麻类、乳和乳制品、鱼虾、肉类、发酵产品等都发现了不同程度的真菌毒素污染。,2019/7/17,6,常见的真菌毒素,2019/7/17,7,真菌毒素的危害 健康危害,根据真菌毒素作用的靶器官或者真菌毒素引起的病理现象，可将真菌毒素分为肝脏毒、肾脏毒、神经毒、震颤毒等。人或动物摄入被真菌毒素污染的农、畜产品，或通过吸入及皮肤接触真菌毒素可引发多种中毒症状。如致幻，催吐，出血症，皮炎，中枢神经受损，甚至死亡。 动物试验和流行病学的调查结果还证实，许多真菌毒素还可在体内积累后产生致癌、致畸、致突变、类激素中毒，白细胞缺乏症等，对机体造成永久性损害。 某些癌症以及克山病等都与真菌毒素中毒有关。,2019/7/17,8,1973年，湖北省黄岗、天门等10县发生赤霉病麦中毒3000余人，安徽省也有200余人中毒。 1991年安徽、河南部分地区因特大洪涝灾害造成粮食霉变而在灾区农民中引起较大范围的真菌毒素中毒，一些地区的发病率超过70% 自1972年至1987年，我国北方地区13个省发生食用变质甘蔗中毒病案825例，死亡78人，其中河北乐亭一次中毒死亡8人，而且相当比例的重病人遗留终生残疾 1989年5月在内蒙古哲里木盟扎鲁特旗，由于居民食用玉米赤霉烯酮污染的荞麦造成乳腺病暴发，累计发病103例，患病率14.49。 在消化道癌高发区的河南林县，经流行病学调查发现，人们摄食中的DON、T-2毒素等含量与食管癌，贲门癌的发病率呈正相关,2019/7/17,9,已知的与人体有关的主要真菌毒素中毒症,2019/7/17,10,真菌毒素的限量规定,非洲：15 个国家制订了限量规定 (占59 % ) 亚洲和大洋洲：26 个国家制订了限量规定 (占89 % ) 拉丁美洲：19 个国家制订了限量规定 (占92 % ) 北美：2个国家 (100 % ) 加拿大: 伏马毒素、麦角碱 美国: fumonisins (B1+B2+B3) 欧盟：已执行 : 食品和饲料中的aflatoxin、ochratoxin A； 苹果中的 patulin 提议 :小麦和谷物中的DON,2019/7/17,11,真菌毒素常用检测技术,2019/7/17,12,由于真菌毒素对人体的危害，因此其快速检测方法迅速得到发展，特别是生物化学方法，如亲和色谱法和酶联免疫吸附测定法。 在进行真菌毒素的检测时，大部分的毒素标准不仅很毒，而且非常难以得到，所以无毒素标准的方法适应了这种需求，如黄曲霉毒素荧光仪的使用。 由于毒素的分析属于痕量分析，因此在仲裁中最终必须通过气相或液相色谱方法进行准确定量 各国就此设置了一系列的技术壁垒，需要快速，准确，高效的方法,目前国际通用的方法为免疫亲和柱后衍生高效液相色谱法,2019/7/17,13,Aflatoxin黄曲霉毒素,由黄曲霉和寄生曲霉产生 五种主要的黄曲霉毒素: B1, B2, G1, G2 和M1 ；其中B1被认为是主要的有毒物质， M1为代谢产物 黄曲霉毒素B1主要存在于农产品，动物饲料，中药等产品中；黄曲霉毒素M1是动物摄入黄曲霉毒素B1后在体内经羟基化代谢的产物，一部分从尿和乳汁排出，一部分存在于动物的可食部分，如乳、肝、蛋类、肾、血和肌肉中，其中以乳最为常见。 黄曲霉毒素M1的毒性和致癌性与黄曲霉毒素B1的基本相似。由于牛乳及其制品是人类、特别是婴儿的主要食品，所以其危害性更大。 国际肿瘤研究机构定为一级致癌物,2019/7/17,14,黄曲霉毒素的化学性质,黄曲霉毒素的基本结构为二呋喃环和香豆素，在紫外线下，黄曲霉毒素B1、B2发兰色荧光，黄曲霉毒素G1、G2发绿色荧光。黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1在体内经过羟化而衍生成的代谢产物。 黄曲霉毒素的分子量为312-346。难溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中。一般在中性及酸性溶液中较稳定，在强酸性溶液中稍有分解，在pH 9-10的强碱溶液中分解迅速。其纯品为无色结晶，耐高温，黄曲霉毒素B1的分解温度为268 ，因此，一般的加热煎煮无法除去，紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性。,2019/7/17,15,黄曲霉毒素对人体的危害,引起急、慢性中毒：黄曲霉毒素是剧毒物质，其毒性相当于氰化钾的10倍，砒霜的68倍。黄曲霉毒素属肝脏毒，除抑制DNA、RNA的合成外，也抑制肝脏蛋白质的合成，黄曲霉毒索引起人类的急性中毒事件，国内外均有许多报导，最典型的是印度的霉变玉米事件，该事件直接导致了数十人丧生，数百人患上不同类型的肝脏疾病。 致癌性：黄曲霉毒素有极强的致癌性，长期摄入黄曲霉毒素会诱发肝癌。它诱发肝癌的能力比二甲基亚硝胺大75倍，1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为I类致癌物，是目前公认的致癌性最强的物质之一。另据世界卫生组织报导，黄曲霉毒素含量在3050ug/kg时为低毒，50100ug/kg时为中毒，1001000ug/kg时为高毒，1000ug/kg以上为极毒。,2019/7/17,16,黄曲霉毒素在各国商品中的存在情况 (1),2019/7/17,17,黄曲霉毒素在各国商品中的存在情况 (2),2019/7/17,18,中国及国际上对黄曲霉毒素的检测标准,2019/7/17,19,黄曲霉毒素检测方法（1） 传统检测方法,黄曲霉毒素分析一般采用薄层色谱法(TLC）、高效液相色谱法（HPLC）和酶联吸附免疫法（ELISA）。 TLC虽然简便，但灵敏度差；HPLC虽然灵敏度高，但样品处理烦琐，操作复杂，仪器昂贵。ELISA重复性差、试剂寿命短需要低温保存。此外，这些方法都具有如下共同的不足之处：（1）在操作过程中，需要使用剧毒的真菌毒素作为标定标准物，对操作人员造成巨大的沾污危险。（2）在对样品进行预处理过程中，需要使用多种有毒、异味的有机溶剂，不仅毒害操作人员，而且污染环境。（3）操作过程烦琐、时间长，劳动强度大。（4）仪器设备复杂、笨重，难以实现现场快速分析。（5）灵敏度较差，无法满足欧盟等国的标准要求。,2019/7/17,20,黄曲霉毒素检测方法（2） 免疫亲和高效液相色谱法,分析速度快 灵敏度高，测定范围宽（0.1-300ppb），用荧光计法检测可以测定0.1ppb的黄曲霉毒素M1,用HPLC检测可以测定10ppt的黄曲霉毒素M1。 采用单克隆抗体免疫技术，可以特效性地将黄曲霉毒素或其它真菌毒素分离出来，分离效率和回收率高，正确性和可靠性强。 利用同一台仪器和相似的分析方法，还可以检测赭曲毒素、伏马毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON或称呕吐毒素）和T-2毒素。,2019/7/17,21,我室黄曲霉素检测方法,采用甲醇-水系统提取,提取液经过滤、稀释 滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化 用水将免疫亲和层析柱上的杂质除去，以甲醇将黄曲霉毒素洗脱下来 洗脱液定容后通过带荧光检测器的高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生测定含量。,2019/7/17,22,黄曲霉素G2、G1、B2和B1的高效液相色谱图,2019/7/17,23,黄曲霉素G2、G1、B2、 B1定性检测限为0.9、1.5、0.9和1.5pg，定量检测限为2.25、7.5、2.25和7.5pg。,检测限,回收率试验,满足50120的要求（随样品基质，添加水平等因素而变化）,2019/7/17,24,赭曲霉毒素的化学性质,赭曲霉毒素包括A、B、C等7种结构类似的化合物，其中以赭曲霉毒素A毒性最大，也称之为棕曲霉毒素。 赭曲霉毒素A是稳定的无色结晶化合物，溶于极性溶剂和稀碳酸氢钠溶液，微溶于水。将赭曲霉毒素A的乙醇溶液贮于冰箱中一年以上也无损失，但应避光保存，如接触紫外线，几天就会分解。,2019/7/17,25,赭曲霉毒素的产生,产生赭曲霉毒素A 的曲霉属主要是淡褐色曲霉属 （A.alutaceus）、硫磺色曲霉属 （A.Sulphureus），菌核 (A.sclerotium)、蜂蜜味曲霉属 (A.melleus)、洋葱曲霉（A. alliaceus）、孔曲霉（A. ostianus）、纯绿青霉(P. viridicatum)和圆弧青霉（P. cyclopium）也能产生赭曲霉毒素A。 曲霉属产生赭曲霉毒素A的条件是中温,寒冷气候。青霉属产生赭曲霉毒素A的地区主要是亚热带,2019/7/17,26,赭曲霉毒素A（Ochratoxin A）中毒,研究资料表明，该毒素可损害动物的肾脏及肝脏损害，有致畸和致癌作用，并被认为与人类的巴尔干肾病有关。 由于其也有致癌后果，国际癌症研究机构IARC将其定为2B类致癌物。 赭曲毒素浓度为1mg/kg左右时，使家禽的产蛋率下降；超过5mg/kg时，会对肝脏组织和肠产生损坏。,2019/7/17,27,容易受到赭曲霉毒素污染的农副产品,绿咖啡豆、咖啡制品、 葡萄干、 大豆、玉米、大米、花生、棉籽、麦类、绿豆、 啤酒、葡萄汁、调味品、 草本植物、猪肾。,2019/7/17,28,赭曲毒素A在各种商品中的存在情况（1）,2019/7/17,29,赭曲毒素A在各种商品中的存在情况（2）,2019/7/17,30,赭曲霉毒素在饲料中的污染情况,2019/7/17,31,中国部分地区谷物中赭曲霉毒素A的污染情况,2019/7/17,32,赭曲霉毒素A的限量标准,国际食品法典委员会提议：赭曲霉毒素A在小麦、大麦、黑麦及其它们的制品中不得超过5ug/kg。 瑞士：猪混合料200ug/kg, 家禽混合料1000ug/kg。 欧盟: 速溶咖啡-6, 烤制咖啡-3,干果-2,干无花果-8 g/kg。 德国2003年制定了最新的标准:咖啡及其制品中的赭曲霉毒素A5g/kg 。,2019/7/17,33,赭曲霉毒素的检测方法,AOAC 2000.03 免疫亲和柱+HPLC法测定大麦中的赭曲霉毒素 AOAC 2000.09 免疫亲和柱+HPLC法测定烤制咖啡中的赭曲霉毒素 AOAC 2001.01 免疫亲和柱+HPLC法测定酒和啤酒中的赭曲霉毒素,2019/7/17,34,伏马菌素特性,伏马菌素（Fumonisins）1988年被发现，其主要是由真菌F. moniliforme和F. proliferatum产生的次级代谢产物。 粮食在加工、贮存、运输过程中易受上述两种真菌污染，特别是当温度适宜，温度较高时，更利于其生长繁殖，产生一类结构性质相似的毒素，其中以伏马菌素B1、B2和B3为主。 为一类相关的极性、水溶性代谢产物，为多氢醇和丙三羧酸的双酯化合物 对热很稳定，不易被蒸煮破坏,2019/7/17,35,FB1对饲料污染的情况在世界范围内普遍存在，且对粮食作物的污染情况较严重，其污染的饲料主要为以玉米为原料的饲料。 表现出促癌活性，不仅是促癌剂，而且是一个完全的致癌物 对猪产生肺水肿综合症（PPE），并被怀疑可诱发人类的食道癌等疾病，从而对畜牧业及人类的健康构成威胁 ） 羊的肝病样改变和肾病 大鼠的肝坏死和心室内形成血栓 抑制鸡的免疫系统，增强二乙基亚硝胺的致肿瘤作用 可导致马产生白脑软化症（ELEM），神经性中毒而呈现意识障碍、失明和运动失调，甚至造成死亡 ） 对我国海门地区进行的3年的跟踪研究结果表明：伏马毒素还可使人导致肝癌,伏马菌素危害性,2019/7/17,36,伏马毒素在玉米及饲料中的发生情况,2019/7/17,37,伏马菌素在饲料中的推荐限量,2019/7/17,38,其它国家和地区对玉米中伏马菌素含量的限量标准(mg/kg)：,2019/7/17,39,美国FDA对伏马毒素在人类食品中的推荐限量标准,2019/7/17,40,伏马菌素的检测方法,薄层色谱法 气相色谱法（GC） ELISA法 HPLC法 免疫亲和柱净化-荧光法 免疫亲和柱净化-HPLC法,2019/7/17,41,玉米赤霉烯酮的性质,白色结晶 对热稳定, 120下加热4h未见分解 溶解性能,溶于碱性水溶液、乙醚、苯、氯仿 等溶剂 有15种以上的衍生物,2019/7/17,42,玉米赤霉烯酮的毒性,玉米赤霉烯酮具有较强的生殖毒性 ，对动物具有较强的危害作用，会给畜牧业带来一定危害 玉米赤霉烯酮至少能够对一种哺乳动物具有致畸效应 玉米赤霉烯酮对免疫系统的具有潜在毒害作用,2019/7/17,43,玉米赤霉烯酮的发生情况,玉米赤霉烯酮首先从赤霉病玉米中分离，其主要存在于玉米和玉米制品中，小麦、大麦、高粱、大米中也有一定程度的分布。,2019/7/17,44,玉米赤霉烯酮在各种商品中的发生情况,2019/7/17,45,我国部分地区小麦中玉米赤霉烯酮的污染情况,2019/7/17,46,部分国家和地区对玉米赤霉烯酮的限量标准,2019/7/17,47,玉米赤霉烯酮的检测方法,薄层色谱法（TLC）：适用于小麦及其制品和玉米及其制品中ZEN的测定，方法的灵敏度为50g/kg 酶联免疫吸附法（ELISA）：适用于谷物/饲料、啤酒、血清和尿中玉米赤霉烯酮含量的测定 ，最低检出限分别为1250 ng/kg，250 ng/kg，50 ng/kg 免疫亲和柱净化高效液相色谱法（IA-HPLC） ：适用于谷物（玉米、小麦、大麦、大米）、油籽（大豆、油菜籽）和食用植物油中玉米赤霉烯酮的测定，方法的检测限：0.005 mg/kg 以免疫亲和柱净化建立的荧光法和HPLC法简便快速，特异性强，稳定性好，可用于实际样品的检测,2019/7/17,48,呕吐毒素,脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol;缩写DON)又称呕吐毒素(vomitoxin)。属单端孢霉烯族化合物。据文献报道，由镰刀菌产生的单端孢霉烯族化合物已有60余种，但天然污染谷物的只有几种 该毒素1970年首先由日本科学家诸冈信从日本香川县感染赤霉病的大麦中发现，并分离提纯出来。由于它能引起猪等动物产生呕吐现象，由此命名为“呕吐毒素”。,2019/7/17,49,呕吐毒素的毒性,DON的主要产毒菌为禾谷镰孢菌(F.graminearum)，该毒素是目前已知的单端孢霉毒素中毒性最小的毒素，小鼠经口LD50=9.2mg/kg，其广泛地存在于温热地区的饲料之中。 DON的产毒菌株适宜在阴凉、潮湿的气候条件下生长，当谷物的水分含量为22时，在很短时间内，谷物中即可产生大量的DON，霉变玉米中往往同时存在DON和ZEN。,2019/7/17,50,呕吐毒素对人畜的危害,呕吐毒素中毒与动物疾病 畜禽呕吐毒素中毒后的一般表现为厌食、恶心、呕吐、腹泻，影响免疫和繁殖机能，并导致血磷和碱性磷酸酯酶的活性下降。呕吐毒素能引起猪食欲减退或废绝，呕吐，体重下降，流产，死胎和弱仔，抑制免疫机能和降低机体抵抗力。 呕吐毒毒素与人类的健康 人的中毒症状是胃部不适，恶心、呕吐、头痛、头晕、腹痛、腹泻。还可有全身无力、口干、流涎，少数患者有发烧、颜面潮红等症状。,2019/7/17,51,呕吐毒素在各种商品中的存在情况,2019/7/17,52,我国部分地区小麦中DON的污染情况,2019/7/17,53,部分国家粮谷中呕吐毒素的允许限量标准,2019/7/17,54,呕吐毒素的检测方法,薄层色谱法：适用于小麦及其制品(蛋糕、饼干、面包等)和玉米中呕吐毒素的测定。该方法操作简，但比较费时(48小时左右)灵敏度、特异性较差。 气相色谱法：适用于谷物中呕吐毒素测定。该方法需进行衍生化，操作烦琐、重现性较差。不适合于大批量样品检测。 微柱法：适用于小麦、玉米、大豆、高粱等农产品中呕吐毒素的快速筛选。该方法操作简便，但特异性较差，用于定性分析和快速筛选。 酶联免疫吸附测定法：适用于谷物及其制品中呕吐毒素测定。该方法快速、灵敏、准确、可定量、操作简便、无需贵重仪器设备，且对样品纯度要求不高，适用于大批量样品的检测。 免疫亲合柱-高效液相色谱法 和荧光计法：适用于谷物及其饲料中呕吐毒素测定。该方法分析速度快、操作简便、灵敏、准确。特效性强,分离效率和回收率高,正确性和可靠性强。,2019/7/17,55,T-2毒素,主要产毒菌株 自然界多种农作物致病菌可以产生T-2毒素，其中大多来自镰孢菌属，如早熟禾拟分枝孢镰孢菌（F.sporotrichioides）、枝孢镰孢菌（F.sporotrichiella）、梨孢镰孢菌（F.poae）和三隔镰孢菌（F.tritinctum）等。 产毒条件 产毒能力随真菌种类而异，同时受到环境因素的影响。枝孢镰孢菌的最适产毒条件为基质含水量为40%-50%，温度3-7；在玉米和黑麦中产毒能力较强，其次为大麦、大米和小麦,2019/7/17,56,T-2毒素的毒性,T-2毒素主