高效液相色谱分析技术—应用陈桂良.ppt

高效液相色谱分析技术 应用,上海市食品药品检验所 陈桂良,高效液相色谱法应用指导原则,用于药品的杂质检查，主要检查原料及制剂中引入的杂质或降解产物，尤其是难于用TLC分离的性质相似的有关物质。 用于原料药的含量测定，主要用于多组分或含有几种杂质，或因杂质干扰，常规方法又难以分离或分离手段繁杂的品种。,用于制剂及复方制剂的含量测定，主要用于所含杂质或赋形剂干扰含量测定、需先经繁杂分离后才能测定、或各成分间相互干扰的品种。 首选填料为十八烷基硅烷键合硅胶、硅胶及辛烷基硅胶。如经试用不适合时，再选用其他填料。首选国产分离柱，并应比较不同分离柱的理论板数。应选择适宜的通用性较强的分离往。,流动相首选甲醇-水系统，如经试用不适合时，再选用其他溶剂。为保护仪器，应尽可能少用含有缓冲液的流动相。 内标物质应选择易得并不对测定方法产生干扰的物质，原料药的含量测定避免使用内标法。 检测器首选UV检测器。 用于药品的杂质检查时，应避免采用峰面积归一化法。,枸橼酸氯米芬,异构体 照高效液相色谱法，用硅胶为填充剂，正已烷-氯仿-三乙胺（80:20:0.1）为流动相检测波长为302nm；理论板数按顺式异构体峰计算应不低于3000，顺、反式异构体峰的分离度应大于1.3。取本品加流动相制成每1ml中含0.10mg的溶液，取20l注入液相色谱仪，记录色谱图，其保留时间依次为顺式异构体（E）与反式异构体（Z），按峰面积归一法计算，供试品中含反式异构体应为30-50%。,甲氨蝶呤含量测定,照高效液相色谱法（附录）测定。 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-7.0%枸橼酸溶液-2.0%无水磷酸氢二钠溶液（10:10:80）为流动相，检测波长为302nm。理论板数按甲氨喋呤峰计算并不低于1000，甲氨蝶呤峰与叶酸峰的分离度应不小于8.0。,测定法 取本品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.1mg的溶液，精密量取10l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取曾测定干燥失重的甲氨蝶呤对照品，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。,泼尼松龙含量测定,照高效液相色谱法（附录）测定。 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-水（65:35）为流动相，检测波长为240nm。理论板数按泼尼松龙峰峰计算应不低于1000，泼尼松龙峰和内标物质峰的分离度应大于3.5。,内标溶液的制备 取块诺酮，加甲醇制成每1ml中含1.5mg的溶液,摇匀,即得。 测定法 取泼尼松龙对照品适量,精密称定,加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，作为对照品溶液;精密量取该溶液与内标溶液各5ml，置50ml量瓶中，用甲醇稀释成50ml，摇匀,取10l注入液相色谱仪,记录色谱图；另取本品适量,同法测定,按内标法以峰面积计算，即得。,HPLC在药品质量控制中的应用,鉴别 杂质分析 复方制剂分析 含量测定 对照品标定,鉴别,采用与对照品在相同条件下进行色谱分离并进行比较，要求其保留行为和检测结果都相互一致作为鉴别药品真伪的验证，是一个较好的方法；选用色谱法进行鉴别试验时，必须要求该色谱条件能保证其与同类药品有良好的分离，也就是主要有适应性试验的内容。,取本品与盐酸去甲万古霉素标准品，分别加水制成每1ml中约含5mg的溶液，照去甲万古霉素含量项下的方法试验，供试品与标准品主峰的保留时间应一致。（盐酸去甲万古霉素）,在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的保留时间应与对照品峰的保留时间一致。（醋酸氟氢可的松软膏）,空白试验,空白试验是指在与供试品鉴别试验完全相同的条件下，除不加供试品外，其它试剂均同样加入而进行的试验。,对照试验,用已知含某类成分的中草药或纯品做阳性对照 ，以排除假阴性的出现,杂质分析指导原则,USP对法定标准中的杂质定义较详细； BP对杂质的确定和测定方法说明比较具体； ICH对新药和新制剂中的杂质也有文本介绍。,任何影响药品纯度的物质均称为杂质。药品质量标准中的杂质系指在按照经国家有关药品监督管理部门依法审查批准的规定工艺和规定原辅料生产的药品中，由其生产工艺或原辅料带入的杂质，或经稳定性试验确证的在贮存过程中产生的降解产物。,杂质定义,质量标准中杂质检查项目的确定主要供新药的药学研究和质量标准建立参考； 新药中发现的表观含量在0.1%及以上的杂质和降解产物，以及毒性杂质，应进行定性或确定结构，即至少要确定化学类别。仿制药品和变更工艺或原辅料产生的新杂质，也应这样进行研究。,质量标准中的杂质不包括掺入的或污染的外来物质，不包括变更生产工艺或变更原辅料而产生的新杂质。 由于假劣药品的情况复杂，必要时采用非法定方法予以检测。,检测对象,药品生产企业变更生产工艺或原辅料，并因由此带进新的杂质对原质量标准的修订，均应依法向有关药品监督管理部门申报批准。,由于杂质分类方法较多，难以统一规定。如USP的 “普通杂质”，正文和通法中均有“普通杂质”的规定。 ICH的分类：有机杂质和无机杂质；有机杂质又分特定杂质、有关物质和残留溶剂等。； 对映体有时也作为杂质。,杂质分类,按化学类别和特性，杂质可分为：有机杂质、无机杂质、有机挥发性杂质。按其来源，杂质可分为：有关物质（包括化学反应的前体、中间体、副产物、降解产物等）、其他杂质和外来物质等。,按结构关系，杂质又可分为：其他甾体、其他生物碱、几何异构体、光学异构体等。按其毒性，杂质又可分为毒性杂质和普通杂质等。普通杂质即为在存在量下无显著性不良生物作用的杂质，而毒性杂质为具强烈不良生物作用的杂质。,新原料药和新制剂中的杂质，应按国家有关新药申报要求进行研究，也可参考ICH（人用药品注册技术要求国际协调会）的文本Q3A（新原料药中的杂质）和Q3B（新制剂中的杂质）进行研究，并对杂质和降解产物进行安全性评价。,质量标准中杂质检查项目的确定,新药研制部门对在合成、纯化和贮存中实际存在的杂质和潜在的杂质，应采用有效的分离分析方法进行检测。,新药质量标准中的杂质检查项目应包括经研究和稳定性考察检出的，并在批量生产中出现的杂质和降解产物，并包括相应的限度。,除降解产物和毒性杂质外，在原料中已控制的杂质，在制剂中一般不再控制。 原料药和制剂中的无机杂质，应根据其生产工艺、起始原料情况确定检查项目，但对于毒性无机杂质，应在质量标准中规定其检查项。,在仿制药品的研制和生产中，如发现其杂质模式与其原始开发药品的不同，或与已有法定质量标准规定不同，需增加新的杂质检查项目的，应按上述方法进行研究，申报新的质量标准或对原质量标准进行修订，并报有关药品监督管理部门审批。,共存的异构体和抗生素多组分一般不作为杂质检查项目，作为共存物质，必要时，在质量标准中规定其比例，以保证生产用的原料药与申报注册时的一致性。但当共存物质为毒性杂质时，该物质就不再认为是共存物质。,共存物质,杂质检查分析方法应专属、灵敏。杂质检查应尽量采用现代分离分析手段，主成分与杂质和降解产物均能分开，其检测限应满足限度检查的要求，对于需作定量检查的杂质，方法的定量限应满足相应的要求。,杂质检查分析方法和杂质的限度,杂质检查分析方法的建立应按本药典的要求作方法验证。在研究时，应采用几种不同的分离分析方法或不同测试条件 以便比对结果，选择较佳的方法作为质量标准的检查方法。杂质检查分析方法的建立，应考虑普遍适用性，所用的仪器和试材应容易获得。对于特殊试材，应在质量标准中写明。,新药研究中的杂质和降解产物，或在非新药中发现的新杂质和新降解产物，应进行分离纯化制备，或合成制备，以供进行安全性和质量研究。对确实无法获得的杂质和降解产物，研制部门应在申报资料和质量标准起草说明中写明理由。,在用现代色谱技术对杂质进行分离分析的情况下，对已知杂质和毒性杂质，应使用杂质对照品进行定位，如无法获得该对照品时，可用相对保留值进行定位。应使用多波长检测器研究杂质在不同波长下的检测情况，并求得在确定的一个波长下，已知杂质，特别是毒性杂质对主成分的相对响应因子。,已知杂质或毒性杂质对主成分的相对响应因子在0.91.1范围内时，可以用主成分的自身对照法计算含量，超出0.91.1范围时，宜用对照品对照法计算含量。也可用经验证的相对响应因子进行校正后计算。,未知杂质的定量可用主成分自身对照法进行计算。杂质定量计算方法应明确规定在质量标准中。质量标准中还应有单个杂质限量和总杂质限量的规定。 由于色谱法杂质限度检查受色谱参数设置值的影响较大，有关操作注意事项应在起草说明中写明，必要时，可在质量标准中予以规定。,有机杂质的检查方法,应包括全部分析参数,如分析柱,流动相流速,流动相梯度或温度梯度,检测器类型和相关设定(如波长,阴极和阳极电压等),进样体积,样品浓度,样品和对照品的制备,并应符合方法验证的要求。在报告中应附标准溶液和供试溶液的色谱图(通常3批),用加入法或原料确定产品中的起始原料,副产物和中间体,用强降解(forced degradation)溶液确定潜在的降解产物(potential degradants)。,常用液相或气相色谱法，有的辅料在色谱上会误为杂质，所以在报告中应有用辅料的色谱图，加主成分和不加主成分的，还有空白溶液的色谱图。,制剂中的有机杂质,报告中应列出全部依据稳定性试验认定的确实在货架效期会增多的指定杂质，列出名称，相对保留时间，相对响应因子，限度，定量限，检测限。应提供系统适用性，以保证色谱系统有效。,应用实例：注射用氨苄西林钠相关物质检查 色谱柱：Gemini C18 5u 250x4.6mm 方法：ChP2005,应用实例：注射用头孢唑林钠 色谱柱：Gemini C18 5u 250x4.6mm 方法：ChP2005,1.（1-唑基-1-）醋酸 2.头孢唑林烷酸水解物 3. 5-甲基-1,3,4-噻二唑-2-巯基(MMTD) 4. 溶剂峰 7.未知杂质 8.头孢唑林 9.头孢唑林烷酸,应用实例：注射用阿莫西林克拉维酸钾相关物质检查 色谱柱：Synergi Fusion-RP 250x4.6mm 方法：ChP2005,应用实例：头孢克洛胶囊相关物质检查 色谱柱：Synergi Fusion-RP 250x4.6mm 方法：ChP2005,1.3-头孢克洛 2.头孢克洛,含量测定,在原料药的含量测定中,高效液相色谱法已大量用于化学合成药、多组分的抗生素或生化药品； 方法中所用的对照品,必须具有纯度高、易于制备和性质稳定等条件； 一般不使用内标物质,即使使用,应选择易得,并不得对测定方法产生干扰的化学试剂。,高效液相色谱法条件,首选色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶、硅胶及辛烷基硅胶，流动相应首选甲醇-水系统； 理论板数和分离度的数值，均系指符合检测的最低要求。,甲氨蝶呤,色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-7.0%枸橼酸溶液-2.0%无水磷酸氢二钠溶液（10:10:80）为流动相，检测波长为302nm。理论板数按甲氨喋呤峰计算并不低于1000，甲氨蝶呤峰与叶酸峰的分离度应不小于8.0。,测定法 取本品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.1mg的溶液，精密量取10l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取曾测定干燥失重的甲氨蝶呤对照品，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。,维生素K1,色谱条件与系统适用性试验 用硅胶为填充剂，石油醚（60-90）-正戊醇（2000:2.5）为流动相，检测波长为254nm。维生素K1的顺、反异构体峰之间及顺式异构体峰与内标物质峰之间的分离度均应符合要求。,内标溶液的制备 取苯甲酸胆甾酯约37.5mg,置25ml量瓶中,用流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。 测定法 取维生素K对照品约20mg,精密称定,置50ml量瓶中,用流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取此溶液5ml与内标溶液1ml,置10ml量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,取10l注入液相色谱仪,记录色谱图;另取本品适量,同法测定。按内标法以顺、反式异构体峰面积之和计算,即得。,复方制剂,HPLC法同时测定四环素可的松眼膏中四环素和醋酸可的松的含量 复方维生素B制剂 复方感冒片 复方磺胺类药物 复方激素类药物 HPLC法测定复方安乃近片中富马酸酮替芬的含量等,Synergi Hydro-RP,Synergi Max-RP（C12),Mobile Phase: A: 20mM KH2PO4, pH 4.6 B: Acetonitrile Gradient: A/B (95:5) to A/B (65:35) in 15 min Flow rate: 1.5 mL/min Sample: 1. 吗啡 2. 氢吗啡酮 3. 可待因 4. 烯丙吗啡 5. 羟考酮,Synergi Hydro-RP,测定对照品纯度方法,检测对照品纯度的分析方法取决于它们的用途，分为三类： 需用外标对照品进行比较的分离分析方法； 热力学分析方法； 其它方法。,分离分析方法,色谱法 色谱法常用于杂质的鉴别及定量。高效液相色谱法是应用最广泛的色谱方法，TLC和GC也常用。用色谱法分出的单个成分常常回收后进行鉴定。,测定CRS中的杂质时，要求对照品与其已知杂质的检测响应值近似； 如果在最佳检测波长下，二者的响应值有显著区别，就须进行适当的校准以估算杂质的含量； 二极管阵列检测器能够记录主峰及杂质峰的紫外图谱，非常有用； LCMS可用于鉴定与主成分分开的杂质，适用于鉴定没有其它对照物或红外图谱的CRS。,HPLC法用于苯唑西林钠及其制剂中含量和有关物质的测定,依利特Hypersil BDS苯基柱(5m, 250mm X4.0mm), 0. 02mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值至3.6)一乙睛一甲醇(700 : 225 : 75)为流动相，流速1.0ml/min，检测波长225nm，进样量10l。 专属性 与同类抗生素的分离 分解产物的分离,A:苯唑西林;B:氯唑西林; C:氟氯西林; D:双氯西林,酸破坏,碱破坏,氧化破坏,光照破坏,USP条件,RPHPLC法测定甲砜霉素及其胶囊剂的含量和有关物质,HPLC法测定盐酸氟西汀的有关物质及其胶囊的含量,色谱条件为； Bondapak C18 色谱柱(10m，300mmX3.9mm)，四氢呋喃一乙腈一0.8 三乙胺缓冲液(用磷酸调节pH至5.8)(14:21 :65)为流动相流速为1.0mLmin，柱温为30，检测波长为226nm。 盐酸氟西汀对照品(Eli Lilly咖啡因为本所留样。,HPLC法测定环胞素胶囊中环胞素及降解产物的含量,用ODS柱，水-四氢呋喃-0.4mol/L磷酸正丙胺溶液（0.4mol/L正丙胺溶液，用磷酸调节pH值为2.6）（590：400：10）为流动相；柱温：70；检测波长：220nm。 环胞素胶囊为软胶囊，所含成分复杂，除辅料外，可能含有的杂质有：环胞菌素C（CsC）、环胞菌素B（CsB）、环胞菌素G（CsG）、环胞菌素H（CsH）、异环胞菌素H（IsoCsH）和异环胞菌素A（IsoCsA），其中CsH 、IsoCsH和IsoCsA均为降解产物，其余为来源于原料药的副产物，制剂过程中不会增加，一般在原料药中加以控制，制剂中则可不考虑，但必须能与CsA及降解产物进行有效地分离。,取CsA对照品和各杂质对照品适量，用乙腈-水（1：1）溶解并稀释成含CsA0.25mg/ml，CsB、CsG、CsH和IsoCsA分别为0.04mg/ml，CsC和IcoCsH分别为0.02mg/ml的溶液,硫酸特布他林片的HPLC测定,色谱柱：Waters Nova-Pak C18(3.915O mm)；流动相：乙腈-0.005 molL樟脑磺酸溶液(20：80)流速1.0 mlmin；检测波长220 nm。在上述色谱条件下，其色谱图见图1。1、2及1分解产物的峰之间的分离度均大于15。,HPLC法同时测定四环素可的松眼膏中四环素和醋酸可的松的含量,色谱条件采用依利特HYPERSIL BDSCl8(300mm4.0 mm，5 )为色谱柱，0.01 mol/mL十二烷基硫酸钠溶液(用磷酸调节pH值至2.5):乙腈(60：40)为流动相，检测波长254 nm，流速0.8 mL/ml，柱温40，进样量20 l,反相离子对HPLC法测定盐酸多巴酚丁胺的含量及有关物质,以Zorbax Rx-C8（4.6 250 mm, 5）为色谱柱，甲醇-四氢呋喃-樟脑磺酸钠缓冲液（取樟脑磺酸钠1.3g，加水1000ml使溶解，加三乙胺3ml，用磷酸调节pH至2.8）（20：10：70）为流动相，柱温为40，检测波长为280 nm，流速1ml/min ; 色谱条件的选择 :,色谱条件的选择-有机相的选择,以Zorbax Rx-C8（4.6 250 mm, 5）为色谱柱，流动相中的水相为樟脑磺酸钠缓冲液（取樟脑磺酸钠1.3g，加水1000ml使溶解，加三乙胺3ml，用磷酸调节pH至2.8，过滤）。取1mg/ml的强光破坏样品的0.01mol/L盐酸溶液进样。分别以甲醇、乙腈、四氢呋喃为有机相，有机相在30min内线性程序洗脱从0100%，维持10min。结果以甲醇为有机相的流动相分离效果最佳，四氢呋喃次之，乙腈最差；但有关物质最后出峰时间以四氢呋喃最短，甲醇和乙腈较长。为此，选择甲醇-四氢呋喃为有机相。经优化，其比例为2：1。,离子对试剂的选择,在溶液中为带正电荷的阳离子，选择常用的十二烷基硫酸钠，辛烷磺酸钠和樟脑磺酸钠为离子对试剂，分别进行试验。结果以十二烷基硫酸钠的分离效果最差，辛烷磺酸钠和樟脑磺酸钠均较好。鉴于樟脑磺酸钠价格便宜，实验后容易清洗色谱柱，且用量少，故选用樟脑磺酸钠为离子对试剂。,缓冲液pH值及检测波长的选择,分别选用pH为2.2、2.5、2.8、3.2、3.5 和4.0的缓冲液进行试验。结果pH为2.2、2.5、 2.8和3.2时，1主峰的柱效及其与相临杂质峰的分离度几乎一样，pH超过3.5时，1主峰的柱效下降，峰拖尾。 在200400nm的波长范围内进行紫外扫描，1在流动相中于221 nm和 280nm波长处有最大吸收，但波长221nm处在含有离子对试剂的流动相中，基线噪音较大，本底较高；故检测波长选择为280nm。,专属性(光照),专属性(粗品),HPLC-蒸发光散射检测法测定注射用头孢他啶中碳酸钠的含量,色谱柱：Hypersil SCX（250 mm4.0 mm，5 m，大连依利特公司装填）；柱温：室温；流动相：0.02 molL-1醋酸铵溶液（用冰醋酸调节pH至4.8）-乙腈（7030），流速：1.5 mLmin-1；ELSD温度：40 ，灵敏度（gain）：6，雾化气体（空气）压力：0.35 MPa；进样体积：10 L。,A系统适用性试验色谱图1.Li+（7.6 min） 2.Na+（8.3 min） 3.K+（9.6 min）B注射用头孢他啶供试品溶液色谱图,讨论-国外文献比较,选用Zorbax 300-SCX柱，0.05 molL-1醋酸铵溶液（用冰醋酸调节pH至6.0）-甲醇（50：50）作流动相。该方法的不足之处如下：1）色谱柱价格较高；2）流动相的pH大于7.0，不利于以硅胶为基质的填料的稳定；3）因SCX填料不及非极性键合相填料稳定和耐用，缓冲液浓度一般以不大于0.02 molL-1为宜；4）在醋酸盐溶液-甲醇（50：50）中，醋酸的pKa值由4.8增加为5.5，故该流动相的缓冲容量偏低，色谱系统不够稳定；5）该流动相的粘度较大，使柱压较高，对色谱系统不利。为此拟改用价格较低的国内装填的Hypersil SCX柱，并用乙腈代替甲醇。,缓冲液种类、pH、浓度的选择,醋酸铵溶液的离子强度保持恒定，pH在4.86.7之间变化，Li+、Na+和K+的保留值均基本不变，而头孢他啶的保留值则随pH的增加而降低，但始终在Li+，Na+和K+之前洗脱。这是因为随着流动相pH的增加，头孢他啶结构中酸性基团的解离程度增加，疏水性降低，故保留减弱。为保证流动相有足够的缓冲容量，醋酸铵溶液的pH选择为醋酸的pKa值：4.8。 与离子交换色谱理论相符，醋酸铵溶液的pH保持不变，离子强度在0.020.10 molL-1范围内变化，Li+、Na+和K+的保留均随离子强度的增强而减弱，相互间的分离度也相应降低。同时，Na+峰的响应值随着醋酸铵浓度的增加而显著增加。这符合ELSD的特性：被测组分峰的响应值一般随着其保留值的减少而相应增加。此外，在试验的浓度范围内，醋酸铵溶液浓度增加，基线噪音并未如预料地相应增加。这与文献报道10相同。醋酸铵溶液浓度以0.02 molL-1左右为宜，pH 4.8时醋酸铵溶液的离子强度约为0.035 molL-1。 10.Gard S，Elfakir C，Dreux MCharacterization of sulfobutyl ether-cyclodextrins mixtures by anion-exchange chromatography using evaporative light scattering detectionJ Chromatogr A，2000，897：185,HPLC-蒸发光散射器检测注射用头孢曲松钠中钠离子的含量,采用Hypersil SCX柱，以乙腈-0.03mol/L醋酸铵溶液（用冰醋酸调节pH值为4.8）（20:80）为流动相，蒸发光散射检测器温度：40 ，雾化气体（空气）压力：3.5 bar。 针对金属离子没有紫外吸收的特点，色谱法中以电导检测较为常用 。,Li、Na、K,高效液相色谱一蒸发光散射检测法测定硫酸阿米卡星,色谱柱：Zorbax Extend C18(150 mm4.6 mm，5m)，柱温：30 ，流动相：水一氨水一冰醋酸(96：3.6：0.4)，流速：0.4mL/min，蒸发光散射检测器，漂移管温度：40 ，载气压力：350 kPa；进样体积：20L。,首批地红霉素国家标准品的建立,采用反相和正相HPLC法确定杂质的个数和归一化系数； 采用校正面积归一化法确定其纯度为98.9%； 使用DSC法确定其纯度为98.7%； 干燥失重为0.81%， 硫灰为0.11%；,其效价（u/mg）为： (1-0.0081-0.0011)0.9881000 = 979； 验证方法为采用企业对照品进行微生物检定法测定,平均效价为957u/mg，在误差范围之内。,盐酸左沙丁胺醇工作对照品,根据标准物质的同质性,不能使用已有的沙丁胺醇国家对照品作为盐酸左沙丁胺醇的对照品。在无法获得其高一级对照品的情况下,采用英国药典1998年版的容量分析法(法定方法,高氯酸滴定液经国家基准物质邻苯二甲酸氢钾进行标定)。,滴定法测得含左沙丁胺醇为87.3%(RSD=0.02%, n=8)； 105干燥至恒重测得其挥发性物质（水分和残留溶剂）为0.21%； 测得其无机杂质（硫灰）为可略量； 使用正相HPLC法测得其右旋体及其他有关物质为0.44%；,按干燥品计算,含左沙丁胺醇为: (1-0.0044)87.3%/(1-0.0021) = 87.1% 采用沙丁胺醇国家对照品使用HPLC法进行验证，其含量为87.2%，在误差范围之内。,利福喷丁工作对照品的建立,准备工作,利福喷丁精制品由上海黄海制药责任有限公司提供，批号为20010201,符合法定标准。 本品对光、高热敏感，分装时应控制温度且避光。在温度18、相对湿度为25%的避光环境中分装，每瓶约300mg。,利福喷丁工作对照品标定的原理,HPLC在对照品标定工作中的作用越来越大，但杂质的紫外响应往往与主药不一致，导致HPLC-UV检测法在标定工作中的偏离较大。蒸发光散射检测器（ELSD）是一种新型的通用型质量检测器，其响应不依赖样品的光学性质，任何挥发性高于流动相的物质均能被检测；在相同的色谱条件下，物理性质相似的物质在ELSD中形成的的颗粒大小、形状相似，对蒸发光的散射能力相同，因而可以给出一致的响应。利用这一性质，可以标定利福昔明工作对照品。利福平、利福昔明为利福喷丁的同系物，结构相似，且目前已有利福平的液相用国家对照品，含量已知，可用于利福喷丁工作对照品标定的佐证。,纯度分析,挥发性杂质的分析:采用60真空干燥条件下测得其挥发性物质总量为：5.14%，挥发性物质包括水分和残留溶剂等，即任何挥发性高于水分的物质的总含量。 无机杂质的分析:采用炽灼残渣的方法测得其无机杂质总量为：0.04%。,HPLC-ELSD法测定利福昔明的纯度,用C8色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为乙腈-甲醇-0.05moL/L醋酸铵溶液（pH5.0）(1：1：4)，流速为1.3 mL.min-1，程序洗脱，柱温为30。检测器温度为50，Gain为6，空气流速3.4 Bar。,利福平对照品的HPLC-UV具有5个有关物质,三种利福霉素同系物在蒸发光散射检测器上的响应基本一致。可用于利福昔明工作对照品的首次标定。,最小检出量及未检出杂质含量的估计:蒸发光散射检测器测定的最低检测限以信噪比为3计，三种利福霉素同系物均为0.03g,以供试品的进样量计算，大于0.04%的杂质均能检出。 利福喷丁工作对照品纯度的确定:在高浓度