高压提取香菇多糖的详细方案.doc

高压提取香菇多糖的详细方案高压提取技术是在常温条件下，提取香菇原料中的有效成分的新技术。1.1高压提取工作原理图1、活塞2、压力容器3、传压介质4、挠性包装容器5、香菇原料这里说的高压是指压力在100MPa以上，甚至高达1000MPa以上的流体静压力。全称为“超高冷等静压”（Ultra high isostatic hydrostatic pressure at roomtemperature），简称为高压（High hydrostatic pressure，HHP），或高压（Ultra highpressure，UHP）。高压技术应用在工业领域已有多年的历史，19世纪末被应用到食品领域。近年来张守勤38等将高压技术应用于中药有效成分的提取，在国内外尚属首次，这一技术的发明与研究，加快了我国中药现代化的步伐。高压提取技术是在常温条件下，提取生物原料中的有效成分的新技术。可以提取的有效成分有：生物碱、活性多糖和低聚糖、芳香油、脂质类、黄酮、甙类等水溶性、醇溶性、脂溶性和溶于其它有机溶剂中的小分子成分。与煎煮法、回流法、索氏提取等传统提取技术相比较，高压提取技术可以大大缩短提取时间、降低能耗、减少杂质成分的溶出，提高有效成分的收率，而且高压提取是在常温下进行，避免了因热效应引起的有效成分结构变化、损失以及生理活性的降低，同时高压提取是在一个密闭的环境下进行的，没有溶剂的挥发，因此该技术更加符合“绿色”环保的要求。高压在提取过程中的作用过程：在升压时，通过渗透作用，溶剂进入细胞内部，在此过程中细胞的结构在高压下受到不同程度的破坏。保压时，细胞内容物与进入细胞内部的溶剂接触，有效成分溶于这些溶剂中。在泄压过程中，细胞外部的压力减小为零，细胞内部的压力仍然保持平衡时的压力，即此时压力差与施加压力时方向相反。由于施加的是高压，因此这种反方向的压力差仍然是很大的，因此细胞壁变形而破坏，溶解了有效成分的溶剂泄出。如果在反方向压力作用下细胞壁的变形没有超过其反向变形极限，细胞内部已经溶解了有效成分的溶剂在高渗透压差下快速转移到细胞外，达到提取的目的。1.2高压加工设备压力简图1、活塞顶盖2、压力容器3机架4、压媒槽5、增压泵6、换向阀7、压力泵8、油槽9、香菇原料高压系统包括高压容器及其封头，压力发生系统，温度控制装置和物料装卸系统。加料并封闭后，传压介质慢慢充满容器，高等静压就可以产生了。高压可以直接或间接产生，也可以通过加热传压介质产生。直接压缩使用小直径的活塞对传压介质施压，而大活塞用低压泵来驱动，直接压缩方式只能用于直径较小的实验设备。加热传压介质可以使传压介质膨胀，在提高温度的同时产生高压，因此通常用在需要高温和高压联合作用，而且整个压力容器内部的温度需要精确控制的场合。大多数工业等压缩系统均采用间接压缩方法，间接压缩使用增压器把传压介质泵入封闭的高压容器，直到达到要求的压力为止。1.3间歇式高压加工设备 1.4间歇式高压加工设备结构图1.5连续式高压加压系统1、原料入口2、原料罐3、低压泵4、高压泵5、高压加工装置6、缓冲罐7、灌装线8、产品高压提取香菇多糖的工艺流程将干燥的香菇子实体粉碎；称取要求量的香菇粉未，分别加入水、不同浓度的酒精溶液，混合成悬浊液；高压处理悬浊液；过滤，去除固体颗粒，得提取液。高压提取的工艺流程如下图所示：香菇子实体真空干燥处理粉碎（100）目）精确称取加入溶剂成悬浊液高压处理过滤测多糖含量试剂：蒸馏水，苯酚，铝片， 固体，浓硫酸，葡萄糖设备和仪器：100ml容量瓶，玻璃棒，蒸馏装置（温度计、沸石、三口烧瓶、冷凝管），电子天平，紫外分光光度计， 1、2、5、10ml吸液管，水浴锅，DL700-0.551.5超高压等静压机（上海大隆高压设备厂），真空泵，抽虑瓶。实验前工作：1、标准葡萄糖溶液的配制精密称取105干燥至恒重的葡萄糖100.0mg，加蒸馏水溶解并定容于100ml容量瓶中，摇匀，配成浓度为1mg/ml标准葡萄糖溶液备用。2、5%苯酚试剂的配制苯酚水浴加热溶解后称取100g，加铝片0.1g(先用1：6的盐酸除去铝片表面氧化铝后，再称量使用)，加入碳酸氢钠30g，蒸馏，收集178-182的馏分，取馏出液7.5g，加入蒸馏水150mL，得5.0的苯酚溶液，置于棕色瓶中备用。3、标准曲线绘制以葡萄糖作为标准品，采用苯酚硫酸比色法，用紫外分光光度计测定多糖含量。精密吸取已配制的葡萄糖标准品溶液0.5，1，1.5，2，2.5，3ml置于6个50ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度线，摇匀。精密吸取2ml，分别加入5%苯酚溶液1ml，摇匀，迅速加入5ml浓硫酸，振摇5min，置沸水浴上加热15min，然后置冷水浴中冷却30min，以溶剂蒸馏水为空白作对照，在400600nm内扫描，最大吸收波长为490nm。在490nm处，测吸光值，以浓度为纵坐标，吸光值为横坐标，绘制标准曲线，得出葡萄糖标准品浓度Y（ug/ml）与吸光值X的回归方程：Y=15.336X-0.0298，R2=0.9997。在2.515.0 ug/ml范围内呈线性关系。预处理：将新鲜香菇清洗干净，除去其根部，将剩下的菌伞挤压，切小块放入真空干燥箱干燥，待香菇恒质量，放入粉碎机中粉碎，将粉碎后的香菇粉依次通过40，60，80，100目的筛子，过筛之后把各级香菇粉分别装到清洁干燥的烧杯中，编号贴上标签，置于真空干燥箱中待用。单因素对提取率的影响：对比试验：准确称取100目的香菇粉一份1g，放入到200mL的烧杯中，标号贴上标签，分别加入40ml蒸馏水混合均匀，放入塑料袋中并封口，密封，室温浸泡24h，然后将样品放入高压容器内，启动高压油泵，升高到所需的压力，并在此压力下保持一定时间(压力:200MPa；保压时间:2min)；然后快速打开控制高压油路的阀门，在2秒钟之内卸除压力，取出高压加工后的样品，去除包装后，抽滤去除滤渣，得到香菇多糖的提取液，将滤液稀释一定的倍数（3倍），取2ml溶液分别加入5%苯酚溶液1ml，摇匀，迅速加入5ml浓硫酸，振摇5min，置沸水浴上加热15min，然后置冷水浴中冷却30min，即以溶剂蒸馏水为空白作对照，在490nm处用分光光度计测吸光值，计算多糖提取率，得到选择的溶剂与提取率的关系。1、溶剂的选择实验提取溶剂对有效成分的提取得率、分离纯化都有直接关系，包括溶出、澄清、浓缩、层析结晶与冻干等许多的单元操作。研究表明，影响提取的主要因素是欲提取物质在所使用溶剂中的溶解度大小以及该物质向溶剂扩散的难易程度。准确称取100目的香菇粉5份，每份1g，放入到200mL的烧杯中，标号贴上标签，分别加入40ml蒸馏水混合均匀，放入塑料袋中并封口，密封，室温浸泡24h，然后将样品放入高压容器内，启动高压油泵，升高到所需的压力，并在此压力下保持一定时间(压力:500MPa；保压时间:5min)；然后快速打开控制高压油路的阀门，在2秒钟之内卸除压力，取出高压加工后的样品，去除包装后，抽滤去除滤渣，得到香菇多糖的提取液，将滤液稀释一定的倍数（3倍），取2ml溶液分别加入5%苯酚溶液1ml，摇匀，迅速加入5ml浓硫酸，振摇5min，置沸水浴上加热15min，然后置冷水浴中冷却30min，即以溶剂蒸馏水为空白作对照，在490nm处用分光光度计测吸光值，计算多糖提取率，得到选择的溶剂与提取率的关系。2、浸泡时间的选择实验中药浸泡实质上是使有效成分(即溶质)从固相向液相转移的传质过程。从传质原理讲，其浸泡过程一般可分3步：药材的润湿和溶剂由外向药材内部的渗透、细胞组织的渗透；药材内部溶质的溶解；溶质从药材内部向药材表面以及由药材表面向溶液主体的扩散。中药浸泡有利于有效成分的充分溶出，因此，浸泡时间的长短对有效成分的提取率有着重要的影响。准确称取100目的香菇粉9份，每份1g放入到200mL的烧杯中，标号贴上标签，分别加入40ml蒸馏水，混合均匀，放入塑料袋中并封口，密封，室温浸泡时间分别为0，1，2，3，4，6，8，12，24h，然后分别将样品放入高压容器内，启动高压油泵，升高到所需的压力，并在此压力下保持一定时间(压力:200MPa；保压时间:2min)；然后快速打开控制高压油路的阀门，在2秒钟之内卸除压力，分别取出高压加工后的样品，去除包装后，抽滤去除滤渣，得到香菇多糖的提取液，将滤液稀释一定的倍数（3倍），取2ml溶液分别加入5%苯酚溶液1ml，摇匀，迅速加入5ml浓硫酸，振摇5min，置沸水浴上加热15min，然后置冷水浴中冷却30min，即以溶剂蒸馏水为空白作对照，在490nm处用分光光度计测吸光值，计算多糖提取率，得到浸泡时间与提取率的关系。3、压力的选择实验压力作为热力学的一个主要参数 ，它也像温度一样影响反应的速度和程度.改变压力能影响物质的内在渗透压 ，进一步改变物质的溶解性.渗透压力升高 ，会引起分子间的束缚水的减少 ，外在压力可以减弱渗透压的影响 ，所以外在压力的存在 ，可以使分子更容易的从药物中分离出来，这是高压法的主要影响因素。准确称取100目的香菇粉8份，每份1g放入到200mL的烧杯中，标号贴上标签，分别加入40ml蒸馏水，混合均匀，放入塑料袋中并封口，密封，室温浸泡4h，然后分别将样品放入高压容器内，启动高压油泵，升高到所需的压力，压力分别为0，50，100，200，300，400，500，600Mpa，保压时间为2min，然后快速打开控制高压油路的阀门，在2秒钟之内卸除压力，分别取出高压加工后的样品，去除包装后，抽滤去除滤渣，得到香菇多糖的提取液，将滤液稀释一定的倍数（3倍），取2ml溶液分别加入5%苯酚溶液1ml，摇匀，迅速加入5ml浓硫酸，振摇5min，置沸水浴上加热15min，然后置冷水浴中冷却30min，即以溶剂蒸馏水为空白作对照，在490nm处用分光光度计测吸光值，计算多糖提取率，得到压力与提取率的关系。4、料液比例的选择实验溶剂（ml）与固体原料(g)比例(%)也是超高压提取过程中的一个重要因素，从传质速率的角度看，主要表现在影响固相主体和液相主体之间的浓度差，浓度差则是一种重要的传质推动力。溶剂物料比的大小还会影响两相的混合情况。尤其在搅拌不充分的情况下，会改变表观传质系数，从而影响传质速率。增大溶剂和固体原料的比例可以改善提取的产物从固相表面扩散进入液相主体过程的两相传质，即可以减小外扩散阻力的影响，提高提取率。溶剂物料比小，两相间的浓度差小，从而传质推动力小。准确称取100目的香菇粉5份，每份1g放入到200mL的烧杯中，标号贴上标签，分别加入10，30，50，70，100ml蒸馏水，混合均匀，放入塑料袋中并封口，密封，室温浸泡4h，然后分别将样品放入高压容器内，启动高压油泵，升高到所需的压力，并在此压力下保持一定时间(压力:200MPa；保压时间:2min)；然后快速打开控制高压油路的阀门，在2秒钟之内卸除压力，分别取出高压加工后的样品，去除包装后，抽滤去除滤渣，得到香菇多糖的提取液，将滤液稀释一定的倍数（3倍），取2ml溶液分别加入5%苯酚溶液1ml，摇匀，迅速加入5ml浓硫酸，振摇5min，置沸水浴上加热15min，然后置冷水浴中冷却30min，即以溶剂蒸馏水为空白作对照，在490nm处用分光光度计测吸光值，计算多糖提取率，得到料液比与提取率的关系。5、保压时间选择实验在超高压提取过程中，提取时间也是一个重要参数。由于提取过程中压力较高，溶剂能够在极短的时间渗透到细胞内部，且香菇多糖能够快速达到溶解平衡，时间过长容易使香菇多糖在高温高压下被破坏，因此提取时间较短（几分钟）。准确称取100目的香菇粉5份，每份1g放入到200mL的烧杯中，标号贴上标签，分别加入50ml蒸馏水，混合均匀，放入塑料袋中并封口，密封，室温浸泡4h，然后分别将样品放入高压容器内，启动高压油泵，升高到所需的压力，分别做压力为200MPa、300Mpa的实验，保压时间分别为2，5，10，15，20min；然后快速打开控制高压油路的阀门，在2秒钟之内卸除压力，分别取出高压加工后的样品，去除包装后，抽滤去除滤渣，得到香菇多糖的提取液，将滤液稀释一定的倍数（3倍），取2ml溶液分别加入5%苯酚溶液1ml，摇匀，迅速加入5ml浓硫酸，振摇5min，置沸水浴上加热15min，然后置冷水浴中冷却30min，即以溶剂蒸馏水为空白作对照，在490nm处用分光光度计测吸光值，计算多糖提取率，得到保压时间与提取率的关系。6、浸泡温度高压提取条件下 ，因为存在压力作用下分子的运动 ，温度不需要和传统工艺过程中的一样高 ，加上时间缩短 ，这样可以降低药物成分受热破坏的因素 ，也可以节省能耗。在压力条件相同的情况下 ，温度在一定范围内升高 ，是有利于加快提取速度的。这在小规模提取实验时效果并不是特别明显 ，但在提取规模大时 ，提取速度就非常重要 ，所以温度的影响也是非常重要的。准确称取100目的香菇粉5份，每份1g放入到200mL的烧杯中，标号贴上标签，分别加入40ml蒸馏水，混合均匀，放入塑料袋中并封口，密封，将五个密封袋分别放在10、15、20、25、35、45的水浴锅内恒温4h，然后分别将样品放入高压容器内，启动高压油泵，升高到所需的压力，压力为200MPa，保压时间为2min；然后快速打开控制高压油路的阀门，在2秒钟之内卸除压力，分别取出高压加工后的样品，去除包