动物染色体工程-HXY.ppt

第10章 动物染色体工程,染色体工程(chromosome engineering)是按照人们的需要对生物的染色体进行操作，添加、削减或替换染色体，从而达到定向育种或创造人工新物种的目的。,1,真核细胞染色体的组成,组蛋白：H1、H2A、H2B、H3、H4； 非组蛋白：HMG、DNA结合蛋白 DNA：不重复序列；中度重复序列；高度重复序列 少量的RNA；,从DNA到染色体的包装压缩,DNA链 核小体 螺线管 染色单体 超螺旋 压缩比例：76405 = 8400,（1：7）,（1：6）,（1：40）,（1：5）,Gene Expression,染色体组, 染色体组 染色体组型 染色体倍性,体细胞中的一组非同源染色体，它们在形态和功能上各不相同，但是，携带着控制一种生物生长发育、遗传和变异的全部信息，这样的一组染色体，叫做一个染色体组。,染色体组型是指一个体细胞中全部染色体的数目、大小和形态特征。,染色体倍性是指细胞中包含的染色体组数或基数。,Human mitotic chromosomes and karyotype,染色体组用符号“X”表示,生物体的体细胞染色体数用2n表示，无论是二倍体还是多倍体，2n只表示体细胞的染色体数，并不表示其倍性，如： 玉米体细胞染色体数2n=20， 普通小麦体细胞染色体数2n=42， 要正确表示倍性应写成： 玉米2n=2X=20， 普通小麦2n=6X=42。,符号“n”和“X”的区别与联系,10,生殖细胞的减数分裂,骡 子,母马和公驴的后代,11,12,为什么骡子不能繁殖后代？,马的染色体数是64条，驴的染色体数是62条，马的卵子染色体数是32条，驴的精子染色体数是31条，通过精卵结合发育成的新个体骡子的染色体数是63条。 骡子的染色体联绘紊乱，因此骡子的生殖细胞不能分化发育成完整的个体。,13,骡子生育的概率极低,骡子性成熟以后，再形成精子或卵子时，每条染色体都没有相对应的同源染色体进行配对，这样每一条染色体分到哪个配子里是随机的，在这些配子中，只有配子里的染色体完全来自于马的，或来自于驴的，这样的配子才有生育能力。,14,狮虎兽（liger）,雄狮和雌虎交配产生的后代。狮虎兽的体型比狮或虎都要大，又同时具备两者之间的外貌特征；狮子与老虎相恋、怀孕的概率极低，即使在人工饲养的环境下，虎、狮受孕的机会也仅为1至2。幼兽由于先天不足等原因，成活率仅为五十万分之一左右。据资料显示，目前世界上存活的狮虎兽只有20只左右。,15,狮虎兽（liger）,16,狮虎兽,狮,虎,虎狮兽,17,动物染色体工程,染色体倍性改造 染色体结构改造 人工染色体的利用,18,10.1 动物染色体倍性改造,定义：指有目的、有计划地增加或减少一组或几组同源或异源染色体，以创造动植物新品种的一项染色体工程技术。 主要包括： 多倍体育种 单倍体育种,19,10.1.1 动物的多倍体育种,多倍体（polyploidy）:是指体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体 多倍体产生机制：通过卵细胞第二极体的保留或受精卵早期有丝分裂的抑制而实现,20,10.1.1 动物的多倍体育种,1染色体加倍技术(人工诱导) （1）化学诱导法 秋水仙素 细胞松弛素B （2）物理学方法 1）温度休克法 2）水静压法 (3）生物学方法,21, 1.化学方法,A. 细胞松驰素B(cytochalasin)： 能抑制肌动蛋白聚合成微丝，从而抑制细胞质分裂，使用最早、最广泛，其诱导效果也最突出。 B. 秋水仙素(colchicine)：主要用于植物 阻止细胞分裂过程中的纺缍体的形成，可使染色体正常复制而细胞不发生分裂，从而形成同源多倍体细胞。 C. 其他： N2O 特点：化学药物价格昂贵，有毒性,2.物理学方法,A、 温度休克法 原理：引起细胞内酶构型的变化，不利于酶促反应的进行，导致细胞分裂时形成纺缍丝所需的ATP供应受阻。抑制第二极体的释放，诱导三倍体或四倍体 方法：冷休克法（0-5）和热休克法（30左右） 特点：操作简单，成本低廉，对胚胎发育影响小，有利于养殖场大规模生产使用 适用：冷水鱼类应用热休克法，温水性鱼类用冷休克效果较好 关键：成功阻止第二次成熟分裂和第二极体的排出, 2.物理学方法,B、水静压法 原理：抑制第二极体的排出或第一次卵裂 方法：65kg/cm2 特点：诱导率高（90以上），处理时间短，对受精卵损伤小，成活率高。 需要专门的设备水压机，成本较高，不适于大规模生产。,3. 生物学方法,动物通过杂交方法尤其是种间杂交获得异源多倍体。种间杂交导致第二极体不排出。,草鱼 三角鲂 (2n=48) ( 2n =48) 草鲂杂种 (3n=72),人工诱导三倍体的方法,直接途径，即用物理或化学的方法对受精卵进行处理，阻碍第二极体外排。（即前述的物理法、化学法） 间接途径，即首先诱导获得四倍体，待四倍体个体性成熟后再与二倍体个体交配，从而获得三倍体子代。,26,三倍体 植物,27,28,三倍体 动物,2多倍体的倍性鉴定,（1）直接法 1）染色体计数：是鉴定多倍体的一个准确的直接方法，但比较费时。 2）DNA含量测定：细胞DNA含量测定是倍性鉴定的另一个有效的直接方法。 （2）间接法 1）核体积测量 2）蛋白质电泳 3）生化分析,30,31,3动物多倍体育种的意义,1）多数具有良好的生长率 2）低等动物的种间杂交优势非常明显 3）巨大性 4）育性低(四倍体可育),32,鱼类三倍体育种的意义,三倍体是非偶数染色体组，阻碍了生殖细胞正常的减数分裂，结果导致性腺不能发育。不育的三倍体经济鱼类因为没有性成熟阶段性腺发育的能量损耗，所以有以下优点： 避免了性腺发育阶段和产卵季节鱼肉质量下降并延长了上市时间 避免了性腺发育阶段的生长停滞和死亡率增加 缩短了养殖周期，减少了养殖成本并可养成大型个体,33,利用三倍体鱼类不育性的优点，人们可以达到这样的目的：, 获得生长速度较快的三倍体品种，提高鱼类养殖的经济效益 控制养殖鱼类的过度繁殖和防止对天然资源的干扰,34,湘云鲫由湖南师范大学生命科学学院刘筠院士培育,35,36,Triploid Grass Carp三倍体草鱼,37,10.1.2 动物的单倍体育种,1人工单性生殖 （1）雌核发育gynogenesis dindenisis （2）雄核发育androgenesis ndrdenisis,38,10.1.2 动物的单倍体育种,1.雌核发育：指精子虽然能正常地钻入卵子中并激活卵子，但精子的细胞核并未参与卵球的发育，胚胎的发育仅在母体遗传物质的控制下进行。 方法：经遗传失活的动物精子刺激而使卵子发育为正常的二倍体动物。,39,抑制第二极体外排,抑制第一次卵裂,精子遗传物质失活,40,Haploid embryos are generated by mock-fertilizing eggs with UV-irradiated sperm (which cannot contribute genetically), and can survive a few days. Haploids can be rescued by suppressing formation of the polar body with pressure treatment shortly after fertilization.,41,朱 洗,细胞学家。浙江临海人。1931年获法国国家博士学位。中国科学院实验生物研究所所长。长期从事两栖类、鱼类、家蚕等动物卵子成熟、受精等研究 。 1961年使人工雌核发育的雌蟾蜍与雄蟾蜍交配，繁殖出没有外祖父的蟾蜍，证明了单性生殖的高等动物仍保有传代的能力。,42, 雌核发育的意义,雌核发育具有产生单性种群的能力 迅速地产生同源型二倍体克隆 可通过克隆自交，即以激素致使性逆转为雄性，再与同胞姐妹交配，获得强壮的纯系同型配子二倍体，然后借助于雌核发育，产生新的纯系来筛选除去有害的等位基因，以改良近亲繁殖系,10.1.2 动物的单倍体育种,2.雄核发育：用经过紫外线、X线或线处理的卵子与正常的精子受精，再在适当时间施以冷、热或高压等物理处理，使进入卵子内的精子染色体加倍，而发育成完全为父本性状的二倍体。 定义：遗传失活的卵子与精子结合，发育成只有父本染色体个体的一种特殊生殖方式。,44,人工诱导雌核发育的方法,（1）精子遗传物质的失活 辐射处理（紫外线）、 化学物质、 直接去除受精卵中的雄性原核 （2）细胞分裂的阻止（雌核染色体二倍化） 温度休克、静水压力、化学抑制剂处理,45,Heat-shock treatment to activated/fertilized eggs of Indian major carps to induce diploid gynogenesis/polyploidy respectively,热休克,46,人工诱导雌核发育的方法,（3）雌核发育的鉴别 鉴别雌核发育的个体，通常以颜色、形状和生化等方面的指标为根据。 目前，还采用细胞学和遗传标记的方法,47,10.2 动物染色体结构的改造,染色体片段的删除和重排 染色体的易位工程,48,染色体结构变异,易位：一个染色体上某一区段跟另一非同源染色体上的区段发生互换 缺失：染色体的某一区段及带有的基因一起丢失 倒位：染色体上某一区段连同它带有的基因顺序发生180度倒转 重复：一个染色体上增加了相同的某个区段。,10.3 人工染色体,人工染色体 酵母人工染色体 细菌人工染色体 哺乳类人工染色体 人工染色体的应用,50,人工染色体,染色体要确保在细胞分裂中保持稳定性，必须要能够自我复制和向子细胞中平均分配，需要3个关键序列： 1.自主复制DNA序列（ARS） 是DNA复制的起点，确保染色体能够开始自我复制。 2.着丝粒DNA序列（CEN） 确保染色体在细胞分裂时能平均分配到子细胞中。 3.端粒DNA序列（TEL） 使DNA能结束复制，确保染色体的独立性和稳定性。,51,人工染色体,定义：人工构建的含有复制起始点、着丝粒和端粒三个关键序列的载体系统。,52,现正在研究的人工染色体有三种： 酵母人工染色体（克隆容量105-1010bp） （yeast artificial chromosome, YAC） 细菌人工染色体（常用于克隆约300bp片段） （bacterial artificial chromosome, BAC） 哺乳类人工染色体 （mammalian artificial chromosome, MAC）,53,YAC 载体基本序列元件： 酵母染色体DNA自主复制顺序（ARS）： 负责DNA复制 酵母染色体的着丝粒顺序（CEN）： 保证酵母细胞分裂时染色体的分配 酵母染色体的端粒顺序（TEL）： 维持染色体结构的稳定性（两端各一个） 选择标记：用于重组克隆的筛选 pYAC4是一个大肠杆菌穿梭质粒，含有Amp大肠杆菌筛选标记,YAC重组载体构建示意图,完整的染色体DNA的提取 基因组DNA酶切大片段的获取 YAC载体臂的制备 YAC臂与目的DNA大片段的连接 YAC重组体对酵母的转化 YAC基因库的鉴定 目的基因YAC克隆的筛选 目的基因YAC克隆的鉴定,YAC克隆技术流程,YAC的主要用途是： (1)YAC可容纳大片段的外源DNA ，而且在构建基因组文库时需要较少的克隆。 (2)用YAC克隆构建的物理图谱在复杂的生物基因组分析和DNA测序中发挥着重要作用。目前，用YAC提供大片段DNA构建染色体图谱的技术已在人类、植物、昆虫、鸟类、两栖类等动物中得到广泛应用，相比于早期的DNA片段载体，YAC是容纳大片段外源DNA的首选载体。 (3)在基因功能研究中，基因嵌入及转基因技术都采用了YAC克隆系统。通过YAC嵌入的基因不仅片段长，而且嵌入的基因更适于体内表达，并有利于基因保持其固有的空间构象和功能的发挥。,YAC的缺点：,1、插入片段大，稳定性较差，不易操作 2、插入的大片段常发生缺失，使文库不完整 3、YAC与酵母天然染色体分子结构相似分离时难与天然染色体分开 4、文库中的嵌合现象严重 5、因插入片段大，往往发生序列重排，造成序列错乱。,细菌人工染色体（BAC）,新一代BAC载体为7.4kb的环状质粒，主要结构有： F因子的parA，parB，parC基因 保证低拷贝的BAC质粒在大肠杆菌分裂时均匀分配到子代细胞。 起始oriS基因 严密控制，决定低拷贝数和复制起始 解旋酶基因repC 易于DNA复制和决定复制方向,选择标志基因Cmr 氯霉素抗性基因 lacZ基因 颜色鉴别重组子，外源基因插入其中 loxP和cosN位点 易于克隆DNA回收和操作,BAC的特点： 宿主中只有1-2个拷贝 插入片段不易变化，稳定遗传 避免嵌合现象 转化效率高 主要用于300bp一下DNA克隆,60,哺乳类人工染色体（MAC）,以哺乳动物细胞为宿主的人工染色体。,61,YAC和MAC应用于基因治疗领域是一种理想的基因转移新载体，有以下优点： 1）可携带的外源基因容量大，包装容量可达500600kb，可以满足几乎所有的单个基因的基因组DNA的需要。 2）可以携带较长片段的基因表达调控顺序，能够较好地调节基因表达水平以及基因的靶向表达。 3）外源基因存在于人工染色体中，可以不整合到细胞基因组中，因而不会激活原癌基因或使其它有功能基因失活，而且理论上能够在细胞中较稳定地存在。,人