《核酸的生物合成》PPT课件.ppt

核酸的生物合成,第一节 DNA的生物合成 第二节 RNA的生物合成 第三节 基因工程的简介,DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过DNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自DNA转录给RNA,然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。,中 心 法 则,1964-1970 劳氏肉瘤病毒的 遗传方式 致癌RNA病毒,1958年，遗传信息的单向,中心法则的遗传流向有5条途径 1、DNADNA：DNA复制 （以DNA为模板合成DNA） 2、RNA RNA：RNA复制 （以RNA为模板合成RNA） 3、DNA RNA：DNA转录 （以DNA为模板合成RNA） 4、RNA DNA：反(逆)转录 （以RNA为模板合成DNA） 5、RNA Protein：翻译,复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。 转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则将其所 含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。 翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的AA顺序的过程。 逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。,第一节 DNA的生物合成,一、DNA的半保留复制 二、与DNA复制有关的酶和蛋白质 三、DNA的复制过程 四、逆转录 五、DNA的损伤修复,一、DNA的半保留复制 定义：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制 半保留复制的实验证据:1958年Meselson和Stahl用同位素15N标记大肠杆菌DNA,首先证明了DNA的半保留复制。,15N-DNA的密度大于14N-DNA的密度,DNA的半保留复制的生物学意义：,DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。 DNA在代谢上的稳定性并非指DNA是一种惰性物质。,二、与DNA复制有关的酶和蛋白质 原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、 dCTP、dTTP) 模板：以DNA的两条链为模板链，合成子代DNA。 引物：一小段RNA(或DNA）为引物，在大肠杆菌 中，DNA的合成需要一段RNA链作为引物。,催化因子 1.引物合成酶（引发酶）：此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物（Primer)。实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。 2.DNA聚合酶:以DNA为模板的DNA合成酶，其催化反应的特点 （1）以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物；（2）反应需要有模板的指导；（3）反应需要有3-OH存在； （4）DNA链的合成方向为5 3 ,生物大分子合成： 底物、酶、 能量、模板,（5） DNA聚合酶的反应可以利用DNA双链作为模板和引物，亦可以单链DNA作为模板和引物,（6）DNA的体外聚合必须加入少量的DNA才能进行。DNA在提取过程中易形成切口（nick）或缺口（gap）.则加入的DNA一条链作为模板而另一条链可作为引物。,原核生物中的DNA聚合酶,在大肠杆菌中发现有三种DNA聚合酶（用突变株研究其功能）： DNA聚合酶:单体酶,多肽链内含一个锌原子（其鳌合剂是O-二氮杂菲），多功能酶。它具有5 3 聚合酶功能（对脱氧核苷酸的选择）； 3 5外切酶活性（对双链无作用，校对功能。但在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链）及5 3外切酶活性（双链有效，主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA复制时RNA引物切除及其空隙的填补）；在DNA链的3 形成焦磷酸键（生理意义不大）；无机焦磷酸盐与dNTP之间的焦磷酸基交换。 DNA聚合酶：多亚基酶，聚合作用，但聚合活力很低；具有3 5外切酶活性。其它生理功能尚不清楚，可能在修复紫外光引起的DNA损伤中起作用。, DNA聚合酶：是原核生物DNA复制的主要聚合酶，该酶由10种亚基组成，其中、形成全酶的核心酶。具有53DNA聚合酶活性（ 亚基，速率高）； 具有3 5外切酶（亚基）的校对功能，提高DNA复制的保真性；还具有5 3外切酶活性（单链有效，其意义未知）。 （4） DNA聚合酶IV和V：1999年发现，当DNA严重损伤时，诱导产生。,DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 亚基数目 1（单体酶） 1（多亚基酶 ） 1（多亚基酶） 5 3聚合活性 + 中 + 很低 + 很高 3 5外切活性 + + + （保护DNA复制的 忠实性） 5 3外切活性 + - -,主要是对DNA损伤的修复；以及在DNA复制时切除RNA引物并填补其留下的空隙。,修复紫外光引起的DNA损伤,DNA 复制的主要 聚合酶，还具有3-5 外切酶的校对功能，提高DNA复制的保真性,在真核细胞内有五种DNA聚合酶 （与细菌DNA聚合酶的性质基本相同：底物、模板、引物、方向） 定位 细胞核 细胞核 线粒体 细胞核 细胞核 3-5 外切 - - + + + 酶活性 功能,引物 合成,修复 作用,线粒体DNA 的复制,核DNA 的复制,修复 作用,3 .DNA连接酶（1967年发现）：若双链DNA中一条链有切口，一端是3-OH，另一端是5-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。 但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来。 大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量，在高等生物和噬菌体中，则要求ATP提供能量。T4噬菌体的DNA连接酶不仅能在模板链上连接DNA和DNA链之间的切口，而且能连接无单链粘性末端的平头双链DNA。,连接酶的反应机制： 酶 + NAD+(ATP) 酶-AMP + 烟酰胺单核苷酸（PPi） 酶-AMP + P-5-DNA 酶 + AMP-P-5-DNA DNA-3-OH + AMP-P-5-DNA DNA-3-O-P-5-DNA+AMP DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用作用,拓扑异构酶：使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。,拓扑异构酶：使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量，同复制有关。 二者共同控制DNA的拓扑结构。 5、解螺旋酶 （解链酶）：通过水解ATP将DNA两条链打开。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。,4. 拓扑异构酶：催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶，在DNA重组修复和其他转变方面起重要作用。 除连环数不同外其它性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体，引起拓扑异构体反应的酶称为拓扑异构酶,6.其它蛋白因子：,rep蛋白沿3 5移动，而解螺旋酶I、II、III沿5 3移动。,三、DNA的复制过程：（以大肠杆菌为例） 双链的解开 RNA引物的合成 DNA链的延伸 切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段,1、双链的解开,一些概念： DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。常用ori(或o）表示。许多生物的复制原点都是富含A、T的区段。 大肠杆菌染色体DNA以及真核生物的细胞器DNA为双链环状，只有一个复制原点，而真核生物染色体DNA是线性双链分子，含有许多复制起点。 从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子（基因组独立进行复制的单位）。,复制原点由DnaA蛋白识别， 在原点由DnaB蛋白（解螺旋酶）将双螺旋解开成单链状态，分别作为模板，合成其互补链(DNA双链的解开还需DNA拓扑异构酶 、 SSB),在原点处形成一个眼状结构，叫复制眼。 DNA复制进行时，在眼的两侧出现两个叉子状的生长点(growth point)，叫复制叉。在复制叉上分布着各种与复制有关的酶和蛋白因子，它们构成的复合物称为复制体（replisome）,DNA的双向复制,(1)复制的起始, 互相缠绕的双链母本DNA，复制从特定的位置(复制原点Ori or O)开始，该位置常是富含A、T区段。,首先DNA解螺旋酶(DnaB)打开局部双链，SSB与每条单链结合,稳定单链并防止DNA复性;然后在DNA旋转酶（TOP)的作用下，使螺旋DNA局部变成松弛态。,起始因子、引物酶、DNA聚合酶等随后结合，复制开始。,引发体在复制叉上移动，沿模板链5 3的方向移动，与复制叉移动的方向相同，识别合成的起始位点， DnaB蛋白活化引物合成酶。引发RNA引物的合成。领头链先引发开始合成，以原来一条DNA单链为模板（3 5),按5 3的方向合成一段RNA引物链。领头链开始合成后，随后链也开始合成其引物。引物长度约为几个至10个核苷酸，在引物的5端含3个磷酸残基（引物酶的底物是核苷三磷酸），3端为游离的羟基。,（2）RNA引物的合成,在DNA聚合酶的催化下，以四种脱氧核糖核苷5-三磷酸为底物，在RNA引物的3端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。DNA链的延伸同时进行领头链和随后链的合成。两条链方向相反。,（3）DNA链的延伸,领头链在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链。 随后链在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DNA链。 半不连续复制在DNA复制时，领头链是连续合成的,而随后链的合成是不连续的，这种复制方式称为半不连续复制。 发现（1968）： 同位素实验，3HdT 短时间内为DNA小片段一段时间后检测到 DNA大片段。当用DNA连接酶的变异株时，检测到大量DNA片段的积累。证明DNA复制中有小片段合成。,冈崎片段 在DNA复制过程中，领头链能连续合成，而随后链只能是断续的合成53 的多个短片段，这些不连续的小片段以其发现者的名字命名为冈崎片段。 冈崎片段：真核生物中100-200个核苷酸（核小体的DNA单位）。原核生物中1000-2000个核苷酸（相当于一个顺反子）。,参与链的延伸阶段的蛋白质和酶,均以5/3/方向形成前导链和滞后链,当新形成的冈崎片段延长至一定长度，其3-OH端遇到上一个冈崎片段时即停止合成。复制叉移动到终止区即停止复制（大肠杆菌有一个终止区）。这时会发生一系列变化：在DNA聚合酶催化下切除RNA引物；留下的空隙由DNA聚合酶催化合成一段DNA填补上；在DNA连接酶作用下，连接相邻的DNA链；修复掺入DNA链的错配碱基；以修复方式填补终止区50-100bp的空缺。这样以两条亲代DNA链为模板，各自形成一条新的DNA互补链。结果是形成了两个DNA双股螺旋分子。,（4）切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段（复制终止）,真核生物中DNA的复制特点,1、真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双向复制，多复制子。 2、冈崎片段长约200bp. 3、真核生物DNA复制速度比原核慢。 4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。 5、真核生物有多种DNA聚合酶。 6、真核生物线性染色体两端有端粒结构，防止染色体间的末端连接。由端粒酶负责新合成链5RNA引物切除后的填补，亦保持端粒的一定长度。,端粒酶是含RNA的逆转录酶,DNA复制的其它方式,大肠杆菌双链环状DNA的复制（一个复制起点，双向复制） 真核细胞线状染色体DNA的复制方式（多个复制起点，双向复制） 单向滚环式复制（噬菌体X174DNA单链环状）,D-环式复制方式（线粒体双链环状DNA：两条链的复制起点不同位置，且复制不同步）,定义:以RNA为模板，按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA称为逆转录，由逆转录酶催化进行。 1970年Temin和Baltimore同时分别从劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中分离出逆转录酶，迄今已知的致癌RNA病毒都含有逆转录酶。 用特异抑制物（放线菌素D）能抑制致癌RNA病毒的复制，而对一般RNA病毒的复制无影响。已知放线菌素D专门抑制以DNA为模板的反应，可见致癌RNA病毒的复制过程必然涉及到DNA。所以Temin于1964年提出前病毒的假说。,四、逆转录,病毒RNA的逆转录过程 （以前病毒形式引起整合到宿主细胞DNA中而使细胞恶性转化） 单链病毒RNA RNA-DNA杂交分子 双链DNA（前病毒）,逆转录酶是多功能酶，兼有3种酶的活性： RNA指导的DNA聚合酶活性 DNA指导的DNA聚合酶活性 核糖核酸酶H的活性，专一水解RNA-DNA杂交 分子中的RNA，可沿53和3 5两个方向起核 酸外切酶的作用。,逆转录酶也和DNA聚合酶一样，沿53方向合成DNA，并要求短链RNA作引物。,cDNA：几乎所有真核生物mRNA分子的3末端都有一段polyA,当加入寡聚dT作为引物时，mRNA就可作为模板，在逆转录酶催化下在体外合成与其互补的DNA，称为cDNA。,逆转录酶发现的理论和实践意义： 不能把“中心法则”绝对化，遗传信息也可以从RNA传递到DNA。促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究，为肿瘤的防治提供了新的线索。目前逆转录酶已经成为研究这些学科的工具。,1983年，发现人类免疫缺陷病毒（human immune deficience virus,HIV）,感染T淋巴细胞后即杀死细胞，造成宿主机体免疫系统损伤，引起艾滋病（ acquired immunodeficiency syndrome,AIDS）,五、DNA的损伤修复 DNA的损伤：DNA在复制时产生错配、病毒基因整合；某些物化因子如紫外光、电离辐射和化学诱变等，破坏DNA的双螺旋结构。从而影响DNA的复制，并使DNA的转录和翻译也跟着变化，因而表现出异常的特征（生物突变）。 若DNA的损伤或错配得不到修复，会导致DNA突变。其主要形式： 一个或几个碱基被置换 插入一个或几个碱基 一个或多个碱基对缺失 DNA的损伤修复 四种修复途径:光复活、切除修复、复组修复和诱导修复（亦称暗修复）。,光复活：400nm左右的光激活光复活酶，专一分解紫外光照射引起的同一条链上TT（CC CT）二聚体。（包括从单细胞生物到鸟类，而高等哺乳动物无） 切除修复：将DNA分子中的受损伤部分切除，以完整的那条链为模板再重新合成。特异内切酶、DNA聚合酶、 DNA外切酶、DNA连接酶均参与。（发生在DNA复制前） 重组修复 （发生在复制后）：复制时，跳过损伤部位，新链产生缺口由母链弥补，原损伤部位并没有切除但在后代逐渐稀释。P349 诱导修复：造成DNA损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应（SOS response）。此过程诱导产生切除修复和重组修复中的关键蛋白和酶，同时产生无校对功能的DNA聚合酶。所以会有2种结果：修复或变异（进化）。,第二节 RNA的生物合成,一、RNA聚合酶 二、RNA的转录过程 三、转录后加工 四、RNA的复制,一、概念 转录：以DNA的一条链为模板在RNA聚合酶催化下，按照碱基配对原则，合成一条与DNA链的一定区段互补的RNA链的过程称为转录。 以四种核糖核苷三磷酸酸（NTP）为底物，形成3、5 -磷酸二酯键相连接。 转录的不对称性：在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。 反义链（无意义链，负链）：在RNA的转录中，用作模板的DNA链称为反义链。 有义链（编码链，正链）在RNA的转录中，不作为模板的DNA链称为有义链。,RNA聚合酶：大肠杆菌的RNA聚合酶全酶由5种亚基2 组成，因子与其它部分的结合不是十分紧密，它易于与2分离，没有、 亚基的酶称为核心酶只催化链的延长，对起始无作用。 五种亚基的功能分别为： 亚基：与启动子结合功能。 亚基：含催化部位，起催化作用，催化形 成磷酸二酯键。 亚基：在全酶中存在，功能不清楚。 亚基：与DNA模板结合功能。 亚基：识别起始位点。,一、 RNA聚合酶,真核细胞的RNA聚合酶,酶类,分布,产物,-鹅膏蕈碱 对酶的作用,分子量,反应条件,I,核仁,核质,核质,rRNA 5.8SrRNA 18SrRNA 28SrRNA,mRNA,tRNA 5SrRNA,不抑制,低浓度抑制,高浓度抑制,500 000 700 000,700 000,_,低离子强度,要求Mg2+或Mn2+,高离子强度,高Mn2+浓度,RNA聚合酶的特点：,1、反应底物：NTP，DNA为模板、Mg2+促进聚合反应。 RNA聚合酶不需要引物，合成方向53 。 2、真核生物与原核生物的RNA聚合酶结构不同（具体 说明）。 3、利福平抑制原核生物RNA聚合酶活性；-鹅膏蕈碱 抑制真核生物RNA聚合酶活性。,RNA的转录过程：（以大肠杆菌为例） 起始位点的识别 转录起始 链的延伸 转录终止,二、RNA的转录过程,（1）起始位点的识别,RNA的合成不需要引物。体外实验证明，不含亚基的核心酶会随机地在一个基因的两条链上启动，当有亚基时就会选择正确的起点。 亚基起着识别DNA分子上的起始信号（启动子指RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列）的作用。启动子的结构至少由三部分组成：-35序列提供了RNA聚合酶全酶识别的信号；-10序列是酶的紧密结合位点（富含AT碱基，利于双链打开）；第三部分是RNA合成的起始点。,（2）转录起始,RNA聚合酶全酶扫描解链区，找到起始点，然后结合第一个核苷三磷酸。加入的第一个核苷三磷酸常是GTP或ATP，很少是CTP，不用UTP。所形成的启动子、全酶和核苷三磷酸复合物称为三元起始复合物，第一个核苷三磷酸一旦掺入到转录起始点， 亚基就会被释放脱离核心酶。,因子仅与起始 有关，RNA的合 成一旦开始， 便被释放,（3）RNA链的延伸,DNA分子和酶分子发生构象的变化，核心酶与DNA结合比较松弛，可沿DNA模板移动，并按模板顺序选择下一个核苷酸，将核苷三磷酸加到生长的RNA链的3-OH端，催化形成磷酸二酯键。转录延伸方向从5 3,（4）转录终止,在DNA分子上（基因末端）提供转录停止信号的DNA序列称为终止子（terminators),它能使RNA聚合酶停止合成RNA并释放出RNA。,需要因子（终止因子，协助RNA聚合酶识别终止信号）帮助， 因子能与RNA聚合酶结合但不是酶的组分，它的作用是阻止RNA聚合酶向前移动，于是转录终止，并释放出已转录完成的RNA链。,不依赖于因子。强终止子序列有两个明显的特征：（ 1 ）在终止点之前具有一段富含G-C的回文区域。（2）富含G-C的区域之后是一连串的dA碱基序列，它们转录的RNA链的末端为一连串U（连续6个）。,有些终止子的作用可被特异的因子所阻止，使酶得以越过终止子继续转录，称为通读（ readthrough）,能够引起抗终止作用的蛋白质称为抗终止因子（antitermination factors）,RNA生物合成的抑制剂,1、嘌呤和嘧啶类似物：人工合成的碱基类似物能够抑制和干扰核酸的合成。如,SH,SH,作为代谢拮抗物抑制 合成酶类或直接掺到核酸 分子中，形成异常RNA 或DNA。,2、DNA模板功能的抑制物：可以与DNA模板结合，抑制其复制和转录,（1）烷化剂：使DNA发生烷基化，发生在G-N7，A-N1、N3 N7 ；C-N1。易引起嘌呤的水解，在DNA上留下空隙干扰复制或转录；或引起碱基错配。 （2）放线菌素：放线菌素D与DNA形成非共价的复合物，抑制其模板功能（低浓度抑制转录，较高浓度抑制复制）。具有类似作用的还有色霉素A3 、橄榄霉素、光神霉素。 （3）嵌入染料：可插入双链DNA分子相邻的碱基对之间，一般具有芳香族发色团。溴化乙锭（EB）是一种高灵敏的荧光试剂，常用来检测DNA和RNA。与DNA结合后抑制其复制和转录。,3、RNA聚合酶抑制物,（1）利福霉素：抑制细菌RNA聚合酶活性。利福平可以高效抑制结核杆菌，杀死麻疯杆菌，在体外有抗病毒作用。 （2）利链霉素：与细菌RNA聚合酶亚基结合，抑制转录过程中RNA链的延长反应。 （3）-鹅膏蕈碱：抑制真核生物RNA聚合酶活性。,三、RNA的转录后加工 在细胞内，由RNA聚合酶合成的原初转录物（primary transcript）往往需要一系列的变化，包括链的裂解、5和3末端的切除和特殊结构的形成、核苷的修饰、以及拼接和编辑等过程，才转变为成熟的RNA分子。此过程总称为RNA的成熟或称为RNA的转录后加工。,1、mRNA前体的加工： 原核生物的mRNA转录后一般不需要加工，转录的同时即进行翻译（半寿期短）。亦有少数多顺反子的mRNA需要核酸酶切成小单位，然后再翻译。 真核生物mRNA（半寿期较长）原初转录物很大，在加工过程中形成许多分子大小不等的中间物，它们被称为核内不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA,hnRNA)，需要进一步进行加工修饰转化为mRNA。加工包括： （1）hnRNA被剪接，把内含子（DNA上非编码序列）转录序列剪掉，把外显子（DNA上的编码序列）转录序列拼接上(