西妥昔单抗联合热疗与放疗诱导CMTTC医学继续教育项目.ppt

西妥昔单抗联合热疗与放疗诱导人鼻咽癌细胞株CNE凋亡实验研究,麻发强 黄勇攀 贵阳医学院第二附属医院 贵阳医学院,西妥昔单抗(Cetuximab) 是一种特异性针对EGFR的单克隆抗体，与EGFR结合可阻断其自身受体相关激酶的活化与磷酸化以及有丝分裂信号的下传，抑制肿瘤细胞的增殖、生长和诱导凋亡。,前 言,2006年美国FDA批准C225作为二线方案治疗失败的晚期头颈部鳞癌。但对鼻咽癌治疗中的作用还需要进一步的探讨。 本实验主要研究西妥昔单抗联合热疗与放疗诱导人鼻咽癌细胞株凋亡的效果和可能的机制。,前 言,一、材料与方法,细胞培养 人鼻咽癌细胞株CNE购于中国科学院上海细胞库，培养于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液中培养48h，37恒温，5CO2, 95湿度环境中传代培养。,试验分组 细胞胞培养48h后随机组；先加入工作浓度（10g/ml）的西妥昔单抗0.5l，48h后照射，放疗12Gy照射剂量。再行43热疗30min，后37继续培养24小时和48小时。,实验分组,Hochest 33258荧光染色法观察细胞凋亡,将干净无菌的盖玻片置于30mm2培养皿，接种细胞过夜；当50%80%满时，同前述处理；24h后吸尽培养液，PBS洗两遍；固定液固定后用Hochest33258(5mg/L)染色；双蒸水冲洗，封片；荧光显微镜下观察并随机拍照。,流式细胞术检测各组CNE的凋亡率,取对数生长期的CNE细胞，每25cm2的培养瓶接种2106个细胞，每组设3个平行样本，分别经规定的处理因素处理后，消化收集细胞，用 Binding 缓冲液 400l重悬，调整细胞密度为 1106/ml；加入5l Annexin V-FITC，混匀，4避光孵育15min；加入10lPI染液（20g/ml），4避光孵育 5min 后上流式细胞仪检测，继续培养24h和48h后应用流式细胞仪检测细胞凋亡。,Western Blot分析Bax、Bcl-2蛋白的表达,加含PMSF裂解液冰上裂解30min提取蛋白，4 12000rpm离心5min，取上清，蛋白定量后调整至浓度相同，95变性5min，8%聚丙烯胺凝胶电泳2h，后转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1h。 一抗（分别为1：200稀释的Bax、Bcl-2、-actin抗体)4过夜，TBST洗膜3次（每次5min）。,Western Blot分析Bax、Bcl-2蛋白的表达,二抗(1：500稀释羊抗鼠IgG-AP)室温孵育1h，TBST洗膜3次（每次5min），AP显色，运用图像分析仪对结果进行图像分析，计算条带的积分吸光度，以Actin水平作为等量蛋白上样参照。 Bax和Bcl-2蛋白的测定，每组重复四次，以均值代表测定结果。,统计学方法,实验结果用SPSS16.0 统计软件分析，结果以均值标准差(mean S.D)表示，两组间比较采用配对资料t检验；多组间比较采用单因素方差分析Student-Newman-Keuls检验。P0.05表示差异有统计学意义。,二、结 果,结 果,1、荧光染色法观察细胞凋亡形态学改变（400）,A:对照组 B：单纯放疗组,b,C:放疗+热疗组,D:放疗+西妥昔单抗,E:放疗+热疗+西妥昔单抗,2、AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率结果,联合应用AnnexinV-FITC和PI对培养体系中的细胞进行染色，AnnexinV(-)/PI(-)代表健康活细胞，AnnexinV(+)/PI(-)代表早期凋亡细胞，AnnexinV(+)/PI(+)代表晚期凋亡和坏死细胞。 本实验经处理后，主要观察AnnexinV(+)/PI(-)的早期凋亡细胞。,2、AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率结果,A：对照组 B：单纯放疗组 C：放疗+热疗组,D：放疗+西妥昔单抗组 E：放疗+热疗+西妥昔单抗组,2、AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率结果,#表示与对照组比较，P0.05； 表示与单放组、放+热组、放+西组比较，P0.01；表示与24h比较，P0.05,表1：西妥昔单抗联合放疗与热疗诱导CNE细胞凋亡效果分析,3、 Western Blot分析Bax、Bcl-2蛋白的表达,为了检测不同处理因素作用CNE后24h的Bax、Bcl-2蛋白表达情况：与单放组、放疗+热疗组比较，放疗+西妥昔单抗和放+热+西妥昔单抗联合治疗组Bax蛋白表达有差异（P0.05）；与单放、放疗+热疗放疗+西妥昔单抗比较，放+热+西妥昔单抗联合治疗组下调Bcl-2蛋白表达作用显著（P0.05）（图3）,3、 Western Blot分析Bax、Bcl-2蛋白的表达,-action（42KD）,Bax (20KD),Bcl-2 （ 26KD）,3、Western Blot分析Bax蛋白的表达,#,*,#表示放疗+西妥昔与单放组和放热组比较，P0.05； *表示综合治疗组与单放组、放+热组、放+西组比较，P0.05，,3、Western Blot分析Bcl-2蛋白的表达,*,*表示综合治疗组与单放组、放热组、放+西组比较，P0.05，,三、讨 论,讨 论,肿瘤的分子靶向治疗是当今肿瘤研究中的热点，其中EGFR在包括鼻咽癌在内的多种肿瘤中存在高表达和异常激活1。 西妥昔单抗作为一种人鼠嵌合型抗体。与EGFR结合可抑制由内源性配体引起的EGFR活化，细胞周期中G1停止，细胞增殖减少，凋亡增加，血管生成减少，侵袭力、转移能力降低。,讨 论,Curran D等报道单用西妥昔单抗与放疗联合都取得了理想的抗肿瘤效果6， Feng FY等报道证实单用西妥昔单抗与放疗联合对头颈部肿瘤细胞有放疗增敏作用7。,讨 论,热疗是公认的“绿色治疗”，几乎无副作用，是临床上重要的辅助治疗方法之一。近年来，通过与化放疗联合，热疗作为一种辅助的抗肿瘤手段日益受到人们重视。,讨 论,西妥昔单抗诱导肿瘤细胞凋亡、扰乱肿瘤细胞增殖动力学，使细胞周期停滞在对放疗相对敏感的G1期，而使对放疗抗拒的S期细胞减少，从而增加细胞的放疗敏感性9。热疗诱导肿瘤细胞凋亡10，可抑制放疗引起的亚致死损伤及潜在致死损伤的修复11；热放疗协同。,讨 论,本实验序显示：放疗、放+热、放+西妥昔单抗或放+热+西妥昔单抗治疗后可出现CNE细胞形态学改变，引起凋亡，尤其靶放热三者联合形态学改变最为显著； 流式细胞凋亡检测显示：联合治疗组的凋亡率均显著高于单放、放+热、靶放组，表明三者在诱导鼻咽癌细胞凋亡的过程中有较好的协同作用。,讨 论,在细胞凋亡调控过程中，采用分子生物学手段检测了促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2的表达。 结果显示：各干预组Bcl-2蛋白表达均有不同程度的下降，这就说明放疗、放疗+热疗、靶疗+放疗及靶+放+热疗治疗能够抑制，但以靶+