大肠杆菌基因工程-9.22.ppt

,基因表达系统,第五章 外源基因的表达,一、大肠杆菌基因工程 二、酵母杆菌基因工程 三、哺乳动物基因工程 四、高等植物基因工程 五、外源基因表达产物的分离纯化,一、大肠杆菌基因工程,E.coli作为表达外源基因受体菌的特征 外源基因在E.coli中高效表达的原理 E.coli基因工程菌的构建策略 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 利用重组E.coli生产人胰岛素,（一）E.coli作为表达外源基因受体菌的特征,E.coli表达外源基因的优势：,全基因组已测序，共有4,405个开放阅读框架，大部分基因生物学功能已鉴定；,基因克隆表达系统成熟完善；,繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定；,被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。,E.coli表达外源基因的劣势：,缺乏对真核生物蛋白质的翻译后加工修饰系统，如糖基化、磷酸化；,缺乏对真核生物蛋白质的复性功能，表达产物多以无活性的包涵体形式存在；,内源性蛋白酶易降解空间构象不正确的异源蛋白，造成表达产物不稳定；,细胞周质内含有种类繁多的内毒素，痕量内毒素即可导致人体热原反应。,（二）外源基因在E.coli中高效表达的原理,强化蛋白质生物合成 抑制蛋白质产物降解 恢复蛋白质特异性空间构象,启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数,强化蛋白质生物合成,1、启动子(promoter, P),启动子：位于结构基因上游，能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列，长40-60bp 。,因此，E.coli表达载体所用的启动子必须是E.coli启动子。,没有启动子，基因就不能转录。 E.coli的RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子。,位于转录起始点上游35bp处，由10bp组成，5-TGACA。,E.coli启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成：,位于转录起始点上游5-10bp处，由6-8bp组成，5-TATAAT，富含A和T，又称TATA盒。,-10区：,-35区：,-35区与RNA聚合酶s亚基结合 -10区与RNA聚合酶的核心酶结合,-10区和-35区的碱基组成及其间隔序列。,启动子和外源基因转录起始点之间的距离。,启动子是控制外源基因转录的重要元件，mRNA生成速率与其强弱密切相关。,-10和-35区与保守序列（5-TATAAT、5-T GACA）相似度越高，启动子活性越强。,-10和-35区的间距越接近17bp，启动子活性越强。,-10区和-35区的碱基组成及其间隔序列：,大多数E.coli启动子与所属基因转录起始点之间的距离是6-9bp，但对外源基因而言，这个距离范围未必最佳。,启动子和外源基因转录起始点之间的距离：,1）启动子最佳距离的探测,目的基因,E,E,A,E,E,启动子,A酶切开,Bal31酶解,目的基因,将目的基因插在一个强启动子下游，若克隆菌内检测不到mRNA，有必要考虑调整启动子与基因之间的距离。,2）启动子的筛选：,探针质粒pKO1的报告基因： 半乳糖激酶基因galK,终止子,Ampr,ori,无启动子 的galK,pKO1 3.9 kb,3）启动子的构建：,-35 区序列,-10 区序列,启动子 来 源,Plac Ptrp PL PrecA Ptac,T T T A C A T T G A C A T T G A C A T T G A T A T T G A C A,T A T A A T T T A A C T G A T A C T T A T A A T T A T A A T,Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac 双Plac串联 = 2.4 Plac,乳糖操作子 色氨酸操作子 噬菌体早期操作子 recA基因 Ptrp-35区 + Plac-10区,4）启动子的可控性：,外源基因的全程高效表达，会对E.coli的生理生化过程造成不利影响。,外源基因持续高效表达的重组质粒，在细胞若干次分裂后，会部分甚至全部丢失，导致重组菌不稳定。,措施：,利用可控性启动子，调整外源基因的表达时序，通过启动子活性的定时诱导，将外源基因的转录启动限制在受体细胞生长的某一特定阶段。,目前广泛应用的E.coli可控性启动子来自相应的操纵子，都含有与阻遏蛋白特异性结合的操纵子序列，其介导的外源基因在E.coli中通常以极低的基底水平表达。,乳糖启动子Plac的可控性：,色氨酸启动子Ptrp的可控性：,噬菌体启动子PL的可控性：,在大型发酵罐中迅速升温困难，常使用双质粒控制系统，间接控制目的基因表达。,应是诱导型的，可通过简单方式、使用廉价诱导物诱导，如温度诱导、IPTG诱导。,最佳启动子必须具备条件：,必须是强启动子，能使外源基因表达量达细胞总蛋白的10-30%以上；,应呈现低水平的基础转录；,2、终止子(terminator, T),强化转录终止的必要性：,过长转录物的产生会影响外源基因的表达。,外源基因在强启动子控制下表达，易发生转录过头现象，RNA聚合酶滑过终止子，继续转录邻近序列，形成长短不一的mRNA混合物。,过长转录产物影响外源基因表达的原因：,1）转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因转录效率下降。,2）若外源基因下游紧接载体的重要功能基因，则RNA聚合酶在此处的转录，可能干扰其生物功能，甚至导致其不稳定性。,4）过长的mRNA往往不能形成理想的二级结构，大大降低翻译效率。,3）过长的mRNA往往产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗。,pCP1,Ampr,ori,Tcr,筛选Ampr、Tcs的转化子,也可通过探针质粒筛选， 唯一的克隆位点处于启动子和报告基因的翻译起始密码子之间，当终止子插入该位点时，由启动子介导的报告基因转录被封闭，从而减少或阻断报告基因的表达。,P,T,强终止子的选择与使用：,对终止作用较弱的终止子，可采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强转录终止作用。,常用终止子来自E.coli rRNA操纵子上的rrn T1T2、T7噬菌体DNA上的T。,E.coli偏爱使用终止密码子UAA，当其后连上一个U而形成四联核苷酸时，转译终止效率会得到进一步加强。,3、核糖体结合位点,外源基因在E.coli中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，还与mRNA的翻译起始效率密切相关。,结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，差别高达数百倍。,mRNA的翻译起始效率主要由其5端的结构序列决定，即核糖体结合位点(ribosomal binding site, RBS)。,1）SD序列：,E.coli RBS的结构：,识别核糖体小亚基中16S rRNA 3端区域3-AUUCCUCC-5，并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，启动翻译。,位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列：5-UAAGGAGG-3。,2）翻译起始密码子：,E.coli绝大部分基因以AUG作为翻译起始密码子，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子。,RBS对外源基因表达的影响：,1、SD序列的影响：,mRNA与核糖体结合越强，翻译起始效率越高，结合程度取决于SD序列(5-UAAGGAGG-3)与16S rRNA的碱基互补性。 以GGAG尤为重要，4个碱基中任何1个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度下降。,2、翻译起始密码子的影响：,E.coli起始tRNA可同时识别AUG、GUG和UUG三种起始密码子，但识别频率不同：GUG为AUG的50%、UUG为AUG的25%。,3、SD序列与起始密码子之间距离的影响：,SD序列与起始密码子之间的精确距离保证mRNA在核糖体上定位后，AUG正好处于P位，这是翻译启动的前提。,通常SD序列位于AUG前约7bp处，在此间隔中少1个或多1个碱基，均导致翻译起始效率不同程度的降低。,4、SD序列与起始密码子之间序列的影响：,SD序列下游碱基为AAAA或UUUU时，翻译效率最高；为CCCC或GGGG时，翻译效率是最高值的50%和25%。,如：-半乳糖苷酶mRNA，在此位置上的最佳碱基是UAU或CUU，如用UUC、UCA或AGG取代之，酶的表达水平下降20倍。,紧邻AUG的前3个碱基也会影响翻译起始效率。,5、起始密码子后续若干密码子的影响：,从AUG开始的前几个密码子的碱基序列也至关重要，这一序列不能与mRNA的5端非编码区形成茎环结构，否则会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位。,目前广泛使用的E.coli表达型质粒均含有与启动子来源相同的RBS，序列和间隔是最佳的。,4、密码子,生物体对密码子的偏爱性：,不同生物、甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子的使用频率不同，具有一定的偏爱性。,生物体对密码子偏爱性的决定因素：,生物基因组中的碱基含量；,密码子与反密码子相互作用的自由能；,细胞内tRNA的含量。,1、生物基因组中的碱基含量：,在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体X174）基因组中，密码子第3位上U和A出现频率较高。,在GC丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第3位上含G或C的简并密码子占90%以上。,2、密码子与反密码子相互作用的自由能：,适中的作用强度有利于蛋白质生物合成的迅速进行。,弱配对作用可能使氨酰基tRNA进入核糖体A位需要花费更多的时间。,强配对作用则可能使转肽后核糖体在P位逐出空载tRNA分子耗费更多的时间。,如：,GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少。,GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多；,3、细胞内tRNA的含量,简并密码子使用频率与相应tRNA的丰度呈正相关。,表达量高的基因含有较少种类的密码子，这些密码子又对应于高丰度的tRNA分子，以便细胞能以更快的速度合成需求量大的蛋白质。,密码子偏爱性对外源基因表达的影响：,原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率有较大差异，因此哺乳动物基因在E.coli中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。,使外源基因上的密码子在E.coli中获得最佳表达的策略：,1、外源基因全合成,按E.coli密码子的偏爱性规律，更换外源基因中不适宜的简并密码子。,如：重组人胰岛素、干扰素、生长激素在E.coli中的高效表达均采用了这种方法。,可将这两个tRNA编码基因克隆在另一高效表达质粒上，构建双质粒表达系统。,2、同步表达相关tRNA编码基因,如：人尿激酶原基因的412个密码子中，有22个Arg密码子，其中7个AGG、2个AGA，而E.coli中tRNAAGG和tRNAAGA丰度较低。,5、质粒拷贝数,质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响：,表达型质粒在每个E.coli细胞中达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程常发生在受体细胞对数生长期，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。,质粒的过度增殖、目的基因的高效表达会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性、目的基因表达水平下降。,措施： 将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道。,质粒扩增时序的控制：,pCP3拥有温度可诱导的复制子。,28时，每个细胞的质粒拷贝数为60；,42时，拷贝数迅速增至300-600，受体细胞表达的温度敏感型阻遏蛋白CI857失活，外源基因表达。,用温度可同时控制质粒拷贝数和外源基因表达。,（三）大肠杆菌基因工程菌的构建策略,包涵体型表达 分泌型表达 融合型表达 寡聚型表达 整合型表达 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建,1、包涵体型表达,E.coli表达的蛋白质在细胞内凝集，形成无活性、不溶于水的固体颗粒，称为包涵体(Inclusion Bodies, IB)。,包涵体的性质：,大部分存在细胞质中，基本上由蛋白质组成。,少量DNA、RNA、脂多糖等非蛋白分子。,E.coli本身表达的蛋白(如RNA聚合酶、外膜蛋白)、载体蛋白(如标记基因表达产物)。,50%以上是外源基因表达产物，氨基酸序列正确，但空间构象往往错误，无生物活性。,包涵体表达形式的优点：,1、简化表达产物的分离操作,包涵体不溶于水、密度远大于细胞碎片和其它细胞成分，菌体经超声波裂解后，通过高速离心，即可分离出来。,2、保持表达产物的结构稳定,形成包涵体后，E.coli的蛋白酶降解作用对外源蛋白的稳定性构不成威胁。,包涵体表达形式的缺点：,表达的目的蛋白无生物学活性，必须通过有效的变性、复性，才能获得正确空间构象。,变/复性效率对目标产物的收率至关重要，也是一技术难题。尤其目的蛋白分子中Cys残基较多时，复性成功率相当低，一般不超过30%。,外源基因在E.coli中的表达量占细胞总蛋白20%以上时，表达产物倾向形成包涵体。,以包涵体形式表达目的基因，关键是选择高效表达载体，高表达率也是包涵体法的优势所在。,包涵体的变性与复性操作,蛋白质变性复性的动力学原理：,共价修饰和集聚状态的蛋白质不能进入复性过程，成为无活性的蛋白质。包涵体中的蛋白质即属于这两种状态，需在体外进行变性（解除共价修饰和驱散集聚体）、复性操作。,包涵体的变性溶解：,用强变性剂如尿素、盐酸胍，通过离子间相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展。,便宜，但溶解能力弱、且尿素分解的 异氰酸盐能导致多肽链的氨基甲酰化。,溶解能力强，但价格昂贵。,常用的变性剂：,7M盐酸胍：,8M尿素：,包涵体的复性：,缓慢去除变性剂，使目的蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂，使二硫键正常形成。,尿素：,浓度降至4M时，复性过程开始； 降至2M时复性结束。,盐酸胍：,浓度降至4M时，复性过程开始； 降至1.5M时复性结束。,二硫键形成：,在包涵体变性体系中，始终存在还原剂(如DTT、-ME)，使多肽链中的巯基保持还原状态，防止二硫键错配导致严重的集聚。,变性结束后，游离的巯基必须重新配对形成二硫键，多肽链重新折叠。,形成二硫键的主要方式：,1）化学氧化法：,需电子受体，最廉价的电子受体为空气，二硫键形成是随机的，重折叠效果差。,2）二硫键交换：,需氧化型和还原型谷胱甘肽(GSSG和GSH)，二硫键形成相对特异，重折叠效果好。,包涵体复性的方法：,稀释复性 透析复性 超滤复性 柱上复性,缺点：体积增加较大，变性剂稀释速度快、 不易控制。,直接加入缓冲液或复性液，放置过夜。,稀释复性：,透析复性：,优点： 不增加体积，通过逐渐降低透析液浓度、控制变性剂去除速度。,缺点： 易形成无活性蛋白质聚体，不适合规模化生产。,超滤复性：,缺点： 样品量少时不适用，有些蛋白质在超滤过程中会发生不可逆变性。,优点： 透析速度易控制，适合规模化生产。,柱上复性：,包涵体变性后，在色谱柱上复性。,优点：复性回收率高，达90%以上；快速； 工艺易放大；样品稀释倍数小。,2、分泌型表达,以可溶性或不溶性包涵体状态存在于细胞质。,通过运输或分泌，定位于细胞周质（内外膜间的空隙），甚至穿过外膜进入培养基中。,在E.coli中表达的外源蛋白，按其在细胞中的定位，分为两种形式：,蛋白质的分泌机制：,E.coli周质中含有多种分子伴侣，可阻止分泌蛋白随机折叠，分泌在周质或培养基中的重组蛋白很少形成分子间二硫键。,与包涵体相比，分泌型重组蛋白有较高比例的正确构象，生物活性的回收率高，且对蛋白酶不敏感。,蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提。,分泌表达形式的优点：,2）目的蛋白易于分离,多数真核生物成熟蛋白N端不含甲硫氨酸残基，当其基因在E.coli中表达时，N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。,3）目的蛋白末端完整：,将外源基因与E.coli信号肽序列重组，一旦分泌型表达，N端的甲硫氨酸残基便可在信号肽剪切过程中被去除。,分泌表达形式的缺点：,1）E.coli的蛋白分泌机制不健全，真核基因很难在E.coli中分泌型表达。,2）少数外源基因即使能分泌表达，表达率也比包涵体方式低得多。,分泌型表达系统的构建,这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白，它激活定位于内膜上的磷酸酯酶，导致细菌内外膜的通透性增大。,绝大多数E.coli不能将蛋白质直接分泌到胞外，但有些能将抗菌蛋白(细菌素)分泌到培养基中。,将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一质粒上，与另一携带E.coli信号肽编码序列和目的基因的表达质粒共转化E.coli细胞，可实现目的蛋白的分泌。,3、融合型表达,除直接表达外，还可将目的基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，作为一个开放型阅读框架进行表达，由这种杂合基因表达的蛋白质称为融合蛋白。,在融合蛋白结构中，通常受体菌的蛋白位于N端，外源蛋白位于C端。,通过在DNA水平，引入蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可在体外从纯化的融合蛋白分子中回收外源蛋白。,融合型表达的优点：,1）目的蛋白稳定性高：,对分子量较小的多肽效果更佳。,3）目的蛋白表达率高：,与受体蛋白共用一套完善的表达元件。,目的蛋白需要回收：,融合蛋白需裂解和进一步分离，才能获得目的蛋白。,融合型表达的缺点：,融合型表达系统的构建,构建原则：,1）受体基因能高效表达，表达产物可通过亲和层析纯化。,2）外源基因应装在受体基因下游，为融合蛋白提供终止密码子。,3）两基因拼接位点处的序列设计十分重要，直接决定融合蛋白的裂解工艺。,4）两基因应保持一致的翻译阅读框架。,用于融合蛋白构建的受体蛋白：,谷胱甘肽转移酶(GST)：维持良好空间构象 硫氧化还原蛋白(TrxA)：维持良好空间构象 泛素蛋白(Ubi)：维持良好空间构象 麦芽糖结合蛋白(MBP)：促进分泌 外膜蛋白(OmpF)：促进分泌 金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)：免疫亲和层析 -半乳糖苷酶(LacZ)：免疫亲和层析,目的蛋白的回收：,生产药用目的蛋白时，将受体蛋白部分完整除去是必不可少的工序。,融合蛋白中的受体蛋白会影响目的蛋白的空间构象和生物活性，用于人体还会导致免疫反应。,融合蛋白的位点专一性断裂方法：,蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为溴化氰(CNBr)，与多肽链中甲硫氨酸残基侧链的硫醚基反应，生成溴化亚氨内酯，后者在水的作用下肽键断裂，形成两个肽段，上游肽段的甲硫氨酸残基转化为高丝氨酸残基，下游肽段N端的第一个氨基酸残基保持不变。,化学断裂法,特点：,前提：,回收率高（达85%以上）；专一性强；产生的目的蛋白N端不含甲硫氨酸，与真核生物中的成熟表达产物接近。,目的蛋白分子内部不能含甲硫氨酸残基。,酶促裂解法-单残基位点,蛋白内切酶,切割位点,梭菌蛋白酶 Arg 葡萄球菌蛋白酶 Glu 假单孢菌蛋白酶 Lys 猪胰蛋白酶 Arg Lys,特点：,N,C,Arg C,N,受体蛋白,目的蛋白,1）断裂效率高。 2）每种蛋白酶都有相应的断裂位点。几种断裂位点专一性最强的商品化蛋白酶分别在多肽链中Arg、Glu或Lys残基C末端切开酰胺键，形成不含上述残基的下游肽段。,前提：,外源蛋白内部不能含Arg、Glu或Lys残基。,酶促裂解法-多残基位点,在受体蛋白编码序列与外源基因之间加装一段寡肽编码序列（Ile异亮氨酸-Glu-Gly甘氨酸-Arg），该寡肽为具蛋白酶活性的凝血因子Xa的识别和作用序列，其断裂位点在Arg的C末端。,纯化后的融合蛋白用Xa处理，即可获得不含上述寡肽序列的目的蛋白。,凝血因子Xa的识别序列由4个氨基酸残基（Ile-Glu-Gly-Arg）组成，大多数蛋白质中出现这种寡肽序列的概率极低。 -应用广泛。,酶促裂解法：,4、寡聚型表达,通过增加质粒拷贝数，以提高外源蛋白产量往往不能取得满意效果。,随质粒拷贝数不断增加，受体细胞内的大部分能量和原料被用于合成质粒编码蛋白，使细胞正常生长代谢受到影响。,重组质粒除含外源基因外，还携带其它可转录基因（如抗生素抗性基因）。,构建寡聚串联型异源蛋白表达载体，将多拷贝外源基因克隆在一个低拷贝质粒上，以取代单拷贝外源基因在高拷贝载体上表达，可增加外源基因剂量，提高目标蛋白产量。,寡聚型表达的优点:,1）目的蛋白高效表达：,在不提高质粒拷贝数的前提下，增加目的基因的拷贝数，可在一定程度上提高表达量。,2）稳定表达小分子短肽：,短肽由于缺乏有效的空间结构，在细菌细胞中的半衰期较短。,串联短肽具有与蛋白质相似的长度和空间结构，抗蛋白酶降解的能力大幅度提高。,寡聚型表达的缺点:,目的产物回收困难：,寡聚短肽需裂解和进一步分离，才能获得最终分子，裂解后的短肽分子易出现序列不均一性。,寡聚型表达系统的构建,基本战略：,5、整合型表达,将外源基因直接整合在受体细胞染色体DNA的特定位置上，使之成为染色体DNA的组成部分，增加其稳定性。,整合型表达的优点：,目的基因随受体细胞染色体DNA的复制而复制，非常稳定，多用于改良物种的遗传性状。,目的基因稳定表达：,整合型表达的缺点：,目的基因表达率低：,单拷贝整合的目的基因表达率低，可通过强化表达元件补偿。,6、蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建,无论是在真核还是在原核细胞中，外源蛋白表达后都面临被降解的命运，稳定性甚至不如半衰期较短的受体细胞内源蛋白。,多数情况下，外源蛋白不稳定性归结为对受体细胞蛋白酶系统的敏感性。,外源蛋白的半衰期可通过外源蛋白序列的人工设计、受体细胞的改造控制。,在蛋白质C端引入Asp天门冬氨酸残基，则稳定性显著提高，且Asp残基离C端越近，蛋白质的稳定性越好。,外源蛋白序列的设计,1）C端氨基酸序列对稳定性的影响：,N端含Pro、Glu、Ser、Thr的蛋白质半衰期通常很短，尤其Pro-Glu-Ser-Thr序列(PEST序列)，是胞内蛋白酶的超敏感区。,2）N端氨基酸序列对稳定性的影响：,蛋白质N端含高比例的Ala丙氨酸、Asn天冬酰胺、 Gln谷氨酰胺、Cys、His，则稳定性显著提高。,受体细胞的改造,1）lon基因缺陷的E.coli受体（lon-）：,多数外源蛋白是被E.coli中的蛋白酶La和Ti降解的，二者分别由lon和clp基因编码。 采用lon-的突变株，可提高蛋白稳定性。,热休克基因dnaK、dnaJ、groEL、grpE，以及环境压力特异性因子编码基因htpR的突变株均呈现出对异源蛋白降解作用的严重缺陷。,2）htpR基因缺陷的E.coli受体（htpR-）：,E.coli中的热休克蛋白家族对外源蛋白的降解有重要作用，机理是胁迫外源蛋白形成对蛋白酶识别和降解有利的空间构象。,lon-htpR-双缺陷细胞株非常适合高效表达各种不稳定的外源蛋白。,（四）基因工程菌的遗传不稳定性及对策,基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制,工程菌遗传不稳定性主要表现为重组质粒的不稳定性。,结构不稳定性：重组DNA分子上某一区域缺失、重排，导致其生物学功能丧失。,分配不稳定性：整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸。,工程菌遗传不稳定性的产生机制：,受体细胞中的限制修饰系统对外源DNA的降解。,外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢。,重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配。,受体细胞的内源性转座元件促进重组DNA的缺失、重排。,改善基因工程菌不稳定性的策略,1、改进载体-受体系统：,1）将R1质粒的parB基因引入质粒，其表达产物可选择性杀死因分配不均匀产生的无质粒细胞。,2）正确设置载体的MCS，防止外源基因插入稳定区。,3）将E.coli的ssb基因克隆在质粒上，受体菌ssb-，ssb编码的蛋白是DNA复制和细胞生存必需的，则丢失质粒的细胞无法增殖。,2、施加选择压力,1）根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素。,2）根据载体上的营养缺陷型标记，使培养系统中缺失相应的营养组份。,3、控制目的基因的过量表达,1）使用可控型启动子，控制目的基因的定时表达及表达程度。,2）使用可控型复制子，控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数。,4、优化基因工程菌的培养工艺,1）培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定。,2）培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定。,（六）利用重组大肠杆菌生产人胰岛素,胰岛素的结构及其生物合成 人胰岛素的生产方法 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建,胰岛素的结构及其生物合成