专题四核酸鉴定技术.ppt

核酸鉴定技术,专题四,鉴定的内容,浓度和纯度 单一性 构型 目的分子 序列,主要内容,核酸的物理化学性质 核酸的大小 核酸的构型 常规核酸的电泳检测技术 核酸分子杂交鉴定技术 经典DNA序列分析技术,核酸的物理化学性质,紫外吸收：260nm 大小：从几个到1011nt 构型：超螺旋，解旋 序列： 功能：,核酸的紫外吸收,嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，因此核酸具有紫外吸收特性。,DNA钠盐的紫外吸收在260nm附近有最大吸收值，其吸光率（Absorbance）以A260表示，A260是核酸的重要性质，在核酸的研究中很有用处。在230nm处为吸收低谷，RNA钠盐的吸收曲线与DNA无明显区别。,不同核苷酸有不同的吸收特性。所以可以用紫外分光光度计加以定性及定量测定。,Purity of DNA A260/A280: dsDNA-1.8 pure RNA-2.0,DNA或RNA纯度的测定 对待测样品是否纯品可用紫外分光光度计读出260nm与280nm的OD值来确定，因为蛋白质的最大吸收在280nm处，因此从A260/A280的比值即可判断样品的纯度。纯DNA的A260/A280应为1.8，纯RNA应为2.0。 样品中如含有蛋白及苯酚等，A260/A280比值即明显降低。不纯的样品不能用紫外吸收法作准确的定量测定。,对于纯的核酸溶液，测定A260，即可利用核酸的比吸光系数计算溶液中核酸的量，核酸的比吸光系数是指浓度为1gmL的核酸水溶液在260nm处的吸光率，天然状态的双链DNA的比吸光系数为0.020，变性DNA和RNA的比吸光系数为0.022。 通常以1OD值（260nm）相当于50gmL双螺旋DNA，或40gmL单螺旋DNA（或RNA），或20gmL寡核苷酸计算。这个方法既快速，又相当准确，而且不会浪费样品。,1.84,通常， 含量：1OD260nm=50mg/ml 双链DNA 纯度：OD260nm/OD280nm=1.8 If OD260nm/OD280nm1.8，Contaminated by ?,核酸的大小,生物基因组的大小,迄今测出的最小的基因组,科学家最近测出的两个细菌基因组如此之简单和小，它们也许给自身的定位带来危机。日本和西班牙的研究小组测定了生活在其它生物内的“共生菌“细菌基因组，其中一个可能将丧失它作为真正生物体的地位而成为其宿主细胞的一个部分，另一个看来正在走向灭绝。 Carsonella ruddii是生活在吸食植物液昆虫身上的一种寄生细菌，它的基因组只有160个kb之长。过去的估计曾把最小的基因组定在400kb左右。虽然Carsonella基因组排得很满，有许多重叠的基因，而且几乎没有“废物”DNA，但是它没有许多被认为是生命不可缺少的基因。这些发现提出，Carsonella 也许进化成了昆虫细胞内的一个细胞器，宿主细胞补偿了缺失的基因功能。 Buchnera aphidicola的基因组要大一点儿，约为420kb。该细菌与其它几种细菌一样共生在一种蚜虫身上。与其它共生物种相比，B. aphidicola失去了许多能让它为宿主生存作出贡献的重要功能，这是好的共生体所需要做到的。其它的共生细菌看起来接管了这些功能。推测B. aphidicola 可能在走向灭绝。,电泳鉴定DNA分子的大小,原理 带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠化学惰性的介质（琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。,凝胶电泳分离生物大分子,Agarose gel electrophoresis,迁移率 电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子迁移率要快；同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的比松散型的开环DNA分子或线性DNA分子迁移率要快,DNA分子大小的估计,核酸构型,凝胶电泳的分辨率： 与凝胶的类型和密度相关 琼脂糖凝胶的分辨率在0.250Kb之间; 聚丙烯酰胺的分辨率在11000bp之间,琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。 分为常熔点的琼脂糖和低熔点（LMP）琼脂糖。,琼脂糖凝胶电泳的参数： 缓冲液：TAE（TBE、TPE），1 x 凝胶的浓度：根据检测的DNA大小，1% DNA样品：1g，指示剂 电泳条件：大片段低电压长时间，小片段高电压短时间 染色和观察：溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色，在302nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪）。 能看到0.05 g的微量DNA； 荧光强度与DNA的片段大小成正比。,Separation Range Vs. % Agarose,凝胶中DNA分子的可视化,EB染色和紫外线照射观察琼脂糖凝胶中的DNA条带,Sample Well 25 ng 1 kb ladder 0.8% Agarose,1,2,4,6,8,10,12,kb,Agarose Gel Electrophoresis EtBr Detection Limit: 5-10 ng DNA,重组克隆的鉴定：酶切和PCR,聚丙烯酰胺凝胶电泳 缓冲液：TBE 凝胶聚丙烯酰胺：丙稀酰胺/ 亚甲双丙稀酰胺（29：1）；TEMED和过硫酸铵（ 10 ）。 可视化：EB、硝酸银 分离范围：1-1000bp,PolyAcrylamide Gels,40kb?,=40kb,40kb?,脉冲电场凝胶电泳（PFGE） 1984年，D.R.Cantor发明的。分离超大分子量的DNA分子。 在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向移动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。,核酸分子杂交鉴定技术 核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（Cavnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。,杂种核酸分子： 彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，而形成的双链分子。 DNA/DNA的杂交作用检测特定生物有机体之间的亲源关系。 DNA/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片段中某种特定基因的位置。,核酸杂交常用几种膜的性能比较,硝酸纤维素膜 不能滞留小于150bp的DNA片段。 应用1mol/L醋酸铵和0.2mol/L的NaOH缓冲液代替SSC缓冲液可改善对小片段DNA的滞留能力。 RNA变性后能十分容易的结合到膜上。,尼龙膜或硝酸纤维素膜杂交的步骤： 1. 核酸印迹转移：通常利用毛细作用将核酸样品转移到固体支持膜上。 2. 印迹杂交： 将具有核酸印迹的滤膜同带有标记的DNA/RNA进行杂交。,Southern Blot DNA印迹杂交 根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫Southern DNA 印迹转移技术。,印迹转移前的凝胶处理： 分子量不同所需转移的时间不同； 浸泡在0.25M的HCL溶液中脱嘌呤，再进行 碱变性 碱水解，DNA链断裂 单链,Southern 凝胶转移杂交技术,Southern DNA 印迹杂交之X光显像图片 水稻（Oryza sativa L.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶Bgl(A-C)、BamH（D-F）、EcoR（G-I）、和Hind（J-L）消化，加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带 ，表明含有水稻的psbA基因序列。,在进行核酸印迹转移的时： 1.要将已转移好的硝酸纤维素膜在80度下烘烤12小时； 2.紫外线交联法，DNA分子上的部分胸腺嘧啶残基同尼龙膜表面的带正电荷的氨基基团之间进行交联。,Northern Blot印迹技术 1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与Southern DNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做Northern RNA印迹技术（Northern blotting）。 而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（Western blotting）。,斑点印迹杂交和狭线印迹杂交 斑点印迹杂交（dot blotting）和狭线印迹杂交（slot blotting ）是在Southern印迹杂交的基础上发展的定量化的快速检测特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸杂交技术。由于在实验的加样过程中使用了特殊设计的加样装置，使众多待测样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵。这两项技术更适应与核酸样品的定量检测。,通过抽真空的方式将加在多孔过滤进样器上的核酸样品,直接转移到适当的杂交滤膜上，然后按如同Southern或Northern 印迹杂交一样的方式同核酸探针分子进行杂交 。,菌落杂交 也叫原位杂交，是指把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，使溶菌的DNA同滤膜原位结合，带有DNA的滤膜烘干后，与放射性同位素标记特异的DNA或RNA探针杂交。主要用于鉴定重组子。,检测重组体克隆的菌落杂交技术,蛋白质/DNA、蛋白质/RNA杂交技术,凝胶阻滞实验（Gel retardation assay） 又叫DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay），是在80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点，也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。 原理： DNA与蛋白的结合导致了电泳时迁移率的降低。,凝胶阻滞实验的基本原理图 放射性标记的DNA由于同一种细胞蛋白质B结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带,*,*,不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在与某一特定DNA片段结合的蛋白质分子 而且可以研究发生此种结合之精确的DNA序列的特异性。（加入超量的非标记竞争DNA）,可以间接的阐明体内发生DNA与蛋白质之间的相互作用。 1.用具有已知转录因子结合位点的竞争DNA，可检测蛋白是否属于此类转录因子 2.在竞争DNA的已知转录因子结合位点上，引入突变可评估突变对竞争DNA性能及其转录因子结合的影响。,凝胶阻滞实验能揭示在体内发生的DNA与蛋白质之间的相互作用的有关信息，但无法确定两者结合的准确部位。而DNase足迹实验可以解决这个问题。,DNase足迹实验（footprinting assay） 是一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。足迹实验的一个明显优点是，可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。,32p,1 5 10,*,1 4 8 10,*,加入蛋白质X,加入DNaseI凝胶电泳放射自显影,1,5,10,A B,足迹,(a),(c),(b),DNaseI 足迹实验,如果使用较大的DNA片段，通过足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合单位的分布状况。如同凝胶阻滞实验一样，我们也可以加入非标记的竞争DNA序列，来消除特定的“足迹”，并据此测定其核苷酸序列的特异性。,硫酸二甲酯（DMS）足迹实验： DMS能使裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶会对甲基化的G残基作特异的化学切割。 而与蛋白结合的DNA片段上的G残基，不会被DMS甲基化，从而避开了六氢吡啶的切割作用。于是在DNA片段的序列中，不存在这些G残基末端的DNA片段，出现了空白区。,甲基化干扰实验（methyltion interference assay）,根据DMS（硫酸二甲酯）能够使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理，设计出了另一种研究DNA与蛋白质相互作用的实验方法，即甲基化干扰实验。这种技术可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对而后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间相互作用的模式。 DMS化学干扰的主要局限性是，它只能使G残基甲基化。尽管如此，它仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹区段中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。 具体操作如下页图所示。,甲基化干扰实验,应用甲基化保护作用进行的体内足迹实验,DNA核苷酸序列分析（DNA测序）,传统的DNA序列分析法： Sanger双脱氧链终止法和 Maxam-Gilbert化学分析法 新发展的DNA杂交测序法,Sanger双脱氧链终止法原理： 双脱氧链终止法要求使用一种单链的DNA模板和一种适当的DNA合成引物。 利用DN