双向电泳原理与流程.ppt

,万 翔 X双 向 电 泳 技 术,Proteomics,“.the analysis of complete complement of proteins. Proteomics includes not only the identification and quantification of proteins, but also the determination of their localization, modifications, interactions, activities, and, ultimately, their function.“ Stanley Fields, University of Washington, Seattle, in Science 291, 1221 (2001),Proteomics,一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质称为蛋白质组(proteome) 仅仅从基因组学水平上无法彻底的了解各种生命现象, 因为蛋白质才是生命活动的真正执行者 从基因组学上我们无法检测到转录后修饰、翻译调节、选择性剪切、以及蛋白复合物形成、蛋白质相互作用等生命现象; 此外并不是细胞内的所有的DNA都翻译转录成蛋白质,Proteome Analysis and Proteomics,“The analysis of the entire PROTEin complement expressed by a genOME, or by a cell or tissue type.“ Wasinger VC et al, Electrophoresis 16 (1995) “Proteomics is the study of quantitative changes of expression levels and their application to drug discovery, diagnostics and therapy.” Two basic technologies: 2-D electrophoresis of complex protein mixtures Identification and structure analysis of proteins with mass spectrometry methods,Why 2DE?,Only “Proteomics” is the large-scale screening of the proteins of a cell, organism or biological fluid, a process which requires stringently controlled steps of sample preparation, 2-D electrophoresis, image detection and analysis, spot identification, and database searches. The core technology of proteomics is 2-DE. At present, there is no other technique that is capable of simultaneously resolving thousands of proteins in one separation procedure.,理论 pI and Mr 图 酵母细胞表达6,216种蛋白,pI (理论值),Mr kDa,2DE 工作范围,注: 图片中没有特别强调蛋白丰度和疏水性,至今1,484个蛋白被鉴定 (Nat.Biotechnol. 17,676 and 19, 242),From: Wildgruber et al. Electrophoresis 21 (2000) 2610-2616.,2D 电泳优越性,对未处理样本耐受性好 不需要预纯化 (如：色谱层析) 分辨率非常高 2D 可以有效的组分收集器 蛋白在凝胶介质中受到保护 在蛋白质组学技术中应用范围最广（front-end ） 与其他技术相比，在一次试验中可检测到的蛋白点更多 与后续分析技术兼容性好 (如. MDLC),蛋白质组学应用举例,研究细胞结果功能和分子组成,发现新的药物靶位点,发现新型生物学活性的分子和药物,差异蛋白质组学,发现细菌、病毒感染和疾病监测的分子标志物,修饰蛋白质组学,遗传或药理学扰动的分子解剖,病理生理学研究,中药机理,相互作用蛋白质组学,研究药物作用方式和毒性机理,植物抗虫抗旱抗逆,遗传育种和分子育种,资源环境,海洋生物,寻找差异蛋白质,环孢素A处理前,环孢素A处理后,正常 组织,肿瘤组织,细胞,组织,Life Sciences 的历史,LKB 电泳发明者 Pharmacia 层析技术开创者 Amersham Biosciences 提供基因组、蛋白组学研究整体解决方案 GE Healthcare Life Sciences 实现从发现到功能研究，从体外到体内的突破,GE Healthcare milestones in 2-D electrophoresis,LKB introduced Ampholine, the first commercial carrier ampholyte,The first multiple separation system, ISO-DALT, was developed,Pharmacia Fine Chemicals introduced Pharmalyte,LKB introduced Immobiline,Pharmacia Biotech introduced Immobiline DryStrip,Pharmacia Biotech introduced ImageMaster suite,Pharmacia Biotech introduced IPGphor,Pharmacia Biotech launched DALT II system,Amersham Pharmacia Biotech launched Typhoon,Amersham Biosciences launched Ettan DIGE,The Multiphor flatbed electrophoresis unit is launched. In production for 30 years in 2003!,Image analysis,Image acquisition,Automated spot picking,Spot digestion,MALDI target spotting,MALDI-ToF,Protein Separation,Proteomics 2DE Workflow,Sample Prep,Sample labeling,小鼠肝脏蛋白提取物2D凝胶电泳,2-D electrophoresis gel from Prof. Dr. A. Grg, Technical University Munich, Germany,2D/MS 经典工作流程,细胞裂解 匀浆 预分级 除杂质 浓缩 定量,差异分析,双向电泳 第一向 第二向,图像获取 图谱分析,银染 考染 荧光,蛋白标记,样品制备,分离,染色,图谱分析,挖点 酶解 点靶,蛋白鉴定,体液,植物,微生物,组织,细胞,样品制备,细胞破碎 蛋白沉淀 溶解 抑制蛋白酶活性 去除 核酸 脂类 盐，缓冲液，离子性小分子 不溶性物质,2D/MS 经典工作流程,差异分析,图像获取 图谱分析,银染 考染 荧光,蛋白标记,染色,图谱分析,挖点 酶解 点靶,蛋白鉴定,体液,植物,微生物,组织,细胞,Separation,双向电泳 第一向 第二向,细胞裂解 匀浆 预分级 除杂质 浓缩 定量,样品制备,Principle of 2-D Electrophoresis,1. First dimension: denaturing isoelectric focusing separation according to the isoelectric point 2. Second dimension: SDS electrophoresis separation according to the molecular weight,2-D electrophoresis resolves a few thousand protein spots.,等电聚焦电泳原理,蛋白质是带有电荷的两性生物大分子，其正负电荷的数量随所处环境酸碱度的变化而变化。,等电聚焦（IEF）电泳就是在凝胶中加入两性电解质，从而构成从正极到负极pH逐渐增加的pH梯度，处在其中的蛋白分子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等电点的位置上，测出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等电点。,等电聚焦电泳原理,双向电泳：传统方法,使用载体两性电解质IEF时存在的问题,不同批次载体两性电解质的重现性 载体两性电解质梯度不稳定 蛋白载量有限 重现性差导致梯度漂移 梯度漂移导致酸性和碱性蛋白质丢失 管胶柔软，尺寸不定 操作者个人技术影响结果,固相凝胶 (支持膜上0.5 mm 厚凝胶),丙烯酰胺缓冲液: Immobiline CH2=CH-CO-NH-R, R ：羧基或叔胺基,固相 pH梯度 (IPG),Immobiline 干胶条的特性,可重复性 无梯度漂移, 真正的平衡方法 可分离酸性和碱性蛋白 容纳蛋白样本量更多 水平和垂直 SDS 凝胶中都能使用 允许样本水化上样 机械强度和尺寸稳定 易操作 易于对样本跟踪标记,新pH范围的 Immobiline 干胶条,高分辨率的 IPG 胶条，联合使用DeStreak试剂, 能改善极碱性区域蛋白点结果 。归功于独特的试剂。 使用pH范围相互重叠的干胶条，可提高2-D 图谱 分析效率! 新pH范围: Immobiline DryStrip pH 3 5.6 NL Immobiline DryStrip pH 5.3 6.5 Immobiline DryStrip pH 6.2 7.5 Immobiline DryStrip pH 7 11 NL Immobiline DryStrip pH 3 11 NL,不同pH范围胶条,不同长度、多种窄pH范围胶条可选，尤其是1个pH范围 pH7-11NL碱性胶条,宽pH 、窄 pH 范围胶条,宽pH梯度胶条应用: 整个蛋白图谱 窄 pH梯度胶条应用: 提高分辨率 增加样品上样量 检测分析更多蛋白,提高分辨率: 斑点显现,IPG 4-7,IPG 5-6,IPG 4-7,IPG 5.5-6.7,Mouse liver proteins,From A. Grg et al. (1999),不同长度的胶条,7 cm 11 cm 13 cm 18 cm,24cm,线形与非线形胶条,for most samples Cell lysates Tissue extracts,linear (L),nonlinear (NL),for samples with abundant proteins in the range between pH 5 and 7 Serum proteins,pH 3-10 L and NL,from Prof. Angelika Grg, Technical University Munich,Tissue Proteins from Mouse Liver,linear (L),nonlinear (NL),The IPGphor Platform,IPG 胶条 水化,IPG strip rehydration,如果水化时加入样品， 此体积是加入样品后的终体积,加样品到胶条槽,泡涨盘 VS 聚焦盘,干胶条的水化,主动水化：胶条槽内进行，大分子蛋白更容易进入胶条；30120V，1024Hrs 被动水化：专用水化盒中进行NEW！ 无需覆盖油！ 避免灰尘污染，空气作用 不透明盖子，适用于CyDye DIGE标记 同时适用于市场上所有724cm干胶条的水化,在样品杯中加入少量不含样品的水化液检查是否漏液。上样前吸走水化液。 上样前将样品离心去掉不溶物，每个样品杯最多可加样150l。 盖上胶条槽的盖子，再盖IPGphor 仪器的盖子。,分别将两个IEF 电极片放在IPG 胶条胶的两端，分别将电极压在两个电极片的外缘。 样品杯可放在两个电极间除胶条槽内侧凸起外任何位置，对于碱性分离范围的IPG 胶条，尽量将样品杯靠近阳极放置.,杯上样 & 纸桥上样,IEF电泳,IPGphor 包括半导体温控系统(20C)和程序化电源(10000V) 可同时进行12根胶条的等电聚焦 聚焦效果以“Vh”数控制，可提高重复性,IPG 胶条的平衡两步平衡,SDS 电泳前, 平衡母液: 2% SDS, 50mM Tris-HCl pH 8.8, 6M urea, 30% glycerol + 蛋白与SDS结合 甘油和尿素降低电内渗作用 第一步DTT平衡： (1 x 15min) 1% DTT 第二步碘乙酰胺平衡：去除多余的 DTT ，防止拖尾 (1 x 15min) 2.5% iodoacetamide,第二向垂直电泳系统,琼脂糖覆盖密封,放置 IPG strip,低熔点琼脂糖,Push the IPG Strip Down onto the Gel Surface,Seal the Cassette and Fix the IPG Strip with Agarose,Inserting the Cassette,SDS-PAGE 参数,SE600ruby,Ettan DALTsix,Ettan DALTtwelve system,第二向系统,strip gel number running length (cm) size (cm) of gels time (hr) Ettan Dalt12 18, 24 25 x 20 12 4.5 Ettan Dalt6 18, 24 25 x 20 6 4.5 SE 600 2 x 7, 13 14 x 16 (24) 4 4 MiniVE 7 8 x 7, 8 x10 2 1.5 Multiphor II 7, 11 24 x 11* 1 1.5 18 24 x 18 1 3.3 PhastSystem (4)* 4 x 4 2 0.5 * 2 or 3 strips side-by-side * cut or home-made strip,2D/MS 经典工作流程,差异分析,图像获取 图谱分析,蛋白标记,图谱分析,挖点 酶解 点靶,蛋白鉴定,体液,植物,微生物,组织,细胞,分离,细胞裂解 匀浆 预分级 除杂质 浓缩 定量,样品制备,双向电泳 第一向 第二向,银染 考染 荧光,染色,Protein Detection Methods,Coomassie Blue-考马斯亮蓝染色,+ 灵敏度 ，低至0.01 mg (“胶体”考染) + 非特异性染色 + 染料与蛋白成比例结合 + 线性化好 扩散速度受限，胶的厚度影响跑胶速度 纯度不够 有限的动力学范围,胶体考马斯亮蓝染色,1 mg E. coli strain B IPGphor 24 cm pH 4 - 7 Colloidal CBB G250 staining,银染,+ 灵敏度 ，低至0.2 ng + 在凝胶基质中与蛋白交联 + 自动催化反应 染凝胶表面蛋白 线性化程度比考染低 一些大分子物质也被染色 步骤多，某些步骤时间控制严格,Silver stained gel of E. coli Lysate,IPG 4-7 Silver stained with PlusOneKit without glutaraldehyde and formaldehyde in the Ag sol.,2D/MS 经典工作流程,差异分析,蛋白标记,挖点 酶解 点靶,蛋白鉴定,体液,植物,微生物,组织,细胞,分离,细胞裂解 匀浆 预分级 除杂质 浓缩 定量,样品制备,双向电泳 第一向 第二向,图像获取 图谱分析,银染 考染 荧光,染色,图谱分析,ImageScanner III图像扫描系统,灰度校正功能 平台具有防水功能，可直接扫描SDS-PAGE湿胶。 3.7OD高动态范围，保证高、低丰度蛋白的准确定量。 扫描平台大，A3扫描面积，一次可扫描2块24cm凝胶。,Gray 256 scale Transmissive 300dpi,由SIB, GeneBio和GE Healthcare合作开发，为SwissProt推荐分析软件。 高效能参数自动找点，全自动蛋白定量计算方法，不受背景影响。 在原始数据上进行分析，结果可靠。界面窗口可随意设计，界面极其友好。 全自动凝胶匹配，采用先进的算法。根据点的相关因素、形状、位置、周围情况， 胶间匹配效率高。 多种统计学分析工具，快速找到胶间蛋白表达差异。 可直接链接到ExPASy 和 SwissProt 数据库，进行网上检索。 全部操作