蛋白质加工与输送2011-9研.ppt

1,蛋白质合成后加工与输送,2,3,翻译后加工 （Posttranslational processing）,肽链从核蛋白体释放后，经过细胞内各种修饰处理，成为有活性的具有天然构象的成熟蛋白质的过程。,4,包括：,多肽链折叠为天然的三维构象； 肽链一级结构的修饰； 空间结构的修饰等； 靶向输送到特定细胞,5,一、多肽链折叠为天然功能构象的蛋白质 多肽链合成后需要逐步折叠（folding)成天然空间构象(native conformation)才成为有功能的蛋白质。 一些疾病是单纯由错误折叠的蛋白质引发的 蛋白质构象病。,6,肽链折叠的动力学,肽链折叠的速度和构象核 构象核：为数不多的氨基酸残基通过分子中近程相互作用先形成一个核心，即构象核。然后以其为核心，逐渐进行随后的折叠过程。 整个肽链的折叠过程存在着快慢不同的几个阶段。 构象核的形成、构象核的生长和彼此黏结、具有规正二级结构的分子框架的建立、中间态的调整，以及具有四级结构蛋白质的亚基的组装。,7,熔球态：在肽链的折叠过程中，还存在着一种中间态，被称为“熔球态”。 最重要的特征是，具有一定二级结构的肽链经过塌陷后形成的比较紧密的立体结构。它已具备了天然立体结构的框架。但在疏水的内部，很多细微的立体结构与天然还有差异。,8,蛋白质肽链的折叠是以结构域为单位,很多实验结果表明，各个结构域的折叠应该是相互独立的，因为迄今为止已有越来越多的单个结构域被单独表达，而且表达的产物都具有天然的活性。 一个多结构域蛋白质中的各个结构域不仅是氨基酸残基序列上的一个特定的片段，也是蛋白质立体结构中的独立的、具有生物活性的区域，而且还是一个肽链折叠过程中的独立的单位。 在细胞中多结构域的形成可能是有先后次序的。期间可能存在着一定的协调和协同。,9,蛋白质肽链在折叠过程中可能出现许多中间态，但是其中多数是瞬时的，而对蛋白质稳定结构的形成产生影响的中间态仅有不多几种。最常见的中间态是与肽酰基-脯氨基间肽键的顺反异构化、二硫键交换有关，可能某些还与氨基酸残基的侧链修饰有关。,10,决定蛋白质折叠的因素： 球状蛋白质折叠为一个有规律的二级结构和三级结构的构象，疏水侧链埋在蛋白质的内部，极性/带电荷的侧链接触溶剂。 蛋白质折叠是热力学推动的过程，伴随着解折叠状态到折叠状态的自由能的降低。G是折叠蛋白质的构象稳定性（Gu-Gf). 蛋白质（ G）的整体稳定性较小，折叠态比非折叠态的稳定性稍微多一些。这导致蛋白质构象稳定性的值在1075KJ/mol之间，大多数蛋白质表现的值处于该范围的低端。,11,Anfinsen经典实验表明：蛋白质折叠的必需信息都储存在一级结构中。即“序列决定构象”。 有些蛋白质移除前导序列会伴随着之后的蛋白质重折叠的缺失。相反的，全长酶原解折叠后可以重新产生一个折叠的酶。这个结果表明前导序列参与了折叠反应，这说明并不是“最终的”序列编码了折叠信息。,12,细胞中大多数天然蛋白质折叠都不是自动完成，而需要其他酶、蛋白质辅助. 所有细胞中发现的伴侣蛋白都是聚体体系，它阻止了不正确的蛋白质的折叠，以7个、8个或9个亚基的超环形结构为基础。超环形结构被任意端盖住，形成一个通过疏水表面结合解折叠多肽的空穴，通过ATP驱动的构象变化促使肽折叠为天然构象。 不正确的折叠导致活性失活，这是许多疾病的分子基础。,13,分子伴侣（molecular chaperon） 蛋白二硫键异构酶（protein disulfide isomerase,PDI） 肽酰基-脯氨酰顺反异构酶（peptidyl prolyl cis-trans isomerase, PPI）,14,1分子伴侣*（molecular chaperon） 是细胞中一大类保守蛋白质，可识别肽链的非天 然构象（不稳定构象），促进各功能域和整体蛋白质的 正确折叠（稳定构象）。 普遍特点-只与Pr分子的非天然构象结合，而不与已经折叠 成天然构象的Pr分子结合,两大类： 一类是核糖体结合性分子伴侣，包括触发因子(trigger factor, TF)等； 另一类是非核糖体结合性分子伴侣，包括热休克蛋白、伴侣蛋白等。,15,（1）功能-多种多样的 帮助肽链折叠； 辅助新生肽链的转运与转位，帮助“次品蛋白质” 的降解。 一些细胞质中的可溶性分子伴侣还可以通过与辅助分子伴侣 的相互作用，行使更多的功能：网格蛋白的去组装；参与突触小泡融合后的内吞；帮助蛋白质/新生肽链靶向，如进入线粒体；以及一些复合物的组装，如肌球蛋白复合物和核孔等； 分子伴侣还参与信号转导。另外，引发因子(TF)除了能帮助新生肽链折叠外，还兼有PPI酶的活性。,16,（2）作用： 蛋白质肽链的折叠可以简单看作是一些疏水基团被包埋到分子内部的过程，因此，帮助新生肽链折叠的分子伴侣一定是具有与疏水基团结合能力的蛋白质。以最常见的hsp70为例，它们都具有一个肽结合部位，由疏水氨基酸残基构成。分子伴侣总的作用是与暴露的疏水区域稳定结合。 结果： 降低了局部未折叠蛋白质的浓度并防止其非特异性的不可逆的聚合和错误折叠，同时保存了多肽链折叠的能力，当折叠不成功时，可以重新进行折叠。,17,（3）分布： 广泛分布于原核和真核细胞中。 在真核细胞中目前发现它们存在于： 细胞液、内质网、线粒体、叶绿体以及细胞核中。 （存在胞内pr折叠、组装的各部位）,18,（4）典型分子伴侣介绍 细胞至少有两种分子伴侣家族 热休克蛋白（heat shock protein, HSP )： 属于应激反应性蛋白，高温应激可诱导该蛋白合成增加.,19,20,HSP70： 一类约70kD的高度保守的ATP酶，广泛存在原、真核细胞中。 由两个功能不同的结构域组成： N端的ATP酶结构域和C端的多肽链结合结构域。 ATP酶结构域：能结合和水解ATP. 多肽链结合结构域：可识别由4-5个疏水AA残基为核心组成的7肽片段。,21,HSP促进蛋白质折叠的基本作用： 结合保护待折叠多肽片段，再释放该片段进行折叠，形成HSP70和多肽片段依次结合、解离的循环。 HSP70等协同作用： 可与待折叠多肽片段的7-8个疏水残基结合，保持肽链成伸展状态，避免肽链内、肽链间疏水基团相互作用引起的错误折叠、凝集。 再通过水解ATP释放此肽段，以利于肽链进行折叠。,22,伴侣素（chaperonins )： 是分子伴侣的另一家族 如E.coli的GroEL和GroES 真核细胞中同源物为HSP60和HSP10 等家族。 主要作用 为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间 构象的微环境。,23,伴侣素GroEL/GroES系统促进蛋白质折叠过程,24,2蛋白二硫键异构酶 （protein disulfide isomerase, PDI） 多肽链内或肽链之间二硫键的正确形成对稳定分泌蛋白、膜蛋白等的天然构象十分重要 部位：主要在细胞内质网进行。 原因：多肽链的几个半胱氨酸间可能出现错配二硫键，影响蛋白质正确折叠。 解决：在内质网腔活性很高 可在较大区段肽链中催化错配二硫键断裂并 形成正确二硫键连接。,25,PDI是一种含有巯基的酶，能随机切断及催化蛋白质中的二硫键，使之正确重排，形成热力学上最稳定的构象。 PDI通过催化巯基与二硫键的交换反应，从而催化蛋白质二硫键的形成、还原（断裂）或重排（异构化）。,26,并不是所有的蛋白质都含有二硫键，特别是在细胞内的多数蛋白质是不含有二硫键的，因为细胞内的环境是个还原性的环境。 近年来的研究表明，蛋白二硫键异构酶也参与了对蛋白质功能的调节。,27,3.肽酰基一脯氨酰顺反异构酶，（peptidyl prolyl cis-trans isomerase, PPI） 脯氨酸为亚氨基酸，多肽链中肽酰一脯氨酸间形成的肽键有顺反两种异构体，空间构象差别明显。PPI可促进上述顺反两种异构体之间的转换。 天然蛋白肽链中肽酰一脯氨酸间肽键绝大部分是反式构型，仅6为顺式构型。 在肽链合成需形成顺式构型时，PPI可使多肽在各脯氨酸弯折处形成准确折叠。,28,二、一级结构的修饰,场所：内质网、高尔基复合体的管腔中（外分泌蛋白前体的活化） （一）去除N-甲酰基或N-甲硫氨酸 酶：脱甲酰基酶，氨基肽酶 结果：切除N-甲酰基 切除N-末端Met或N-末端一段AA,29,蜂毒毒蛋白的加工成熟 蜂毒蛋白只有经蛋白酶水解切除N端的22个氨基酸以后才有生物活性。,30,（二）个别氨基酸的修饰 1.氨基末端乙酰化 2.甲基化 3.氧化（-SH -S-S-） 4.羧基末端的酰胺化 5.谷氨酸残基的羧基修饰 6. Pro, Lys OH 7. Ser, Thr, Tyr 磷酸化,31,1.氨基末端乙酰化 在N-乙酰转移酶的催化下将多肽链的氨基末端（或氨 基酸残基侧链氨基）乙酰化。 有两组乙酰转移酶：分泌蛋白乙酰转移酶和非分泌蛋白乙酰转移酶，都以乙酰CoA为底物。 十分普遍，估计体内50%的蛋白质有氨基乙酰化。 近年发现组蛋白的乙酰化在活化染色质，使它作为转录及复制的模板中起重要作用。,32,核小体中四种组蛋白各两分子构成的八聚体即核心组蛋白。 （多富含Lys残基） 它们的侧链氨基是乙酰化的位点。,33,2.甲基化 酶:甲基转移酶.存在:胞液(主要);细胞核(少量) 底物：S-腺苷蛋氨酸(SAM, 是Met活化产物），SAM的甲基被高度活化，称为活性蛋氨酸，是体内最重要的甲基直接供给体 甲基化位点：Lys,Arg, His的侧链；Gln的N-甲基化和Glu, Asp的O-甲基化.,34,35,3.氧化 蛋白质多肽链中进行氧化修饰最普遍现象是- 二硫键的生成。 酶：二硫键异构酶 作用：肽链内或链间的Cys巯基氧化成二硫巯基。,36,4.羧基末端的酰胺化 肽链羧基末端的AA可出现酰胺化，如C端是Gly的蛋白 质常被酰胺化，保护它免受羧肽酶的降解。 酰胺化分两步： 1）Gly羟基化； 2）脱去一分子乙醛酸并产生新的酰胺化的羧端。 结果：缺失了原来作为羧基端的Gly.,37,5.谷氨酸残基的羧基修饰 凝血酶原及其他涉及与钙离子相互作用的凝血因子如，和 中均发现有羧基化修饰的羧化谷氨酸残基（Glu残基）。 部位：内质网 过程：在Glu残基的碳原子上添加羧基 结果：Glu的碳原子上有两个羧基 作用：能螯合钙离子，在凝血过程中起重要作用。,羧化酶,38,6.脯氨酸和赖氨酸的羟基化修饰 前胶原是成纤维细胞分泌的pr，在生物合成过程中新生的肽 链进入内质网腔后，内质网中的脯氨酰-4-羟化酶和赖氨酰羟化 酶能分别识别肽链中的GlyXPro和GlyXLys序列，羟化Pro及Lys 残基。 产物：4-羟基脯氨酸（Hyp)及 羟基赖氨酸（Hyl)残基。 原胶原分子中的Lys残基可在赖氨酰氧化酶的催化下形成醛赖氨酸（aiiysine).,39,（三）水解修饰 无活性的蛋白质前体活性的蛋白质或多肽 如胰岛素的成熟 真核细胞大分子多肽前体数种小分子活性肽类,如鸦片促黑皮质素原(POMC)的水解修饰,40,41,鸦片促黑皮质素原(POMC)的水解修饰,42,三、空间结构的修饰 （一） 亚基聚合 具有四级结构的蛋白质由两条以上肽链通过非共价键聚合，形成寡聚体。如：血红蛋白22,43,（二） 辅基连接 结合蛋白中非蛋白质部分（辅基）通过共价键方式与蛋白质部分相连。 各种主要的结合蛋白（如糖蛋白、脂蛋白等），合成后都需要结合相应辅基，成为天然功能蛋白质,44,（三）疏水脂链的共价连接 某些蛋白质（如Ras蛋白、G蛋白等），翻译后需要在肽链特定位点共价连接一个或多个疏水性强的脂链，包括脂肪酸链、多异戊二烯链等。 这些蛋白通过脂链嵌入 疏水膜脂双层，定位成 为特殊质膜内在蛋白， 才成为具有生物功能的 蛋白质。,45,四、 蛋白质合成后的靶向输送,蛋白质合成后的去向： 1、保留在胞浆 2、进入细胞核、线粒体等细胞器 3、分泌到体液，再输送到靶器官、靶细胞 靶向输送*（protein targeting)： 蛋白质合成后经过复杂机制，定向到达其执 行功能的目标地点. 蛋白质的修饰反应与靶向输送过程同步完成,46,蛋白质的分类- 结构蛋白（structural protein)或固有蛋白（house keeping protein):合成后留在细胞内，如： 酶、细胞骨架、亚细胞器如线粒体、过氧化体、细胞核等 分泌蛋白（输出蛋白，export protein): 合成后输出细胞进入血液和细胞间液，如： 肝细胞制造的血浆清蛋白、凝血酶原、胰腺细胞合成的各种消化酶、胰岛素，免疫细胞合成的免疫球蛋白等。,47,所有靶向输送的蛋白质结构中存在分选信号- 主要为N末端特异氨基酸序列 可引导蛋白质转移到细胞的适当靶部位， 这类序列称为信号序列*（signal seguence) . 这提示指导蛋白质靶向输送的信息存在于它的一级结 构中。 靶向不同的蛋白质各有特异的信号序列或成分.,48,(一）与分泌蛋白的合成、转运有关的组分 1.信号肽*（signal peptide） 未成熟蛋白质的端序列，可被细胞转运系统识别 的特征性氨基酸序列。 存在：所有分泌pr、部分膜pr、溶酶体pr的N端共 同序列。 结构：一般含15-30个AA残基。 N端或接近N端为亲水区、带正电，长度常为1-7个AA(亲水极性,如Arg, Ser, Thr, Lys）； 疏水核心区含疏水中性AA C端-加工区（含极性、小侧链的AA；信号肽 酶裂解的部位）,49,紧接亲水区为疏水核心（hydrophobic core)，在分泌时起决定作用。该区段由15-19个AA残基组成，并以Gly或Ala等侧链较短的AA结尾。此结尾的AA恰好在切点之前。 疏水区中央常含Pro或Gly残基，由此将疏水区分成2个区。这2个螺旋如被破坏，会抑制pr的分泌。,50,信号肽的一级结构,51,未发现信号肽有保守序列；信号肽似乎没有严格的 专一性： 如将信号肽附加到正常存在细胞液中的球状蛋白 的N端，导致该球蛋白分泌到细胞外。,52,2.信号识别颗粒（signal recongnition particle, SRP）,存在细胞溶质中，一个长形颗粒 6条多肽链和一分子7S RNA共同构成，RNA构成核蛋白的骨架，6条多肽链各自形成独立功能的结构。 54kD亚基：识别信号肽； 9kD和14kD亚基二聚体：抑制分泌肽延长，使核蛋白体翻译停止，同时避免长肽链折叠； 68kD和72kD亚基二聚体：对SRP核蛋白体复合体的移位和识别SRP受体是必需的。,53,SRP作用： 1.识别、结合信号肽； 2.将核蛋白体复合体引导到内质网膜上并与受体结合； 3.暂时抑制肽链延长，避免长肽链折叠。,54,SRP抑制肽链延长，是由于SRP占据了核蛋白体的A位点，阻止了携带AA的tRNA进入核蛋白体，即切断了pr合成原料的进入。 SRP在分泌pr的转运过程只起短暂作用，但可循环利用，在细胞质内浓度很高，为核蛋白体的1/10。,55,3.对接蛋白（docking protein，）(SRP受体） 存在内质网膜上，由（GTP酶活性）和两个亚基组成。作用：一是引导SRP和新生肽链的复合物能正确地结合到内质网膜上；二是一旦SRP和新生肽链的复合物结合到内质网上，就促使SRP与其受体以及新生肽链和核糖体解离，成为游离的SRP，参与新的一轮SRP的循环。,56,ER膜上的转位器(translocon),包括了早前认为的核蛋白体受体等： 新生肽链跨膜的蛋白通道,57,（二）分泌蛋白的靶向输送过程,合成肽链先由信号序列引导进入内质网 （endoplasmic reticulum, ER)， 蛋白质再分别被包装进分泌小泡转移、融合 到其他部位或分泌出细胞。 （1）信号肽被识别 （2）核蛋白体转移到内质网膜 （3）分泌肽进入内质网腔,58,具体过程： 胞液游离核蛋白体上以mRNA为模板，合成出N端包括信号肽的最初约70个氨基酸残基。 SRP结合新生肽链N端的信号肽，多肽合成暂停，通过双重结合（SRP与其受体的结合；带有新生肽链的核糖体与内质网膜的结合），确保新生肽链正确无误地附着并进入内质网膜。 当核糖体与转位器正确对位接触后，可导致转位器的中央通道与核糖体大亚基的中央通道对齐，延伸中的新生肽链就能进入内质网。在平时转位器是关闭的，只是在新生肽链进入的瞬间是开放的。信号肽是引起转位器开放的触发因素。 信号肽将新生肽链引导进入内质网腔内后，在信号肽酶复合物作用下，切除。折叠，形成有空间构象的蛋白质，有的还需要运送到高尔基体等处进行进一步的加工修饰，才能成为有特定结构和功能的蛋白质，并被定位到机体中的特定部位行使其功能。,59,60,（三）线粒体蛋白的靶向输送 90以上线粒体蛋白前体在胞液合成后输入线粒体 其中：大部分定位基质 N端都有相应 其他定位内、外膜或膜间隙 信号序列 如：线粒体基质蛋白前体的N端有保守的2035残基 信号序列，称为导肽，富含丝、苏及碱性残基。,61,线粒体基质蛋白靶向输送过程如下： 胞液新合成的线粒体蛋白与分子伴侣HSP70或线粒体 输入刺激因子（MSF)结合，以稳定的未折叠形式转运 到线粒体。 蛋白质先通过信号序列识别、结合线粒体外膜的受体复合物。 再转运、穿过由线粒体外膜转运体（Tom）和内膜转运体(Tim）共同组成的跨内、外膜蛋白通道。以未折叠形式进入线粒体基质。基质HSP70水解ATP释能及利用跨内膜电化学梯度，为肽链进入线粒体提供动力。 蛋白质前体信号序列被蛋白酶切除，在上述的分子伴侣作用下折叠成有功能的蛋白质,62,63,（四）细胞核蛋白的靶向输送 多种细胞核蛋白在胞液合成后输入核内， 各种大分子及核内组装的核蛋白体亚基都是通过核孔 进出核膜。 核定位序列（nuclear localization sequence, NLS ) 所有靶向输送的胞核蛋白多肽链内含有特异信号序列 结构：为48残基的短序列， 富含带正电的赖、精氨酸及脯氨酸 肽链中位置：不只在N末端，可位于肽链不同部位。 特点：NLS在蛋白质进核定位后不被切除。 不同NLS间未发现共有序列。,64,真核细胞 有丝分裂完成后细胞核膜重建时，在胞液的各种具有NLS的胞核蛋白可被重新靶向导入核中。 新合成胞核蛋白靶向输送涉及几种蛋白质成分： 核输入因子（nuclear importin) 和 异二聚体可作为胞核蛋白受体， 识别结合NLS序列。 Ran蛋白(一种小GTP酶)：Ran-GDP帮助输入蛋白入核，而Ran-GTP则是介导空载的输入蛋白亚基出核。,65,66,蛋白质分子在细胞内的降解,细胞内的蛋白质处于不断更新过程，基本上处于一个动态平衡：不断被合成，不断被降解。,67,一、与蛋白质降解相关的末端和内部序列 细胞内的蛋白质，出于细胞活动对特异蛋白质的需要，各自都具有一定的寿命，长短不一。 此外，细胞中受损蛋白、折叠或组装错误的蛋白都应及时清除。,68,1.研究表明，蛋白质分子N-末端残基影响蛋白质的寿命。 （1）稳定残基（stabilizing residues)： Cys,Ala,Ser,Thr,Gly,Val,Met 30Hours （2）一级去稳定残基（primary destabilizing residues): Lys,Arg,His;Phe,Leu,Ile,Tyr,Trp. 3min （3）二级去稳定残基（secondary destabilizing residues): Asp,Glu,Cys 。这些氨基酸可以被Arg-tRNA-蛋白转移酶（R-transferase)识别，然后在末端加上一个Arg残基。 （4）三级去稳定残基: Asn,Gln.可被一种N末端酰胺水解酶作用而变成Asp,Glu,之后再被Arg-tRNA-蛋白转移酶（R-transferase)识别，然后在末端加上一个Arg残基。,69,2.存在肽链内部的一些保守序列: 如Arg-X-X-Leu-Gly-X-Ile-Gly-Asx 和Pro-Glu-Ser-Thr(即PEST序列）,70,不依赖ATP和泛素； 利用溶酶体中的组织蛋白酶(cathepsin)降解外源性蛋白、膜蛋白和长寿蛋白质。,（一）蛋白质在溶酶体通过ATP-非依赖途径被降解,二、真核细胞内蛋白质的降解有两条重要途径,（二）蛋白质在蛋白酶体通过ATP-依赖途径被降解,依赖ATP和泛素 降解异常蛋白和短寿蛋白质,71,溶酶体是蛋白质降解的重要场所。细胞内外的蛋白质都可以通过不同的方式进入溶酶体。 细胞外的蛋白质，以及细胞质膜上的受体蛋白质，几乎都是通过胞吞方式进入溶酶体的。 细胞内蛋白质进入溶酶体有非选择性和选择性两种形式。前者又可分为自体吞噬和分泌自噬；后者则是由氨基酸残基序列模体KFERQ介导的，但在营养充足的细胞中，该途径是关闭的。,（一）蛋白质在溶酶体通过ATP-非依赖途径被降解,72,2004年10月16日瑞典皇家科学院将本年度诺贝尔化学奖授予以色列科学家阿龙切哈诺沃、阿夫拉姆赫什科和美国科学家欧文罗斯，以表彰他们在泛素调节的蛋白质降解研究领域中的卓越成就。,（二）蛋白质在蛋白酶体通过ATP-依赖途径被降解,73,泛素(ubiquitin，Ub),76个氨基酸组成的多肽(8.5kD) 普遍存在于真核生物而得名 一级结构高度保守 酶促反应：其Gly与靶蛋白的Lys侧链相连；多聚泛素链。,1. 细胞内蛋白