沙田柚多倍体的获得与基因组原位杂交gish分析.pdf

中国农业科学 2008,41(6):1749-1754 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2008.06.023 收稿日期：2007-03-22；接受日期：2007-10-08 基金项目：国家自然科学基金（30600417）和重庆市教育委员会科学技术研究项目（KJ060313） 作者简介：向素琼（1971-） ，女，四川苍溪人，副研究员，博士研究生，研究方向为果树遗传育种与现代生物技术。Tel/faxE-mail： xsq 。通讯作者梁国鲁（1960-） ，男，重庆酉阳人，研究员，研究方向为果树遗传育种。E-mail：Lianggl 沙田柚多倍体的获得与基因组原位杂交（GISH）分析 向素琼 1,2，梁国鲁1，李晓林1，汪卫星1，郭启高1，何 桥1，陈 瑶1 （1西南大学园艺园林学院，重庆 400716；2中国农业科学院柑橘研究所 重庆 400712） 摘要： 【目的】沙田柚是中国特有的柚类名优品种，但种子多，一般 100 粒左右。为创新三倍体无核品种积 累育种材料，本研究通过实生筛选获得不同倍性沙田柚新种质，同时运用基因组原位杂交（GISH）技术分析天然 与人工四倍体新种质的染色体组组成。 【方法】随机采集沙田柚自然授粉果实，萌发种子检测其染色体数目获得倍 性变异植株；以 2x 母株 gDNA 为探针，同获得的 4x 植株中期染色体杂交进行 GISH 分析。 【结果】从 6 000 粒沙田 柚种子中共获得三倍体 5 株，四倍体 9 株；对沙田柚天然与人工四倍体新种质的基因组原位杂交（GISH）分析表 明，天然四倍体中有 7 株为异源四倍体，2 株为同源四倍体，秋水仙碱诱导获得的人工四倍体 4 株均为同源四倍 体；初步观察显示；与二倍体相比，四倍体植株生长缓慢，树冠较小，枝短而密生，叶片浓绿，宽度变宽，叶形 指数减小，叶片厚度增加明显。 【结论】多倍体单胚柚新种质的获得为进一步选育无核品种奠定了基础，同时 GISH 分析证实了沙田柚雌性未减数配子的存在。 关键词：沙田柚；多倍体；基因组原位杂交；未减数配子 Obtaining Polyploids and Genome Analysis of Tetraploids by GISH in Citrus grandis cv. Shatianyou XIANG Su-qiong1,2, LIANG Guo-lu1, LI Xiao-lin1, WANG Wei-xing1, GUO Qi-gao1, HE Qiao1, CHEN Yao1 (1Horticulture and Landscape College, Southwest University, Chongqing 400716; 2Citrus Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712) Abstract: 【Objective】 Shatianyou (Citrus grandis Osbeck. cv. Shatianyou) is an elite pummelo cultivar in China, but it is seedy with about 100 seeds per fruit. The aim of this experiment was to obtain different ploidy new germplasm for seedless triploid breeding by screening seedlings, and to analyze genome constitution of natural and artificial tetraploids by genome in situ hybridization (GISH).【Method】 Open-pollinated seeds were collected randomly, ploidy variation seedlings were screened by chromosome counting; In order to analyze genome constitution of tetraploids, the labeled total gDNA of diploid as probe was hybridized to tetraploid metaphase chromosomes by GISH. 【Result】Five triploids and nine tetraploids were found from 6 000 seeds. GISH analysis of tetraploids showed that there were seven allotetraploid and two autotetraploid in natural tetraploids, while four artificial tetraploids from colchicine induction were all autotetraploid. Preparatory morphology observation on different ploidy plants suggested that tetraploids grew slower than comparable diploids. Tetraploids have smaller tree crown , shorter vernal branches, greener and obvious thicker leaves than corresponding diploids, but with smaller leaf indexes because of their bigger width. 【Conclusion】These monoembryonic polyploids are valuable for seedless breeding. GISH result has proved the existence of unreduced eggs in Citrus grandis cv. Shatianyou. Key words: Citrus grandis Osbeck. cv. Shatianyou; Polyploid; Genome in situ hybridization (GISH); Unreduced gamete 0 引言 【研究意义】中国是柚类人工栽培最早的国家， 品 种 繁 多 ， 沙 田 柚 （ Citrus grandis Osbeck. cv. Shatianyou） 为中国特有的柚类名优品种， 但种子数平 均每果 100 粒左右，很大程度上影响了其可食性和商 品性，降低了在国内外市场上的竞争力。因此，选育 无核沙田柚品种显得迫切而具有重要经济价值。【前 1750 中 国 农 业 科 学 41 卷 人研究进展】减少种子数一直是沙田柚育种的主要目 标之一，国内有许多学者在选育无核沙田柚方面进行 了包括激光诱变、植物生长调节剂诱导单性结实、体 细胞杂种四倍体授粉产生瘪籽、少籽或无核果实1等 研究，但由于产量或品质等原因至今仍未见有大面积 的无核沙田柚商业生产。 而有关沙田柚多倍体的研究， 目前仅有宋健坤等2报道以沙田柚为母本，用体细胞 杂种“橘柚+无酸甜橙”的花粉授粉获得了含沙田柚 血统的三倍体。此外未见报道。【本研究切入点】柑 橘天然四倍体种质较少，而用于有性杂交培育三倍体 无核品种的单胚四倍体亲本更少。本研究目的是筛选 沙田柚自然授粉实生苗中的倍性变异，获得单胚柚的 三倍体和四倍体新种质，为进一步培育无核三倍体品 种奠定基础。同时为探讨多倍体来源，采用基因组原 位杂交 （GISH） 技术对其进行了染色体组成分析。 【拟 解决的关键问题】从沙田柚实生苗中获得多倍体，建 立柑橘基因组原位杂交流程并运用其初步分析部分多 倍体的基因组组成。 1 材料与方法 1.1 沙田柚多倍体的实生筛选 果实近成熟时随机采收沙田柚果实（来源于国家 果树种质重庆柑橘圃） ， 从自然授粉果实中取出种子， 促其萌发生根，检测根尖染色体数目，从中筛选多倍 体植株。染色体标本的制备采用去壁低渗火焰干燥 法3并略有改进。 取根尖分生组织， 室温 0.002 molL-1 8-羟基喹啉处理 23 h，然后于新配置的甲醇-冰乙酸 （31）固定液中固定。3%纤维素酶和果胶酶混合液 中解离 23 h，低渗 10 min，再固定 30 min，火焰干 燥涂片。5% Giemsa 染液染色 510 min，冲洗晾干， 镜检倍性。 1.2 不同倍性植株形态学观察 以同期栽植的沙田柚二倍体植株为对照，观察 7 年生四倍体生长状况， 测量相同发育时期的植株高度、 干周、当年春梢长度及春梢成熟叶片的长度、宽度和 厚度， 春梢长度和叶片每株各测 30 个求平均值。 二倍 体植株为 5 株求平均值。 1.3 基因组原位杂交材料 探针：沙田柚二倍体母株，来源于国家果树种质 重庆柑橘圃，提取 gDNA 标记为探针； 染色体标本材料：沙田柚二倍体母株；沙田柚天 然四倍体 9 株；作者通过秋水仙碱诱导获得的人工四 倍体 4 株。 1.4 基因组原位杂交流程 沙田柚二倍体母株 gDNA 的提取参照熊光明等4 的方法进行；标记采用随机引物法，DIG-High Prime 标记试剂购自 Roche 公司。 取茎尖或 25 mm 长的嫩叶制备染色体标本， 方 法同 1.1。 制备好的染色体标本于 60烘箱中干燥约 6 h，100 gml-1的 Rnase A 37消化 1 h，2SSC 漂去 盖片，2SSC 洗涤 35 min，用 70%、90%和 100% 乙醇依次脱水，每级 3 min；0.01% Pepsin 37处理 1015 min，1PBS 洗涤 25 min；1%甲醛（50 mmolL-1 MgCl2，1PBS 配制）于室温固定 5 min， 2SSC 漂洗 35 min。 变性：70%去离子甲酰胺（2SSC 稀释）68变 性 2 min， 立即通过预冷的梯度乙醇脱水 （70%， 90%， 100%），每级 5 min。 原位杂交：每张制片 20 l 杂交液，含 50%甲酰 胺，10%硫酸葡聚糖，2SSC，2 ngl-1探针，0.5 g ssDNA。涡流混匀，在 PCR 仪上 97变性 10 min 后 立即于冰浴中放置 10 min。杂交液滴加于染色体制片 上，加盖玻片，密封，37水浴杂交过夜。 洗脱与杂交信号的检测： 2SSC 漂去盖片， 0.1% SDS（2SSC 配制）37漂洗 35 min，0.1% SDS （0.2SSC 配制）37漂洗 35 min，2SSC 室温 下冲洗 2 次，甩干制片。加 100 l片封阻试剂，加 盖片，37封阻 30 min。甩干封阻液，加 3050l 片 Anti-DIG-FITC（用封阻试剂与 1PBS 稀释），加 盖片，37温育 1 h。1PBS/Tween20（0.2%）37 漂洗 35 min，12 gml-1 PI 衬染 10 min，抗荧光 衰减剂（Vectashield，H-1000）封片。 Olympus BX60 荧光显微镜观察，SPOT Cooled CCD 装置俘获图像并摄影。 2 结果与分析 2.1 沙田柚多倍体的获得 对随机采收沙田柚果实的所有大小种子进行倍性 检测，从 6 000 粒种子中筛选出三倍体（2n=3x=27， 图 1-B）5 株、四倍体（2n=4x=36，图 1-C）9 株，其 发生频率分别为 0.08%、0.15%，其余均为二倍体 （2n=2x=18，图 1-A）。尽管多倍体发生率不高，但 说明通过此途径可以获得柑橘多倍体。选出的三倍体 其种子大小约为正常种子的 1/22/3（图 1-D），并 非小粒种子而属于中粒种子，而天然四倍体其种子大 小属于正常种子范畴（图 1-D）。检查中也发现某些 6 期 向素琼等：沙田柚多倍体的获得与基因组原位杂交（GISH）分析 1751 个体中有少量非整倍体细胞，但并不存在完全的非整 倍体植株，或许非整倍体在二倍体杂交后代中较多倍 体杂交后代中少见57。 2.2 沙田柚四倍体的基因组原位杂交分析 由于选出的三倍体生长势较弱，本文仅对选出的 天然四倍体和作者利用秋水仙碱诱导获得的人工四倍 体进行了 GISH 分析。二倍体母株的 gDNA 自身荧光 原位杂交如图 1-E，全部基因组都有信号，表明基因 组自身杂交是成功的，说明该 GISH 流程在技术上是 可行的。以沙田柚母株 gDNA 为探针，同四倍体中期 染色体杂交。结果表明，天然四倍体中有 7 株为异源 四倍体，2 株为同源四倍体，秋水仙碱诱导获得的 4 株人工四倍体均为同源四倍体。 在 7 株天然四倍体中，可以清晰地识别出两个基 因组（如图 1-F，G），近 18 条染色体上呈现较均匀 的几乎分布于整条染色体上的大而明亮的杂交信号， 说明这些天然四倍体染色体组构成中含有沙田柚二倍 体母本整个基因组，另 18 条染色体上信号很弱或无， 但两个染色体组间也有极少部分交叉杂交，可能是因 为两个基因组中含有部分相同的串联重复序列。 GISH 结果说明，这 7 株天然四倍体为异源四倍体，是通过 有性杂交获得，而不是由体细胞染色体单纯加倍而来 的，同时也进一步证实了柚雌性未减数配子的自然存 在。另 2 株天然四倍体与 4 株秋水仙碱诱导获得的人 工四倍体 GISH 结果类似如图 1-H，36 条染色体上均 有密布的信号，应为同源四倍体。 A：2n=2x=18；B：2n=3x=27；C：2n=4x=36；D：不同倍性实生植株；E：沙田柚 2x 自身 GISH；F：天然四倍体 GISH；G：天然四倍体 GISH 核型； H：诱导的四倍体 GISH 结果。图中标尺为 10 m A: 2n=2x=18; B: 2n=3x=27; C: 2n=4x=36; D: Seedlings of different ploidy; E: Self-GISH of 2x; F: GISH of natural tetraploid; G: GISH karyotype of natural tetraploid; H: GISH of induced tetraploid. Scale bars=10 m 图 1 沙田柚不同倍性体细胞染色体与实生植株及基因组原位杂交分析 Fig. 1 Different ploidy somatic chromosomes and genome analysis of tetraploids in Citrus grandis cv. Shatianyou by GISH 2.3 不同倍性沙田柚植株形态观察 观察 7 年生不同倍性植株生长状况，与二倍体相 比， 四倍体植株表现生长缓慢， 树冠较小 （图 2-h， i） ， 树高与干周分别为二倍体的 0.810.88、0.810.90 倍（表；图 2-f，g，h，i），春梢抽梢较二倍体短， 但密生，刺粗而长。春梢成熟叶片色泽浓绿，宽度变 宽， 叶形指数减小， 叶片厚度增加 （图 2-a， b， c， d） 。 异源四倍体叶片表现出比同源四倍体更浓绿、叶形指 数更小。天然四倍体的树高、干周、春梢长度、叶片 长度、宽度、厚度基本大于人工诱导四倍体。有别于 天然四倍体的叶片平整，人工四倍体叶片向内卷曲明 显（图 2-e）。测量中发现叶片厚度是鉴别多倍体与二 倍体的重要性状，尤其是天然四倍体厚度范围为 0.45 0.52 mm， 平均为0.49 mm， 明显大于二倍体的0.30 mm。 1752 中 国 农 业 科 学 41 卷 a：7 株天然异源四倍体叶片；b：2 株天然同源四倍体叶片；c：4 株人工同源四倍体叶片；d：2x 叶片（对照）；e：人工同源四倍体叶片内卷；f： 2x 树干；g：4x 树干；h：2x 树冠；i：多株 4x 树冠 a: Leaves of 7 natural allotetraploids; b: Leaves of 2 natural autotetraploids; c: Leaves of 4 artificial autotetraploids; d: Leaf of 2x(control); e: Involute leaves of artificial autotetraploid; f: 2x trunk; g: 4x trunk; h: Crown of tree of 2x; i: Crown of tree of 4x 图 2 不同倍性沙田柚植株树体与叶片比较 Fig 2 Comparison of plants and leaves of different ploidy of Citrus grandis cv. Shatianyou 表 不同倍性沙田柚植株树体与叶片比较 Table Comparison of plants and leaves of different ploidy of Citrus grandis cv. Shatianyou 叶片 Leaves 编号 Code 倍性及类型 Ploidy and type 树高 Tree height (m) 干周 Trunk diameter (cm) 春梢长度 Length of vernal branch (cm) 厚度 Thickness (mm) 长度 Length (cm) 叶宽 Width (cm) 叶形指数(长/宽) Leaf indexes T1 Allotetraploid 2.36 17.20 5.60 0.50 14.10 7.30 1.93 T2 Allotetraploid 2.38 16.90 6.00 0.52 13.60 7.60 1.79 T3 Allotetraploid 2.43 15.70 5.90 0.50 14.50 7.30 1.99 T4 Allotetraploid 2.30 16.40 5.40 0.45 12.60 7.00 1.80 T5 Allotetraploid 2.45 17.30 6.20 0.50 14.10 6.80 2.07 T6 Allotetraploid 2.28 15.90 7.00 0.50 10.70 5.70 1.88 T7 Allotetraploid 2.25 16.30 6.50 0.45 11.60 6.00 1.93 T8 Autotetraploid 2.35 15.40 6.30 0.50 10.80 5.40 2.00 T9 Autotetraploid 2.40 16.80 6.00 0.50 11.00 5.30 2.08 平均值 Mean Natural tetraploids 2.36 16.40 6.10 0.49 12.60 6.50 1.94 I1 Autotetraploid 2.25 15.60 5.40 0.35 10.50 5.40 1.94 I2 Autotetraploid 2.10 16.00 6.10 0.37 10.30 4.80 2.14 I3 Autotetraploid 2.20 15.20 5.20 0.35 11.30 5.40 2.09 I4 Autotetraploid 2.05 14.90 5.70 0.35 10.80 5.30 2.04 平均值 Mean Artificial tetraploids 2.15 15.40 5.60 0.36 10.70 5.20 2.05 2x (Control) Diploid 2.78 19.10 7.20 0.30 13.70 5.65 2.42 3 讨论 3.1 单胚柚三倍体 单胚材料由于作为育种母本时可以避免珠心胚的 干扰，因此在杂交育种中格外受到青睐，柚是柑橘属 中的单胚种。而沙田柚品质上等，但种子多，因此减 少种子数一直是育种者、 生产者与经销商共同的愿望。 关于柚的三倍体研究，Geraci 等所研究的 3 个柚类品 种中均未出现三倍体8。 陈力耕和胡运权9曾希望通过 小粒种子（大小为正常种子的 1/31/6）发现三倍体， 但沙田柚无论是人工杂交果还是自然授粉果都没有小 种子出现，本试验也发现其小种子比例极低。而岩政 6 期 向素琼等：沙田柚多倍体的获得与基因组原位杂交（GISH）分析 1753 正男研究发现，虽然本田柚的小粒种子都是二倍体， 但中粒种子却有 10%的三倍体10，本文发现的三倍体 种子大小与之描述的一致。由此看来，在柚类中，从 小粒种子中获得三倍体的可能性还有待商榷。 3.2 沙田柚天然四倍体的来源 多年的研究结果表明，多倍体主要是通过未减数 配子融合、体细胞染色体加倍以及多精子受精 3 种方 式起源的，目前普遍认为自然界绝大多数多倍体是通 过未减数配子的融合而产生的1113。柑橘多倍体一般 认为有两种不同的起源：有性的和体细胞的，但柑橘 的多胚现象增加了其复杂性。 通过雌性未减数配子获得 柑橘多倍体很早就被诸多外国学者由杂交后代倍性分析 推测和描述6,1416，而关于雄性未减数配子研究仅有 Cavalcante 等观察自然授粉植株小孢子母细胞减数分裂 时偶然发现其中一株的花粉粒大且形状不同， 可能是未减 数花粉， 另有两株在小孢子发生时期发现有二分体与三分 体，认为会产生2n 花粉17。未减数配子的起源很复杂， Geraci 等认为柑橘未减数雌配子是受遗传控制的，可 能机制是第二次减数分裂的减缩或胚囊形成前大孢子 的染色体加倍8。Esen 等研究也指出，产生一定比例 的未减数雌配子是特定母本的一种机能5。但到目前 为止没有直接细胞学证据明确具体成因。此外，众多 研究表明，外界及环境因素如温度、创伤、营养、水 分等都可以刺激产生未减数配子。 本试验采集沙田柚的周围环境基本为柑橘属材 料，尤其以柚类为多，但无酸柚。GISH 分析中由于 父本信息不明未加封阻 DNA， 却可以区分出天然异源 四倍体中的两个基因组，这说明这 7 株天然四倍体个 体中两个基因组亲缘关系可能较远，可能有另一基因 组（2n=2x=18）的 2n 花粉参与这些四倍体的形成， 但究竟父本为何还需要进一步观察研究。不过可以肯 定的是，这些异源四倍体不含酸柚的成分，它们即使 不直接具有生产利用价值，也可作为良好的原始育种 材料，在作为亲本选育无核三倍体上有实用价值。以 前报道柑橘天然四倍体多为同源四倍体，而笔者选出 的 9 株天然四倍体中有 7 株为异源四倍体，仅 2 株为 同源四倍体，可能是因为以前报道的天然四倍体主要 来源于珠心苗，而本试验品种沙田柚种子为单胚，且 存在自交亲和性不高的特点，所采种子可能多为异花 授粉杂交而来，从而形成了异源四倍体。目前，这些 植株已有少量单株开花，以后可对其开花结实特性与 果实经济性状展开研究，探讨其可能的父本及其进一 步作为亲本开展更多深入研究。 3.3 GISH 技术在果树多倍体育种中的应用 果树多倍体一般具有生长旺盛、果实大且少籽或 无籽、产量高、适应性和抗逆性强等特点，并且可利 用无性繁殖的方式固定其优良性状，在生产上长期利 用。因此果树的多倍体育种工作正越来越受到重视， 已经成为果树育种工作的重要组成部分18。果树在自 然条件下几乎都有自发多倍体，果树中的多倍体品种 也越来越多，苹果、梨、葡萄、草莓、香蕉、柿、李 等多种果树栽培品种为多倍体，要想对其来源与遗传 特性深入研究，GISH 无疑是一种特别有效的方法。 一般来说，研究减数分裂染色体的行为能够更深入了 解基因组与基因组之间的关系，过去仅仅通过形态观 察了解同源染色体配对，现在运用 GISH 技术不仅能 观察配对同源染色体的来源， 而且对鉴定染色体重组、 易位都非常有效19,20，同时对有丝分裂染色体也可区 分来源与发现变异， 现已在香蕉21,22、 柿23、 柑橘24,25 等果树上运用。但目前柑橘上仅用于柑橘属间杂种和 四倍体体细胞杂种分析，而对于二倍体基因组间关系 及更近的种间杂种分析还未见报道。今后随着多彩色 原位杂交与比较基因组原位杂交技术改进，同时对基 因组原位杂交机理新见解及其对杂交信号的准确理解 与分析新技术的涌现，GISH 技术可能在亲缘关系较 近的种间同源性分析上取得突破，相信其应用前景会 更广阔。 4 结论 单胚的柑橘多倍体尤其是四倍体很少见，本文获 得了宝贵的单胚沙田柚四倍体和三倍体新种质，为进 一步选育无核品种奠定了基础，同时通过 GISH 分析 证实了沙田柚雌性未减数配子的存在，为今后倍性定 向育种提供了理论基础。 References 1 刘可慧. 瘪籽沙田柚的获得及三倍体柑橘新种质创建研究. 湖南 农业大学硕士学位论文, 2004. 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