发菜蛋白质组双向电泳技术的建立及优化.pdf

西北植物学报,2009 ,29(8) :1550 - 1556 Acta Bot. Boreal.2Occident. Sin. 文章编号:100024025(2009)0821550207 3 发菜蛋白质组双向电泳技术的建立及优化 梁文裕1 ,2,王 星2,焦广飞1,张喜娟2,陈 伟1 3 (1 福建农林大学 生命科学学院,福州350002 ;2宁夏大学 生命科学学院,银川750021) 摘 要:为建立适用于发菜(Nostoc f lagellif orme)蛋白质组研究的双向电泳技术,对发菜蛋白质的提取、 裂解、 上 样量、IEF及SDS2PAGE电泳等关键步骤进行了优化,结果显示:发菜蛋白质主要分布在p H 47范围内,采用改 良TCA法可提高提取液中蛋白质的含量和双向电泳图谱的分辨率,裂解液含60 mmol/L DTT ,24 cm IPG胶条上 样量1. 5 mg时不仅提高了蛋白质的溶解性,而且改善了双向电泳的分离效果,得到近800个蛋白点,且蛋白点清 晰,图谱分辨率较好。采用优化后的双向电泳体系提高了发菜蛋白质双向电泳的分辨率和重复性,建立起一套适 用于发菜蛋白质组分析的双向电泳方法。 关键词:发菜;双向电泳;蛋白质组学 中图分类号:Q816文献标识码:A Establishment and Optimization of Two2dimensional Gel Electrophoresis for Proteome ofNostoc f lagellif orme LIANG Wen2yu1 ,2,WANG Xing2,J IAO Guang2fei1,ZHANG Xi2juan2,CHEN Wei1 3 (1 School of Life Sciences ,Fujian Agriculture and Forest University ,Fuzhou 350002 ,China ;2 School of Life Sciences ,Ningxia U2 niversity ,Yinchuan 750021 ,China) Abstract :In order to establish a two2dimensional gel electrophoresis (2D2E) protocol for proteomic study of N ostoc f lagellif orme,we optimized extracting method of total protein ,lysis method ,loading quantity and the key process of IEF and SDS2PAGE. The results showed that the protein spots were distributed mainly within the range of p H 47. Improved TCA method was obviously improve the protein content and resolu2 tion patterns ,lysis buffer contained 60 mmol/ L DTT and loading quantity of sample protein were 1. 5 mg/ (24 cm IPG trip) could obtain clear map and better separation effect. More than 800 protein spots with p H 47 were detected. by the way of staining with Colloidal coomassie blue R2250. The optimized protocol of N. f lagellif ormemarkedly minimized the interference from non2protein substances. Key words :Nostoc f lagellif orme;two2dimensional gel electrophoresis;proteomics 蛋白质组学(Proteomics)是以一个细胞或一种 组织基因组表达的全部蛋白质为研究对象,从个体 或细胞的所有蛋白质整体活动的角度来揭示或阐明 生命活动的基本规律1。双向电泳 (2 2dimensional gel electrophoresis ,22 DE) 技术是蛋白质组学研究的核 心技术之一2,包括蛋白质的提取和纯化、 等电聚焦 电泳、SDS2PAGE电泳、 凝胶染色及图像获取和分 析等技术。近年来,双向电泳技术在蓝藻类植物方 3收稿日期:2009202224 ;修改稿收到日期:2009207217 基金项目:国家自然科学基金(30760022) 作者简介:梁文裕(1969 - ) ,男(汉族 ) , 在读博士生,副教授,主要从事植物生物技术及植物分子生物学的研究。E2mail :liangwenyu2004 3 通讯作者:陈 伟,博士,教授,博士生导师,主要从事植物生理与分子生物学的研究。E2mail :weichen909 面的研究主要集中在模式单细胞水生种类如微囊 藻3、 鱼腥藻4和集胞藻5等。陆生蓝藻由于富含 多糖、 色素、 胶质等物质6,对电泳过程干扰很大,且 常规蛋白提取纯化技术无法满足双向电泳的要求, 造成双向电泳图谱蛋白点少,不清晰,背景混乱,从 而使陆生蓝藻双向电泳技术及蛋白质组研究受到很 大限制。 发菜(Nostoc f lagellif ormeBorn. )是陆生固 氮蓝藻,属蓝藻门(Cyanophyta)、 蓝藻纲(Cyano2 phyceae)、 念珠藻属(N ostoc ) , 其藻体由无数条念珠 状细胞组成的藻丝包埋在公共胶质鞘内构成复合 体,形状如发丝,干燥时呈黑褐色,吸水后膨胀呈墨 绿色或棕褐色。中国发菜主要分布西北干旱半干旱 荒漠草原地区,是当地生态系统的重要组成部分和 先锋植物,也是主要的生物固氮资源和食用藻类。 然而,由于发菜自然生长繁殖速度缓慢,分布范围 小,加之长期无计划掠夺式采收,使得有限的资源濒 临枯竭,草原生态环境也受到严重破坏。为此,国家 明令禁止采集发菜,取缔发菜贸易,并将发菜列为国 家二级保护植物。发菜作为一种特色植物资源,国 内外一些学者对其分布、 生态、 生理生化、 生长发育、 显微结构等基础性研究方面做了大量的工作6,对 发菜的生物学特性有了一定的认识,但由于发菜作 为一种低等陆生蓝藻的特殊性,其个体生长的分子 机制尚未探明,到目前为止大规模培养发菜或发菜 细胞并未有突破性进展7。为了深入研究发菜生长 发育的分子机制及其对逆境的应答机制,尤其是其 抗旱和抗紫外线机制,从蛋白质组水平上探索其蛋 白质及基因的表达差异显得尤为必要,然而发菜蛋 白质的双向电泳技术研究目前尚属空白,因此,本研 究对发菜蛋白质双向电泳技术中的影响因素进行了 探讨,建立了电泳技术并进行了条件优化,这不仅为 发菜蛋白质组学的研究奠定了基础,也为其他富含 多糖和具有胶鞘的陆生藻类蛋白质双向电泳技术提 供参考资料。 1 材料和方法 1. 1 材 料 实验材料发菜于2007年采自宁夏香山发菜自 然生长地。自来水冲洗后自然风干,贮存于- 80 冰箱备用。 1. 2 方 法 1. 2. 1 溶液配制 蛋白质提取液中含7 mol/ L尿 素、2 mol/ L硫脲、1 % (m/ V) CHAPS、1 % (m/ V) DTT;裂解液中7 mol/ L尿素、2 mol/ L硫脲、4 % (m/ V) CHAPS、2 %(V/ V) Ampholine ,使用前加入 DTT;水化液7 mol/ L尿素、2 mol/ L硫脲、2 % (m/ V) CHAPS、0. 5 %(V/ V) IPG缓冲液,20 mmol/ L DTT;平衡液50 mmol/ L Tris2HCl (p H 8. 8)、6 mol/ L尿素、30 %(V/ V)甘油、 2 %( m/ V) SDS、 痕量 溴酚蓝,第1次平衡加入DTT(平衡液 ) , 第2次 平衡加入碘乙酰胺(平衡液 ) ; 考马斯亮蓝染色液 为0. 025 %(m/ V ) R 2250、40 %(V/ V)甲醇、7 %(V/ V)醋酸;脱色液为 7 %( V/ V)醋酸、 5 %( V/ V)甲醇; SDS2PAGE凝胶储液及缓冲液、 电极缓冲液、 封胶 液等参照GE公司说明书。 1. 2. 2 发菜总蛋白质样品的提取 发菜总蛋白提 取方法分别为TCA2丙酮法8(A)、 酚抽法9(B)和 改良TCA法(C)。其中改良TCA法为取1 g发菜 液氮研磨至粉末,加入3 mL 50 mmol/ L Tris2HCl (p H 8. 8)继续研磨2 min ,加入10 mL蛋白质提取 液,4 静置23 h ,4、15 000 r/ min离心15 min , 取上清液,加入TCA使其饱和度达15 % ,充分振荡 后4 静置12 h ,4、15 000 r/ min离心30 min , 沉淀加预冷丙酮洗涤,4、15 000 r/ min离心15 min ,重复2次,沉淀置- 20 冰箱冻干备用。 1. 2. 3 蛋白质定量 称取蛋白质干粉20 mg ,加 0. 5 mL裂解液充分研磨,35恒温水浴2 h ,4、 15 000 r/ min离心15 min ,取上清液。Brafford 法10测定样品中蛋白质含量,以牛血清蛋白为标准 蛋白。 1. 2. 4 双向电泳 第一向固相p H梯度等电聚焦 (IEF) :仪器为IPGphor TM等电聚焦系统(Amersha Pharmacia Biotech公司) , IPG预制干胶条为24 cm ,p H 310、p H 47、p H 35. 6 (NL) ,水化液 与样品溶液终体积为450L。电泳参数设定为 20、50A/ trip ,30 V(12 h)、200 V(1 h)、500 V(1 h) 、1 000 V(1 h)、1 0008 000 V梯度(30 min)、 8 000 V(6 h)。 第二向SDS2PA GE垂直板电泳:等电聚焦完成 后胶条用新鲜配制的平衡液 (含100 mg/ 10 mL DTT)和平衡液 (含300 mg/ 10 mL 碘乙酰胺)分 别平衡15 min。配制T = 12. 5 %的聚丙烯酰胺凝 胶,待胶凝固后,将胶条轻推入玻璃板中,再用0. 5 % (m/ V)琼脂糖(电极缓冲液配制)封顶。采用Et2 tanTMDAL T 垂直板电泳系统(Amersha Pharma2 cia Biotech公司 ) , 开始电泳时10 mA/板,待溴酚兰 前沿移动到凝胶上后加大电流至30 mA/板,待溴 15518期 梁文裕,等:发菜蛋白质组双向电泳技术的建立及优化 酚蓝前沿跑至离胶底部0. 51 cm处,停止电泳。 1. 2. 5 凝胶染色及图像分析 电泳结束后迅速剥 离凝胶,置于考马斯亮蓝溶液固定染色24 h后, 换脱色液脱色,直至背景无色透明,蛋白点清晰为 止。染色后的双向电泳凝胶经过Perfection 2480 Photo透射扫描仪(EPSON公司)扫描保存图像,光 学分辨率为300 dpi(dot per inch) ,对比度与亮度采 用软件默认值。图像分析采用PDQuest软件进行。 2 结果和分析 2. 1 蛋白质提取方法的优化 由于发菜生长在干旱半干旱荒漠草原地区,藻 体不仅含有大量的多糖和色素,而且具有吸水能力 极强的胶鞘,使全蛋白质提取面临许多困难11,因 此,蛋白质提取方法是双向电泳成败的关键。3种 提取方法得到的蛋白质含量的变化表明(图1) ,酚 抽法得到的蛋白质含量最高, TCA改良法次之,而 TCA2丙酮法最低。在条件一致的情况下进行蛋白 质双向电泳(裂解液和水化液中DTT均为40 mmol/ L) ,TCA2丙酮法提取的蛋白质无法有效分离 (图2 ,A) ;酚抽法的双向电泳效果好于TCA2丙酮 法,但蛋白没有分开,且蛋白点不清晰,图像模糊(图 2 ,B) ;改良TCA法虽然蛋白质含量少于酚抽法(图 1) ,但电泳图谱显示蛋白质分离效果较好,蛋白点较 清晰(图 2 ,C) 。因此,改良TCA法是发菜蛋白质双 向电泳较适合的蛋白质提取方法。 2. 2 第一向IEF等电聚焦pH范围的选择 首先采用p H 310、 长24 cm的IPG线性胶 条,了解发菜蛋白质在双向电泳图谱上的整体分布 情况。在裂解液含40 mmol/ L DTT ,上样量为1. 2 图1 不同提取方法蛋白质含量 A. TCA2丙酮法;B.酚抽法;C.改良TCA法 Fig. 1 Protein content with different extraction method A. TCA2acetone method;B. Hydroxybenzene extraction method;C. Improved TCA method mg条件下的双向电泳图谱显示(图2 , C) ,大部分 蛋白点集中于p H 3. 57的范围,而在碱性端几乎 未检测到蛋白。因此,采用p H 47的IPG胶条能 比较全面分离发菜蛋白质。此外,由于部分蛋白质 等电点非常接近,彼此之间横向排列过于紧密甚至 图2 不同提取方法的蛋白质22DE图谱 A. TCA2丙酮法;B.酚抽法;C.改良TCA法 Fig. 2 22DE maps ofNostoc f lagellif orme under the different extraction method A. TCA2acetone method;B. Hydroxybenzene extraction method;C. Improved TCA method 2551西 北 植 物 学 报 29卷 图3 p H 35. 6 NL胶条蛋白质22DE图谱 Fig. 3 22DE map of proteins with p H 35. 6 NL strip inNostoc f lagellif orme 叠加在一起,如需进一步研究该范围内的蛋白质,可 选用窄p H范围的IPG胶条,如图3为采用p H 3 5. 6 NL的IPG胶条,在裂解液含40 mmol/ LDTT , 上样量为0. 8 mg的条件下得到的双向电泳图谱,结 图4 不同DTT浓度下蛋白质的裂解效率 Fig. 4 The soluble efficiency of proteins under the different DTT concentrations 图5 不同DTT浓度下蛋白质22DE图谱 A. 20 mmol/ L ;B. 40 mmol/ L ;C. 60 mmol/ L ;D. 80 mmol/ L Fig. 5 22DE maps of protein ofNostoc f lagellif ormeunder the different DTT concentration 35518期 梁文裕,等:发菜蛋白质组双向电泳技术的建立及优化 果表明部分在p H 310或p H 47的IPG胶条不 能清楚分离的蛋白质得到了有效分离。 2. 3 裂解液中DTT浓度对蛋白质双向电泳分辨率 的影响 裂解液中不同DTT浓度条件下蛋白质含量测 定表明,不同浓度的DTT对蛋白质干粉的溶解性 存在明显影响(图 4) 。DTT浓度为0100 mmol/ L 时,裂解液溶解的蛋白质含量在5. 2910. 40g/L 之间。当DTT浓度在080 mmol/ L时,蛋白溶解 量随DTT浓度升高而增加,当DTT为100 mmol/ L时,蛋白质溶解量又明显减少。这与杉木叶片蛋 白质双向电泳中DTT浓度与裂解液中蛋白质浓度 的变化相似12。选择DTT浓度分别为20、40、60 和80 mmol/ L ,上样量为1. 5 mg ,采用p H 47的 IPG线性胶条分析裂解液中DTT浓度对发菜蛋白 质双向电泳分辨率的影响。结果表明,p H 47的 胶条显著提高了酸性蛋白在凝胶上的分辨率,蛋白 点的分布较为均匀,但由于裂解液中DTT含量的 不同使蛋白质的检出率存在较大差别(图 5) 。当裂 解液中DTT浓度为20 mmol/ L时,得到的蛋白点 虽然较为清晰,但点数较少,仅约100个,低丰度蛋 白质的检测质量未得到改善,高丰度蛋白质出现严 重的拖尾现象(图5 ,A)。当裂解液中DTT的浓度 提高至4080 mmol/ L时,检出的蛋白点增多,一 些弱的蛋白点的信号强度也明显增强,蛋白质的分 离效果得到明显改善(图5 ,BD) ,但相比较而言, DTT的浓度为60 mmol/ L时,蛋白点更清晰,拖尾 较少,也更经济高效。 2. 4 上样量对蛋白质双向电泳分辨率的影响 每根胶条上样量分别为1. 0、1. 5、1. 8 mg ,裂解 液中DTT浓度为60 mmol/ L ,采用p H 47的 IPG线性胶条分析上样量对发菜蛋白质双向电泳分 辨率的影响。结果表明,上样量对蛋白质双向电泳 分辨率有明显影响(图 6) 。当上样量为1. 0 mg时, 蛋白点虽然无拖尾现象,但点数明显偏少,约300个 点(图6 ,A) ;上样量为1. 5 mg时,检测出的蛋白点 数达到800个,整个凝胶图上的多数蛋白点呈圆形, 边界清晰,分布较均匀,一些低丰度蛋白清晰可见 (图6 ,B)。上样量为1. 8 mg时,蛋白检出率与上样 量为1. 5 mg时没有明显差别,但一些高丰度蛋白 在电泳过程中明显影响其他蛋白质,分子量或等电 点相近的蛋白点无法有效分开,部分蛋白点有较为 明显的拖尾(图6 ,C)。因此,发菜蛋白质双向电泳 上样量为1. 5 mg左右时,电泳图谱效果较好,过高 或过低的上样量不利于获得高质量的电泳图谱。 图6 不同上样量下蛋白质22DE图谱 A. 1. 0 mg;B. 1. 5 mg;C. 1. 8 mg Fig. 6 22DE maps of protein ofNostoc f lagellif orme under the different loaded samples 3 讨 论 蛋白质的提取是双向电泳成败的关键。目前应 用于双向电泳的蛋白质提取方法主要为蛋白质沉淀 法和样本直接裂解提取法,不论采用何种方法,最根 4551西 北 植 物 学 报 29卷 本的目的是获得高纯度、 无干扰杂质和尽可能全部 的蛋白质。多糖可阻碍凝胶孔径,或导致蛋白质沉 淀,或延长聚胶时间,或出现水平条纹,对双向电泳 影响极大13。对于富含多糖的样品,目前大多采用 高速离心法或透析法去除14,然而由于发菜不仅多 糖含量丰富,而且还含有大量色素和胶质等物质,因 此本试验采用先溶解提取蛋白质,然后再沉淀离心 获得高纯度全蛋白,这样不仅去除了多糖、 色素、 胶 质和核酸等物质对双向电泳的干扰,而且降低了离 子的浓度,达到了双向电泳的要求。蛋白提取液和 裂解液中恰当的DTT浓度对蛋白质的溶解有重要 作用13,DTT能帮助打开蛋白质的二硫键,可促进 大多数半胱氨酸残基被还原,促进蛋白溶解。如果 DTT浓度过低,蛋白质溶解不完全,在聚焦过程中 蛋白质浓度过高而在胶条槽中沉淀、 不能很好地进 入IPG胶条中,电泳图谱中蛋白质点数偏少,但 DTT含量过高,反使蛋白溶解量下降,不仅影响样 品的p H梯度,而且过量的高丰度蛋白质也会阻滞 其他蛋白质在胶条上泳动,从而影响蛋白质分离。 双向电泳显示发菜蛋白质主要集中在p H 47 的范围内,酸性蛋白质的量明显大于碱性蛋白质的 量。此外,双向电泳图谱上约有23个高丰度的蛋 白,这些蛋白的存在可能会掩盖有相似等电点或分 子量的其他重要的低丰度蛋白,而低丰度蛋白往往 是生命活动中起重要作用的功能蛋白,因此,如果需 要深入研究某低丰度蛋白的结构及其功能,还须进 一步寻找或改进分离方法,如应用试剂盒去除高丰 度蛋白、 分步提取样品、 采用窄p H范围胶条等,进 一步分离该低丰度蛋白质。 上样量的高低直接影响电泳图谱上蛋白质点的 差异15。过低的上样量导致一些低丰度蛋白不能 显现,无法反应蛋白质组的全部信息,过高的上样量 会导致在聚胶过程中蛋白质在胶条槽中沉积,不能 很好地进入IPG胶条16。何文锦等13对灰木相思 蛋白质组双向电泳研究表明,采用p H 310 ,长24 cm的IPG胶条时,最适蛋白上样为1. 0 mg ,而本试 验采用p H 47 ,长24 cm的IPG胶条,上样量为 1. 5 mg时得到清晰、 蛋白点数多的图谱,当采用p H 35. 6 NL ,长24 cm的IPG胶条时,0. 8 mg的上 样量已完全达到进行蛋白质组分析的要求。因此, 上样量的选择,不仅要根据试验材料的不同,而且还 应考虑胶条p H范围、 胶条长度、 染色方法、 高丰度 和低丰度蛋白的分布等情况。此外,为了保证双向 电泳图谱的高重现性或差异蛋白的准确性,除了每 次试验条件一致外,上样量的精确定量应予以高度 重视。 第一向IEF电泳后,IPG胶条需经2次平衡后 再进行第二向SDS2PAGE凝胶电泳。平衡的目的 是使蛋白分子与SDS和还原试剂充分作用,使IPG 胶条的p H值维持在适宜的范围内,以确保SDS2 PAGE方向的合适迁移。DTT可使变性的非烷基 化的蛋白质处于还原状态,碘乙酰胺可使蛋白质巯 基烷基化,能较好地保护SH基团,防止它们在电泳 过程中重新氧化,并消除过量的DTT ,从而防止产 生点拖尾及纹理现象17。目前双向电泳大多采用 向平衡液 中加入150 mg/ (15 mL) DTT ,平衡液 中加入375 mg/ (15 mL)或450 mg/ (15 mL)碘 乙酰胺12 ,13。本试验采用平衡液 中加入100 mg/ (10 mL) DTT ,平衡液 中加入300 mg/ (10 mL) 碘乙酰胺,分别平衡15 min ,这样不仅达到了胶条 的平衡效果,得到了清晰和高质量的电泳图谱,而且 可以节约试剂用量,降低试验成本。 通过对IEF2SDS2PAGE条件的优化,建立了发 菜蛋白质组的双向电泳技术体系。选用p H 47 的IPG胶条,采用改良TCA法提取总蛋白,裂解液 中含7 mol/ L尿素、2 mol/ L硫脲、4 % (m/ V) CHAPS、 2 %( V/ V)两性电解质载体、60 mmol/ L DTT ,上样量1. 5 mg ,平衡液 中DTT浓度为100 mg/ (10 mL) ,平衡液 中碘代乙酰胺浓度为300 mg/ (10 mL) ,考马斯亮蓝染色,发菜蛋白质双向电 泳图谱上蛋白点数量约800个,蛋白点清晰,图谱分 辨率较好。 参考文献: 1 SCOTT D. 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