头孢霉发酵生产α-亚麻酸.pdf

头孢霉( Cephalosporiumsp. )发酵生产 2亚麻酸 1 戴传超, 1 袁 生, 2 李 霞, 1 陆 玲 (1南京师范大学生命科学学院,江苏 南京210097; 2 江苏省农业科学院农业生物遗传生理研究所,江苏 南京210014) 收稿日期:2000210209 基金项目:江苏省青年基金重点项目(BQ96025)和南京师范大学理科 青年基金项目 作者简介:戴传超(19702 ) , 男,江苏泗阳人,博士研究生,讲师,从事 真菌生理生化研究。 摘 要:研究了8种因子对头孢霉( Cephalosporium sp. ) 发酵产 2亚麻酸产量及其占总脂肪酸百分含量的影响。 有利于获得 2亚麻酸高产的条件包括:培养基中碳源为蔗糖30 g/L ,氮源为 (NH 4)2SO43 g/L ,起始pH为610 ,500 ml 三角瓶装100 ml培养基,接种20 %(v/ v)的菌种,20 培养10 d。在此条件下, 2亚麻酸产量达87166 mg/L ,占总脂肪 酸百分含量为23185 % ,干菌丝产量达到7182 g/L ,油含量占菌丝干重的8108 %。 关键词:头孢霉; 2亚麻酸;含量;产量 中图分类号: Q935 文献标识码: A 文章编号: 100024440(2001)0220104205 Production of 2 linolenic Acid byCephalosporiumsp. Fermentation 1DAI Chuanchao , 1Y UANSheng , 2LI Xia , 1LU Ling (1College of Biological Science , Nanjing Normal University , Nanjing210097, China; 2Institute of Agrobiological Genetics and Physiology , Jiangsu Academy of A2 gricultural Sciences , Nanjing210014, China) Abstract : Effectsof 8 factorson 2 linolenic acid(ALA) yield produced byCephalosporiumsp. and its proportion to total fat2 ty acid were studied. The factors beneficial to accumulate ALA were sucrose 30 g/L(carbon source) ,(NH4)2SO43 g/L (nitrogen source) ,initial pH 610 of culture medium,100 ml medium in 500 ml flask ,20 %(v/ v) inoculum concentration being cultured at 20for 10 d.Under this condition ,ALA could reach the yield of 87186 mg/L and 23185 % to total fatty acid ,and oil content oc2 cupied 8108 % to dry mycelium which was 7182 g/L1 Key words :Cephalosporiumsp. ; 2 linolenic acid(ALA) ; content ; yield 2亚麻酸 (C18 3 , 2 linolenic acid ,简称ALA , 2 3) 在人体内可以转变为二十二碳六烯酸 (C22 6 ,Do2 cosahexaenoic acid ,简称DHA , 2 3) 和二十碳五烯酸 (C20 5 ,Eicosapentaenoic acid ,简称EPA , 2 3) ,具有十 分重要的生理功能,被称为必需脂肪酸13。ALA 目前主要从植物油中获得4。由于常见植物油如菜 籽油、 豆油、 棉籽油中ALA含量很低(一般低于总脂 肪酸的10 %) ,而ALA含量高的亚麻籽油来源有 限4,因此探索ALA新的来源十分必要。微生物由 于富含多不饱和脂肪酸,而且生产不受季节限制,因 而有可能成为ALA的新来源之一。我们从土壤中 筛选获得1株头孢霉5,该菌在合成培养基上积累 的ALA可占总脂肪酸20 %以上。为此,拟进一步探 讨不同发酵条件对单位体积培养液中ALA的发酵 产量和ALA占总脂肪酸百分含量的影响,以期为工 业化生产ALA奠定基础。 1 材料与方法 111 菌种 头孢霉(Cephalosporiumsp. ) ,由南京师范大学 生命科学学院微生物实验室筛选、 鉴定5。 112 培养基 斜面培养基为PDA培养基5;基础发酵培养基 401江苏农业学报(Jiangsu J. of Agr. Sci.) ,2001 ,17(2) :104108 为:葡萄糖20 g/L、 (NH 4)2SO43 g/L、KH2PO42 g/L、 MgSO47H2O 013 g/L、NaCl 011 g/L、 酵母膏012 g/L、 蛋白胨011 g/L、pH610 ,121 灭菌20 min。 113 培养方法 将接有头孢霉菌种的斜面培养基从冰箱中取 出,转接活化,20 培养10 d ,倒入无菌水,用接种铲 刮取菌丝,转接入基础发酵培养基中,20、150 r/ min振荡培养2 d作为液体菌种,再接种于基础发 酵培养基中,20、150 r/ min振荡培养。 114 最佳培养条件的确定 11411 培养时间 检测振荡培养214 d的ALA 产量和含量,ALA产量最高时为最佳采收时间。 11412 碳源 分别以蔗糖、 麦芽糖、 甘油、 玉米粉和淀 粉5种碳源替代基础培养基中的葡萄糖进行比较。 11413 氮源 分别以氯化铵、 硝酸钾、 尿素、 蛋白 胨、 酵母膏5种氮源代替基础培养基中的硫酸铵进 行比较。 11414 碳源浓度 分别以10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L葡萄糖代替基础培养基中的20 g/L葡萄糖,进行比较。 11415 温度 分别以10、15、20、25、30、 35 的培养温度,取代基础培养条件中的20。 11416 培养基起始pH值 配制培养基时,用盐酸 或氢氧化钠将其分别调节到pH4、pH5、pH6、pH7、 pH8、pH9。 11417 装液量 刮取菌丝后分别转接入装有50 ml、100 ml、150 ml、200 ml、250 ml、300 ml基础发酵培 养基的三角瓶中,比较最佳培养基用量(培养液体菌 种及其它试验所用培养基均为100 ml)。 11418 接种量 将液体菌种分别按5 %、10 %、 15 %、20 %、25 %、30 %(v/ v)的量接入基础发酵培养 基中进行比较如无特殊说明,其它试验接种量均为 25 %(v/ v) 。 115 分析方法 11511 菌丝收获及脂肪酸气相色谱分析 菌丝收 获、 脂肪酸甲酯化及气相色谱分析方法参见文献5。 气相色谱仪为惠普上海分公司产HPSF1890型。数据 处理用3295积分仪,具体分析条件同文献5。 11512 菌丝油脂含量及油脂中总脂肪酸含量的测 定 菌丝油脂含量用索氏抽提法测定6,油脂中总 脂肪酸含量的测定参见文献7。 11513 ALA产量及其占总脂肪酸含量比例的计算 ALA产量计算方法同文献5。通过与气相色谱相 连的3295积分仪,用面积归一化法计算,并由电脑 打印出总脂肪酸中各组分含量。 2 结 果 211 培养时间 由图1可见,ALA产量及其占总脂肪酸含量的 比例均随发酵天数增加而增大,至第10天达最高 值,10 d后,两者均下降。 图1 培养时间对 2亚麻酸含量和产量的影响 Fig.1 Effect of culture time on ALA content and yield 212 碳源 以5种碳源(20 g/L)分别替代培养基中葡萄 糖,保持氮源 (NH 4)2SO43 g/L不变,比较不同碳 源对发酵产ALA的影响。结果显示,该菌丝在玉 米粉和淀粉中几乎不生长,而在其余4种碳源中, 均生长良好。其中蔗糖为碳源时, ALA产量及其占 总脂肪酸含量的比例均最大(表1) ,说明蔗糖是 最佳碳源。 表1 不同碳源对 2亚麻酸含量和产量的影响 Table 1 Effects of different carbon sources on ALA content and yield 2亚麻酸 ALA 碳源 Carbon source 葡萄糖 G lucose 蔗糖 Sucrose 甘油 G lycerin 麦芽糖 Maltose 玉米粉 Cornmeal 淀粉 Starch 含量Content ( %) 14150211271116819170416721123 产量Y ield (mg/L) 26104361931913031141 痕量 Trace 痕量 Trace 501戴传超等:头孢霉(Cephalosporium sp. ) 发酵生产 2亚麻酸 213 氮源 以5种 氮 源(3 g/L)分 别 替 代 培 养 基 中 (NH 4)2SO4,保持碳源葡萄糖20 g/L不变,比较不同 氮源对发酵产生的影响。结果显示,该菌丝在6种 氮源中均生长良好,其中以 (NH 4)2SO4作为氮源时 可以获得最大的产量和较高的百分含量,说明 (NH 4)2SO4作为氮源有利于ALA高产(表 2) 。 表2 不同氮源对 2亚麻酸含量和产量的影响 Table 2 Effects of different nitrogen sources on ALA content and yield 2亚麻酸 ALA 氮源 Nitrogen source 硝酸钾 K NO3 氯化铵 NH4Cl 硫酸铵 (NH 4)2SO4 尿素 Urea 蛋白胨 Peptone 酵母膏 Yeast extract 含量Content ( %) 5144181591513391721314710121 产量Y ield (mg/L) 111102719630102151251612816198 214 碳源浓度 ALA占总脂肪酸的百分含量随葡萄糖浓度增加 而逐渐降低;当葡萄糖浓度低于30 g/L时,ALA产 量则随其浓度增加而逐渐增大,当葡萄糖浓度为30 g/L时,ALA产量最大,此时碳氮比为131 3/ 1( 图 2) 。 图2 葡萄糖浓度对 2亚麻酸含量和产量的影响 Fig.2 Effect of glucose concentration on ALA content and yield 215 温度 由图3可见,随着培养温度增加,ALA占总脂肪 酸的百分含量不断降低,培养温度为20 时ALA产 量最高,此时,ALA含量达22146 %。至35时,菌 丝已不再生长(图 3) 。 图3 培养温度对 2亚麻酸含量和产量的影响 Fig.3 Effect of culture temperature on ALA content and yield 216 培养基起始pH值 比较6种不同培养基起始pH值发现,在pH410 时,ALA占总脂肪酸的百分含量最高,为22196 % , 随pH值增加,ALA含量逐步降低,至pH710时,含 量急剧降至最低值 (11 147 %) ,进一步增加pH值,则 ALA含量又升高;在pH610时,ALA产量达到最大, 但此时ALA含量仅为21108 %(图 4) 。 图4 培养基起始pH值对 2亚麻酸含量和产量的影响 Fig.4 Effect of medium initial pHon ALA content and yield 217 装液量 在500 ml三角瓶中装入100 ml发酵培养基时, ALA产量及其占总脂肪酸的百分含量均达最高值, 但此后随着培养基用量的不断增加,两者反而下降 (图 5) 。 601江 苏 农 业 学 报 2001年 第17卷 第2期 图5 装液量对 2亚麻酸含量和产量的影响 Fig.5 Effect of medium volume on ALA content and yield 218 接种量 5 %20 %的接种量对ALA占总脂肪酸含量的 比例和产量几乎没有影响,但当接种量大于20 % 时,ALA含量和产量均下降。接种量为20 %时ALA 产量 和 含 量 相 对 较 高,分 别 为43156 mg/L和 24104 %(图 6) 。 219 脂肪酸各组分百分含量及产量的测定 当起始pH值为610的100 ml发酵培养基中碳 图6 接种量对 2亚麻酸含量和产量的影响 Fig.6 Effect of inoculum concentration on ALA content and yield 源为蔗糖30 g/L、 氮源为 (NH 4)2SO43 g/L时,接种 20 %(v/ v)的菌丝20 培养10 d后,干菌丝产量为 7182 g/L ,菌丝中油脂占8108 % ,油脂中总脂肪酸含 量为58115 % ,ALA含量占总脂肪酸的23185 % ,即 ALA产量达87166 mg/L。各脂肪酸组分产量和含量 见表3。 表3 脂肪酸各组分含量和产量 Table 3 Contents and yields of fatty acid compositions 项目 Item 脂 肪 酸Fatty acid C140C160C161C180C181C182C183C205C226其它Others 含量Content ( %) 01231713311601169131023111023185 痕量 Trace 011211106 产量Y ield (mg/L) 018563177518961224718811414487166 痕量 Trace 014440155 C140:豆蔻酸Myristic acid; C160:棕榈酸Palmitic acid; C161:棕榈油酸Palmitoleic acid; C180:硬脂酸Stearic acid; C181:油酸Oleic acid; C182:亚油酸Linoleic acid; C183: 2亚麻酸 2linolenic acid; C205:二十碳五烯酸Eicosapentaenoic acid; C226:二十二碳六烯酸Docosahex2 aenoic acid1 3 讨 论 ALA是DHA等 23多不饱和脂肪酸合成的前 体,在人体内可进一步转化为DHA2。学者们目前 多侧重于发酵生产DHA的研究,而对ALA则缺乏 足够的重视。ALA含有的不饱和键比DHA少,富含 ALA的油脂过氧化值远远低于富含DHA的油脂4, 且含有ALA的微生物菌种也比含DHA的多,因此 研究发酵生产ALA十分有意义。 311 发酵周期 微生物在生长对数期末期或稳定期开始,其多 不饱和脂肪酸含量及产量达最大值,此时是采收菌 丝的最佳时期8。已有研究发现,头孢霉生长的对 数期末期为10 d左右9。本研究中ALA的积累也 符合这一规律。 312 培养基 葡萄糖、 蔗糖、 甘油、 麦芽糖是合成多不饱和脂 肪酸的良好碳源8。本试验中蔗糖作为碳源时, 701戴传超等:头孢霉(Cephalosporium sp. ) 发酵生产 2亚麻酸 ALA含量和产量均最高,而ALA是由亚油酸经过 2 3脱饱和酶催化形成的10。说明,蔗糖可能有利于 亚油酸的脱饱和反应。本研究结果显示,两种无机 氮源 (NH 4)2SO4和NH4Cl均比有机氮源更有利于 ALA的形成,这与前人研究结果8一致。一般认为 C/ N过高不利于多不饱和脂肪酸含量的提高,而C/ N过低又会使生物量和油脂含量降低,从而导致油 脂产量下降8,这与本研究结果相似。但ALA产量 最高的C/ N(131 3/ 1) 与文献报道的20/ 130/ 1相差 较大,这可能与菌种不同有关。 313 培养条件 低温有利于多不饱和脂肪酸的合成,但低温对 于获得较大的生物量不利。因此本试验中ALA含 量在10最高,而20产量最大。本研究结果表 明,培养基起始pH值极大地影响ALA含量,中性培 养基尤其不利于ALA的生成,这可能由于培养基呈 中性时膜脂流动性较低造成的。一般认为,增加细 胞间的可用分子氧,有助于催化长链不饱和脂肪酸 的去饱和作用,有利于多不饱和脂肪酸的生成8。 因此,减少三角瓶的装液量对合成多不饱和脂肪酸 有利。本试验中,当装液量为100 ml时,ALA含量 及产量均最大,但此后进一步增加装液量,ALA含量 和产量则同步下降。值得注意的是,装液量小于 100 ml时也会导致ALA含量降低。由此推测,进一 步增加溶解氧对脂肪酸去饱和也是不利的。 314 产量的进一步提高 获得ALA含量高的培养条件,与高产条件有的 一致,有的则不一致。一致的条件为培养时间、 碳 源、 装液量和接种量;不一致的条件为氮源、 培养温 度、 培养基起始pH值和碳源浓度。鉴此,在发酵培 养基中采用混合碳源、 氮源8 ,11,或在发酵时采用两 阶段培养,即一阶段有利于菌丝体生长,一阶段积累 ALA的两步法