高生存性乳酸菌的筛选.pdf

2011年第39卷第4期（总第245期） zgrpgy 中国乳品工业 0引言 乳酸菌具有调节肠道菌群、增强机体免疫力等益 生作用1-3。 然而，人体胃肠道中的胃酸、胆汁等物质， 构成了一道天然屏障，使乳酸菌在通过消化道时会被 胃酸及肠道消化液所杀死。 因此，筛选能够活着进入 肠道、具有高生存性的乳酸菌，是益生菌开发首要考 虑的问题。 内蒙古作为我国的传统牧区，酸奶和奶酪是当地 牧民的主要食物来源。 传统的奶制品加工方法经过数 百年的优化，筛选，较好地保存了当地自然环境中的 有益乳酸菌，是天然的乳酸菌贮存库4。 本研究中，研 究人员从内蒙古四子王旗等地农户家中采集的酸奶 样品中成功地分离了80株乳酸菌，获得了具有耐酸和 耐胆盐的高生存性乳酸菌，并对这些分离的乳酸的耐 酸以及耐胆盐特性进行了详细的分析。 报道如下。 1材料 传统发酵乳制品。 培养基为MRSA实验室自制， API CHL培养基和API 50 CH试剂条， 糖发酵管，质 量分数为10%脱脂乳，pH值为2.0磷酸缓冲液，质量分 数为3猪胆盐溶液，仪器：厌氧罐，显微镜，生化培 养 箱 （SPX-250BS-）， 超 净 工 作 台 （SW-CJ- 2FD）。 2实验原理和方法 （1）菌株分离纯化。 菌株分离要使欲分离样品中 的乳酸菌尽可能多的暴露于培养基上，形成肉眼可见 的菌落。 首先，将实验材料进行10倍系列稀释，取10-3， 10-4，10-53种稀释度，涂布于MRSA平板上，37 厌氧 培养72 h后，根据标准植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸 乳杆菌的菌落特征以及参考相关文献图片，挑选可疑 菌落。 然后在有氧环境培养，连续传代不少于3次，获 得纯化的菌落。 （2）菌种初筛。 在乳酸菌中，乳杆菌通常具有比球 菌更好的耐酸耐胆盐能力，在消化道中的生存能力更 强，因此，该步骤的目的是初步获得乳杆菌。 根据文献 以及标准菌株的实验，乳杆菌在MRSA上的菌落为白 色、不透明、直径为23 mm；革兰氏阳性，过氧化氢阴 性，无芽胞，没有运动性，糖发酵产乳酸，可以发酵五 碳糖（核糖），可以在温度为15 和37 条件下生长。 因此，通过设定以上指标可初步确定为乳酸杆菌。 （3）菌种复筛。 作为具有益生特性的乳酸菌，其生 存性首先是对人体胃肠道屏蔽的耐受性，因此，菌种 复筛主要是对所获得的乳杆菌进行耐酸耐胆盐的检 测。 挑取1接种环菌株接种到MRS培养基中，培养37 （48 h），取出计数；同时，各取1 mL该发酵液，分别加 入至pH值为2.0的磷酸盐缓冲液中 （孵育37 ，2 h）， 和3的猪胆盐溶液（孵育37 ，6 h），取出后，立即进 行梯度稀释（0.85%灭菌生理盐水），进行菌落培养计 数，计算其存活率。 收稿日期：2011-01-17 作者简介：朱宏（1964-），男，博士，高级工程师，从事乳品科学研究。 高生存性乳酸菌的筛选 朱宏，陆淳，冯丽莉，卢晓丽，王世杰 (石家庄君乐宝乳业有限公司，石家庄050221) 摘要：对MRS培养基进行了厌氧培养，从内蒙古传统发酵乳制品中分离了80株菌，通过镜检、过氧化氢实验、发酵核糖、15 和37 发酵试验，获得了43株乳杆菌。 结果表明，14株菌具有一定的耐酸和耐胆盐特性；其中2株鉴定为副干酪乳杆菌和植物乳杆菌，分别命 名为Lactobacillus paracasei N1115和Lactobacillus plantarum N3114。 关键词：乳酸菌；高生存性；耐酸；耐胆盐；筛选 中图分类号：Q939.11+7 文献标识码：A文章编号：1001-2230（2011）04-0020-03 Screening of lactic acid bacteria strains with high survivability ZHU Hong，LU Chun，FENG Li-li，LU Xiao-li，WANG Shi-jie (Shijiazhuang Junlebao Dairy Co. Ltd., Shijiazhuang 050221, China) Abstract:There were 80 strains of bacterias isolated from traditional fermented milk in Inner Mongolia of China with anaerobic cultured in MRSA. Among 80 strains, 43 strains of Lactobacilli were proved with G+, H2O2test with positive, using ribose, growing at 15 and 37 .And 43 strains of Lactobacilli were assessed for for their survivability, 14 strains turned out to be acid resistance and bile salt tolerance. LAB spcies of 2 strains were identified and named Lactobacillus paracase N1115 and Lactobacillus plantarum. Key words：Lactic acid bacteria；high survivability；acid resistance；bile salt tolerance；screening 20 Vol.39，No.4 2011(total 245) Research Papers研究报告 （4）菌株鉴定。 对所获得的具有耐酸 耐胆盐的菌株， 根据不同培养基上的生 长特性进行分类，确定雷同菌株，然后对 同 一 类 中 具 有 更 好 特 性 的 菌 株 应 用 API50进行菌种鉴定。 3结果 3.1菌种的初筛 从传统发酵乳样品接种厌氧培养的 MRSA培养基上，共挑取白色、光滑的菌 落80个；经连续3代培养，共获得可以在 有氧环境培养的菌株53株， 其中球菌为 17株，杆菌36株。 经革兰氏染色、过氧化 氢、核糖发酵试验，最终获得过氧化氢阴 性、可以发酵核糖、不产气的革兰氏阳性 杆菌为29株。 此29株菌可初步断定为有 可能在发酵乳中使用的乳酸杆菌。 3.2菌种的复筛 对初筛获得的29株乳酸杆菌进行耐酸 耐胆盐实验，其中耐酸菌株17株，耐胆盐菌 株21株，能够同时耐酸耐胆盐菌株为14 株。 不同的菌株对酸和胆盐的耐受性存 在很大的差异。 有些菌株只能耐酸，不能 耐胆盐，如N4110，在酸液处理后的存活 比例为0.06，但是在胆盐处理后的存活 率却小于0.01； 有些菌株只耐胆盐，不 能耐受酸，如N3207，在胆盐溶液处理后 的存活率为0.04， 但是在酸液处理后的存活率却小 于0.01；有些菌株既能耐酸又能耐胆盐，如N1115、 N3114、N4111是所筛选菌株中具有较高耐酸和耐胆 盐水平的菌株， 尤其在酸液处理后的存活率能达到 120，在胆盐溶液处理后的存活率也能达到10 （如 表1所示）。 3.3菌株的初步鉴定 本研究对部分具有较高耐酸耐胆盐的菌株进行了 初步鉴定，结果如表2所示。 菌株的部分特性鉴定结果如 表3所示。 通过API50鉴定系统检测，N1115为干酪乳杆 菌（ Lactobacillus paracasei），N3114为植物乳杆菌（Lactobacil- lus plantarum）； 将其命名为Lactobacillus paracasei N1115和 Lactobacillus plantarum N3114； 并将其列入石家庄君乐宝 乳业有限公司菌种保存中心JMCC（Junlebao Microbiol- ogy Collection Center）编号为JMCC0001和JMCC0002。 表2N1115与N3114两菌株API50鉴定结果 项 目 0.对照 1.甘油 2.赤藓糖 3.D-阿拉伯糖 4.L-阿拉伯糖 5.核糖 6.D-木糖 7.L-木糖 8.阿东糖 9.B-甲基-D-木糖甙 10.半乳糖 11.葡萄糖 12.果糖 13.甘露糖 14.山梨糖 15.鼠李糖 16.卫茅醇 17.肌醇 18.甘露醇 19.山梨醇 20.a-甲基-D-甘露糖甙 21.a-甲基-D-葡萄糖甙 22.N-乙酰-葡糖胺 23.苦杏仁甙 24.熊果甙 48h 24h 48h 24h 项 目 25.七叶灵 26.柳醇 27.纤维二糖 28.麦芽糖 29.乳糖 30.蜜二糖 31.蔗糖 32.海藻糖 33.菊糖 34.松三糖 35.棉子糖 36.淀粉 37.糖原 38.木糖醇 39.拢牛儿糖 40.D-松二糖 41.D-来苏糖 42.D-塔格糖 43.D-岩糖 44.L-岩糖 45.D-阿拉伯糖醇 46.L-阿拉伯糖醇 47.葡萄糖酸盐 48.2-酮基-葡萄糖酸盐 49.5-酮基-葡萄糖酸盐 48h 24h 48h 24h N1115N3114N1115N3114 菌株 代码 N1115 N3114 N3207 N4110 N4111 核 糖 + + + + + 乳 糖 + + + + + 明胶 液化 - - - - - 原菌数 (对数值) 8.86 10.00 8.30 8.82 7.00 酸液处理后存 活数(对数值) 7.22 6.65 4 4.57 6.08 酸液 存活率/ 22.92 0.45 0.01 0.06 120.00 胆盐溶液处理后 存活数(对数值) 5.78 6.81 3.90 4 5.00 胆盐溶液 存活率/ 0.83 0.65 0.04 0.01 10.00 表1部分菌株对酸和胆盐的耐受性比较 注：“+”为反应阳性；“-”为反应阴性。 图1菌株显微镜图片 （a）Lactobacillus casei N1115 （b）Lactobacillus plantarum N3114 21 2011年第39卷第4期（总第245期） 产抗菌肽的培养条件J食品与生物技术学报，2006，25（6）：102-106. 6 ANDERSSEN ERLEND L, DIEP D B, INGOLF F N, et al. Antagonis- tic Activity of Lactobacillus plantarum C11: Two New Two-Peptide Bacteriocins，Plantaricins EF and JK, and the Induction Factor Plantaricin AJ. Applied and Environmental Microbiology，1998，6: 2269-2272. 7 RUFINO J, JOSE L R, DECLAN P C, et al. Purification and Partial Amino Acid Sequence of Plantaricin S, a Bacteriocin Produced by Lactobacillus plantarum LPCO10, the Activity of Which Depends on the Complementary Action of Two Peptides J. Applied and Environ- mental Microbiology，1995，11: 4459-4463. 8 LEAL-SANCHEZ M V, JIMENEZ-DIAZ R, MALDONADO- BARRAGA?N A, et al. Optimization of Bacteriocin Production by Batch Fermentation of Lactobacillus plantarum LPCO10 J. Applied and Environmental Microbiology. 2002，9: 4465-4471. 9 NILSSON L, MICHAEL K N, YIN N, et al. Role of Acetate in Pro- duction of an Autoinducible Class IIa Bacteriocin in Carnobacterium piscicola A9b J. Applied and Environmental Microbiology，2002，5: 2251-2260. 10 PAYNTER M J B, BROWN K A, HAYASAKA S S. Factors Af- fecting the Production of an Antimicrobial Agent, Plantaricin F,by Lactobacillus plantarum BF001 J. Letters Applied Microbiology， 1997，24: 159-165. 研究报告Research Papers 4结果与讨论 分离高生存性乳酸菌的关键步骤在于，乳酸杆菌 的初步分离。 本研究中样品取自内蒙古牧民自制的发 酵乳制品，内蒙古传统发酵乳制品是乳酸菌天然的宝 库，其中已报道5，6分离到的乳酸菌有保加利亚乳杆 菌、嗜热链球菌、明串珠菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、 嗜酸乳杆菌、双歧杆菌等。 但是，这种作为从野外收集 的原始样品中微生物资源丰富， 不仅有丰富的乳酸 菌，而且会会存在很多的杂菌，例如霉菌、酵母、耐热 芽孢杆菌、嗜冷菌等。 采用厌氧培养作为分离的第一 步， 使很多的杂菌不能生长， 大大缩减了工作量；同 时，以标准植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌的菌 落特征以及参考相关文献图片，挑选可疑菌落，具有 较强的针对性，然而由于初次分离经验不足，所挑取 的80株菌中，能够满足过氧化氢阴性、可以发酵核糖、 不产气、兼性厌氧的革兰氏阳性乳酸杆菌为29株。 由 于野生菌株不稳定性，很多菌株在连续培养的过程中 就逐步弱化，而不能生长。 本研究从内蒙古传统乳制品中分离得到具有耐 酸、耐胆盐的高生存性的2株乳杆酸菌并通过API50鉴 定系统检测为Lactobacillus paracasei N1115和Lactobacillus plantarum N3114。 副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei） 广泛存在于传统的发酵乳制品和人体胃肠道中7，目 前的研究发现，副干酪乳杆菌可增强宿主对微生物病 原体的非特异性抵抗力， 加快肠道内病原体的清除； 能够治疗肠道菌群紊乱和肠道通透性增强，从而防止 食物过敏和急性腹泻； 使抗低密度氧化脂抗体和 CD4T-淋巴细胞增加， 粒细胞的噬菌作用明显增强， 对宿主进行免疫调节，防止肿瘤的产生等作用8-10。 其 作为益生菌调节人体肠道菌群平衡、 增强免疫功能、 预防疾病等方面有着广阔的发展前景。 植物乳杆菌 （Lactobacillus plantarum）也是人体胃肠道的益生菌群，代 谢可以产生多种抑菌物质，具有调节肠道微生物菌群 的平衡，增强机体的免疫力，降低胆固醇水平，缓解乳 糖不耐症及抑制肿瘤细胞的形成等作用11。 副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）和植物乳杆菌 （Lactobacillus plantarum）是我国卫生部公布的可用于生 产普通食品的菌种名单中的菌种，因此，本研究所获 得Lactobacillus paracasei N1115和Lactobacillus plantarum N3114具有作为益生菌的良好潜质。 参 考 文 献： 1 LEDERBERG J. Infectious HistoryJ. Science, 2000, 288(5464):287- 293. 2 CHOW J, LEE SM, SHEN Y, et al. Host -bacterial Symbiosis in Health and DiseaseJ.Advance Immunology，2010,107:243-274. 3 GAREAU M G, SHERMAN P M, WALKER W A. Probiotics and the Gut Microbiota in Intestinal Health and Disease J.Nature Review Gastroenterology Hepatology，2010, 7(9):503-514. 4孙天松，刘红霞，倪慧娟，等.传统发酵酸驼乳中乳酸菌的分离及鉴 定J.中国乳品工业，2006，34（9）：4-7. 5李少英，乌尼，李培峰，等.内蒙古牧区乳与乳制品中乳酸菌资源及 其生态分布J.生态学杂志，2006,25（12）：1495-1499. 6李青青，陈启和，何国庆，等.我国传统食品中乳酸菌资源的开发J， 食品科学，2009，30（23）:516-520. 7庄海霁，雷虹，张铁丹，等.副干酪乳杆菌