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- 1 - 琯溪蜜柚果实成熟期间汁胞粒化过程中的活性 氧代谢 琯溪蜜柚果实成熟期间汁胞粒化过程中的活性 氧代谢1 佘文琴 1，潘东明1*，赵晓玲1，林慧颖2 1 福建农林大学园艺学院，福州（350002） 2 福建省平和县农业局，福建平和（363700） E-mail：pdm666 摘摘 要要：以琯溪蜜柚自交果、杂交果果实汁胞为试材，测定了果实汁胞丙二醛 (MDA)含量、 活性氧清除酶（POD、SOD、CAT）活性和内源抗氧化物质（AsA、GSH）含量在果实成熟 期间粒化过程中的变化。结果表明, 在果实成熟期间粒化过程中自交果、杂交果的粒化指数 和 MDA 含量随着果实成熟而上升; 汁胞 POD 活性在果实发育过程中大致呈下降趋势，9 月 8 日和 10 月 8 日有所上升; 粒化汁胞粒化指数、 MDA 含量和 POD 活性高于未粒化汁胞。 SOD活性的变化趋势与POD活性相似, 但自交果粒化汁胞SOD活性出现最低点时间早于未 粒化汁胞; 未粒化汁胞 GSH 、AsA 含量大于粒化汁胞。琯溪蜜柚果实汁胞粒化可能和汁胞 的活性氧代谢失调有关。 关键词关键词： 琯溪蜜柚，汁胞粒化，活性氧代谢 中图分类号中图分类号：S666.3 0 前言前言 琯溪蜜柚(Citrus grandis (L.) Osbeck) 属亚热带常绿乔木果树，是福建省最主要的栽 培柚类品种。琯溪蜜柚皮薄、肉嫩、汁多、酸甜适口、果大、味美、耐贮运等优良品质 而享誉海内外。但果实汁胞粒化现象严重，造成果实的食用品质下降，给果农带来很大 的经济损失。 研究表明,琯溪蜜柚果实粒化包括了一系列复杂的生理生化过程,琯溪蜜柚的 汁胞粒化发生时间在果实成熟期间和采后贮藏期间 1-2 。果实的成熟是一个生长并逐渐 趋于衰老的过程, 成熟过程伴随着自由基代谢。自由基学说研究认为生物体衰老过程是 活性氧代谢失调与累积的过程,近来的研究发现活性氧可能作为第二信使参与植物体内 的代谢及生命活动 3。活性氧及抗氧化酶系统在果实成熟衰老过程中的作用成为果实采 后生理研究的热点之一4-5。 关于柑橘类汁胞粒化活性氧代谢的研究主要集中于采后贮藏 阶段6-8, 活性氧代谢在果实成熟期间汁胞粒化发生中的作用研究仍较少。本文以福建省 主栽柚类品种琯溪蜜柚果实为材料，研究琯溪蜜柚果实成熟期间的活性氧代谢及其与果 实汁胞粒化发生的关系，旨在阐明活性氧代谢在琯溪蜜柚果实汁胞粒化发生中的作用， 为控制琯溪蜜柚果实汁胞粒化提供理论依据和实践指导。 1 材料与方法材料与方法 1.1 材料材料 供试材料采自福建省漳州市平和县新桥镇小溪村大坑果园，供试树为果园内树龄为 30a 的琯溪蜜柚老树。于 3 月中旬以泰国柚为父本对琯溪蜜柚老树进行授粉。以杂交果 为实验对照，于果实授粉后 140d 开始采果，从 8 月 8 日到 10 月 8 日，约每隔 10d 采果 一次，采收当天运至实验室（福州） ，选择大小均匀、色泽一致、无病虫、无损伤的健康 的自交果与杂交果各 20 个，运回实验室后立即处理。定期取样测定果实汁胞活性氧代谢 的指标。同时观察自交果与杂交果粒化情况，记录粒化指数。 1本课题得到教育部高等学校博士学科点专项科研基金（编号 20040389008）的资助。 - 2 - 1.2 方法方法 1.2.1 粒化过程中的粒化程度量化指标粒化过程中的粒化程度量化指标 果实粒化程度用粒化指数来定义, 粒化指数的测定参照潘东明等1的方法。 1.2.3 丙二醛（丙二醛（MDA）含量测定）含量测定 从20个果实中取果肉汁胞1 g， 按照林河通等9的方法测定MDA含量， 结果以mmol/FW 表示。 1.2.4 过氧化物酶过氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶活性、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶和过氧化氢酶(CAT)活性的测定活性的测定 从20个果实中取果肉汁胞1 g，加入10 mL 50 mmol/L (pH 7.0)的磷酸缓冲液(内含0.1% PVP)和适量石英砂，冰浴研磨，15 000 g冷冻（4）离心20 min，取上清液用于酶活性测 定。SOD和CAT活性的测定按照林河通等9的方法。POD活性的测定按照参照华东师大 ( 1980 )10 的方法。 1.2.5 还原型抗坏血酸还原型抗坏血酸(AsA)和还原型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽(GSH)含量测定含量测定 从 20 个果实中取果肉汁胞 1 g，按照林河通等9的方法测定 AsA 和 GSH 含量。 以上各指标测定均重复 3 次，取其平均值并进行统计分析。 2 结果与分析结果与分析 2.1 果实平均粒化指数情况果实平均粒化指数情况 图 1 可见， 在果实成熟期间粒化过程中自交果、 杂交果的粒化指数随着果实成熟而上升; 杂交果也发现粒化汁胞，其形态与自交果稍有不同，粒化时间晚于自交果，粒化程度和范围 轻于自交果。这和潘东明等1 的研究结果一致, 杂交果可以减轻粒化程度。 琯溪蜜柚老树(30a)粒化程度重于树龄低的琯溪蜜柚树 (资料另行发表) 。 图 1 琯溪蜜柚果实汁胞在成熟过程粒化阶段粒化指数的变化 Fig1 Variations of granulation index of Citrus guanxi-miyou at the stage of maturity 2.2 琯溪蜜柚果实粒化过程中琯溪蜜柚果实粒化过程中 MDA 含量的变化含量的变化 琯溪蜜柚自交果实汁胞 MDA 含量在成熟过程中呈上升趋势(图 2)， 8 月 18 日到 9 月 -10 0 10 20 30 40 8.88.18 8.289.89.18 9.28 10.8 日期 粒化指数 Granulation index （%） 自交果 杂交果 - 3 - 8 日上升幅度大, 9 月 8 日后变化趋势平缓,且粒化汁胞高于未粒化汁胞。杂交果果实汁胞 在成熟过程中也呈上升趋势，粒化汁胞 MDA 含量也高于未粒化汁胞，但在成熟后期 9 月底杂交果未粒化汁胞 MDA 含量和粒化汁胞相近。 图 2 琯溪蜜柚果实粒化过程中 MDA 含量的变化 Fig2 Variations of MDA content in juice sac of Citrus guanxi-miyou in the process of granulation during maturity MDA 是膜脂过氧化作用生成的初级产物， 其含量的多少反应膜脂过氧化作用的程度 11。琯溪蜜柚果实汁胞 MDA 含量的变化与粒化指数的变化相似。琯溪蜜柚的自交果果 实汁胞 MDA 含量随着果实发育时间的延长和粒化的加重而显著增大, 9 月 8 日后自交果 粒化汁胞的 MDA 活性高于未粒化汁胞,以及杂交果汁胞的 MDA 活性；而杂交果果实汁 胞 MDA 含量变化缓慢。表明粒化促进琯溪蜜柚果实汁胞的膜脂过氧化作用。 2.3 琯溪蜜柚果实粒化过程中琯溪蜜柚果实粒化过程中 POD 活性的变化活性的变化 植物组织中 POD 是在氢供体条件下催化 H2O2的分解， 而 H2O2促使组织发生过氧化 反应。图 3 表明，琯溪蜜柚果实汁胞在成熟阶段 POD 活性大致呈下降趋势，9 月 8 日和 10 月 8 日有所上升。粒化汁胞 POD 活性均高于未粒化汁胞。对于自交果实，8 月初粒化 汁胞 POD 活性是未粒化汁胞的 2.83 倍; 到 9 月 28 日为活性降至最低，粒化汁胞活性约 为未粒化汁胞的 3.51 倍; 到 10 月 8 日成熟后期，粒化汁胞活性迅速上升,为未粒化汁胞 的 3.4 倍。杂交果与自交果相比，其粒化汁胞 POD 活性低于自交果粒化汁胞。 图 3 琯溪蜜柚果实汁胞在成熟阶段 POD 活性变化 Fig3 Variations of POD activities in juice sac of Citrus guanxi-miyou in the process of granulation during maturity 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 8.88.18 8.289.89.18 9.28 10.8 日期 POD活性 POD activity (U/gFWmin) 粒化 未粒化 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 8.88.18 8.289.89.18 9.28 10.8 日期 POD活性 POD activity (U/gFWmin) 粒化 未粒化 杂交果 自交果 0 2 4 6 8 10 8.88.18 8.289.89.18 9.28 10.8 日期 MDA MDA content （mmol/gFW） 粒化 未粒化 0 2 4 6 8 10 8.88.18 8.289.89.18 9.28 10.8 日期 MDA MDA content （mmol/gFW） 粒化 未粒化 自交果 杂交果 - 4 - 通过多因素 LSD 方差分析对果实汁胞 POD 活性差异来源进行分析，表明杂交与不 杂交对 POD 影响差异显著（P0.05），粒化与不粒化对 POD 影响差异显著（P0.01）， 成熟时期对 POD 影响差异显著为（P0.01）。POD 活性高低可间接反映出生物体内的 H2O2水平，表明粒化可使琯溪蜜柚果实汁胞的 POD 酶活性增强。 2.4 琯溪蜜柚果实粒化过程中琯溪蜜柚果实粒化过程中 SOD 活性的变化活性的变化 图 4 可见，自交果琯溪蜜柚果实汁胞 SOD 活性与 POD 变化规律相似,呈成熟前中期 下降，后期上升的规律。自交果粒化汁胞 SOD 活性最低出现时间要早于未粒化汁胞，自 交果实出现 SOD 活性最低点的时间要早于杂交果实。在成熟后期(10 月 8 日)SOD 活性 上升，未粒化汁胞 SOD 活性高于粒化汁胞的 SOD 活性。 通过 LSD 方差分析差异来源显示杂交处理与成熟时期对 SOD 活性影响效应极显著 （P0.01），可能成熟过程中杂交果实与自交果实因种子有无引起内源激素水平差异， 导致前中期杂交果实 SOD 活性强于自交果实，从而使杂交果实粒化时间推迟，粒化程度 和范围较轻。SOD 在果实内清除超氧阴离子，在其能力范围内 SOD 活性受自由基水平 诱导，超氧阴离子水平越高其活性越强。在成熟后期汁胞 SOD 活性出现上扬趋势说明此 阶段其组织内自由基代谢旺盛。 图 4 琯溪蜜柚果实粒化过程中 SOD 活性的变化 Fig4 Variations of SOD activities in juice sac of Citrus guanxi-miyou in the process of granulation during maturity 2.5 琯溪蜜柚果实粒化过程中琯溪蜜柚果实粒化过程中 CAT 活性的变化活性的变化 图 5 可见, 自交果 CAT 活性变化趋势为“A”形，9 月 8 日出现活性最高峰，粒化汁胞 CAT 活性高于未粒化汁胞; 杂交琯溪蜜柚果实 CAT 活性变化在整个成熟阶段呈“M”形 态，在 8 月 18 日和出现两个高峰。在果实成熟期间汁胞粒化发生严重阶段(9 月 28 至 10 月 8 日), 未粒化汁胞 CAT 活性高于粒化汁胞的 CAT 活性。方差分析表明 CAT 活性差异 来源与粒化水平及成熟时期显著相关。CAT 活性与粒化有密切关系。 自交果 杂交果 0 40 80 120 160 200 8.88.18 8.289.89.18 9.28 10.8 日期 SOD活性 SOD activity (U/mgproteinh) 粒化 未粒化 0 40 80 120 160 200 8.88.18 8.289.89.18 9.28 10.8 日期 SOD活性 SOD activity (U/mgproteinh) 粒化 未粒化 - 5 - 图 5 琯溪蜜柚果实粒化过程中 CAT 活性的变化 Fig5 Variations of CAT activities in juice sac of Citrus guanxi-miyou in the process of granulation during maturity 2.6 琯溪蜜柚果实粒化过程中琯溪蜜柚果实粒化过程中 ASA 含量的变化含量的变化 对于自交果，粒化汁胞 ASA 含量变化与杂交果相似，但它到最低点早于杂交果,未 粒化汁胞表现为先下降后上升，末期稍微降低; 杂交果粒化汁胞与未粒化汁胞 ASA 含量 变化均表现为 “M”趋势。未粒化汁胞 ASA 含量高于粒化汁胞。(图 6) 图 6 琯溪蜜柚果实粒化过程中 ASA 含量的变化 Fig6 Variations of ASA content in juice sac ofCitrus guanxi-miyou in the process of granulation during maturity 2.7 琯溪蜜柚果实粒化过程中琯溪蜜柚果实粒化过程中 GSH 含量的变化含量的变化 对琯溪蜜柚自交果实，未粒化汁胞 GSH 含量变化规律为“M”形，分别在 8 月 28 日 和 9 月 28 日出现两个高峰，粒化汁胞 GSH 变化规律与其大致相同，但未粒化汁胞 GSH 含量大于粒化汁胞， 尤其在成熟后期差异显著。 对杂交果实， 粒化汁胞与未粒化汁胞 GSH 含量变化规律相似，在 8 月 28 日上升至高峰呈下降后保持平稳，未粒化汁胞 GSH 含量 稍大于粒化汁胞。自交果实汁胞 GSH 含量与杂交果实汁胞在成熟阶段前中期无明显差 异，在成熟后期差异较明显。(图 7) 0 20 40 60 80 100 8.88.18 8.289.89.18 9.28 10.8 日期 CAT活性 CAT activity (U/mgproteinmin) 粒化 未粒化 0 20 40 60 80 100 8.88.18 8.289.89.18 9.28 10.8 日期 CAT活性 CAT activity (U/mgproteinmin) 粒化 未粒化 自交果 杂交果 0 100 200 300 400 8.88.18 8.289.89.18 9.28 10.8 日期 AsA活性 AsA content (Ug/gFW) 粒化 未粒化 0 100 200 300 400 8.88.18 8.289.89.18 9.28 10.8 日期 AsA活性 AsA content (Ug/gFW) 粒化 未粒化 自交果 杂交果 - 6 - 图 7 琯溪蜜柚果实粒化过程中 GSH 含量的变化 Fig7 Variations of GSH content in juice sac of Citrus guanxi-miyou in the process of granulation during maturity 本试验中杂交琯溪蜜柚果实汁胞 GSH 含量出现一个高峰， 而自交果实汁胞出现两个 高峰， 可能自交果实汁胞自由基代谢较旺盛。 同时表明未粒化果实汁胞能保持较高的GSH 含量。 3 讨论讨论 在本试验中，琯溪蜜柚在成熟阶段粒化过程中 POD、SOD、CAT 酶活性变化与郑国 华等6在其采后贮藏期 POD、SOD、CAT 酶活性变化有很大差异,但 POD、SOD、CAT 酶活性到成熟采收期(10月8日)的变化趋势可以和采后贮藏阶段的酶活性变化互相衔接。 表明琯溪蜜柚活性氧代谢在琯溪蜜柚果实成熟期间汁胞粒化发生中的作用一直延续到采 后贮藏阶段。 POD 依照其生理功能的不同可分为两类：组成型和诱导型。一类催化 H2O2与多种 有机、无机氢供体发生氧化还原反应，在受到生理胁迫和病虫害伤害时，诱导 POD 活性 升高，有效防止进一步伤害12。组成型 POD 在液泡、细胞壁和胞质中，参与新陈代谢反 应，如木质素的生化作用，IAA 的分解，抵御病原体等13。Awasthi 和 Nauriyal 14研究 表明，缺锌使植物激素合成减慢，使过氧化物酶活性增强，而这有利于粒化果实中木质 素的形成。POD 极可能是解决粒化问题的关键所在。本试验汁胞 POD 在成熟前中期活 性下降，成熟后期开始上升，粒化汁胞 POD 活性高于未粒化汁胞。可能粒化汁胞内自由 基水平较高于未粒化汁胞，诱导高 SOD 活性将 O2.-歧化为 H2O2，较高水平的 H2O2又需 要 POD 和 CAT 高活性分解， 以确保机体自由基动态平衡。 高活性的 POD 部分清除 H2O2， 部分氧化酚类物质，参与木质素合成，形成细胞壁物质，分解和合成木质素是处于动态， 当合成速度大于分解速度，汁胞细胞壁便加厚，发生采前粒化。 SOD 作为清除 ROS 的第一道防线，将 O2.-歧化为 H2O2，然后由 APX 和 CAT 再分 解多余的 H2O2 ，未及时清除的 H2O2又可与 O2.-发生 Haber-weiss 反应生成有害的 OH。 琯溪蜜柚在成熟阶段 SOD 在成熟前中期活性下降，成熟后期开始上升。而自交果粒化汁 胞出现活性低谷时间早于未粒化汁胞；自交果实出现 SOD 活性低谷时间要早于杂交果 实，说明杂交果汁胞与自交果未粒化汁胞 SOD 活性差异可能由于内源激素诱导，推迟 SOD 活性出现活性低谷时间。 0 100 200 300 400 500 8.88.18 8.289.89.18 9.28 10.8 日期 GSH 含量 GSH content (U/gFW) 粒化 未粒化 0 100 200 300 400 500 8.88.18 8.289.89.18 9.28 10.8 日期 GSH 含量 GSH content (U/gFW) 粒化 未粒化 自交果 杂交果 - 7 - GSH 和 ASA 同为植物细胞抗氧化物质，配合抗氧化物酶起清除自由基的作用。细 胞在代谢过程中经常产生 H2O2，如不及时清除，可使细胞膜的-SH 失活。H2O2还使细胞 膜上的磷脂分子中不饱和脂肪酸发生氧化反应，产生脂质过氧化物，使细胞膜遭受损伤。 而以 GSH 为底物的谷胱甘肽过氧化物酶能催化 H2O2生成 H2O，催化脂质过氧化物生成 相应的醇，从而避免了对细胞膜的损伤。本试验中杂交琯溪蜜柚果实汁胞 GSH 含量出现 一个高峰，而自交果实汁胞出现两个高峰，可能自交果实汁胞自由基代谢较旺盛。未粒 化汁胞 GSH 、AsA 含量大于粒化汁胞,表明未粒化果实汁胞能保持较高的 AsA 和 GSH 含量。 综合以上结果，可认为琯溪蜜柚在成熟阶段粒化过程中，粒化汁胞 MDA 含量高于 未粒化汁胞,表明粒化促进琯溪蜜柚果实汁胞的膜脂过氧化作用; 未粒化果实汁胞能保持 较高 AsA 和 GSH 含量; 粒化汁胞自由基代谢较活跃于未粒化汁胞, 可能与活性氧在琯溪 蜜柚果实成熟期间汁胞粒化发生中的作用失调有关,同时 POD 活性高低和汁胞粒化关系 密切。 参考文献参考文献 1 潘东明，郑国华，陈桂信，等.琯溪蜜柚汁胞粒化原因分析J.果树科学.1999，16（3） ：202-209 2 张振钰， 谢志南， 许文宝. 琯溪蜜柚汁瓤分化和粒化过程的解剖学观察.植物学报J.1999， 41 （1） ： 16-19 3 Ron MOxidative stress, antioxidants and stress toleranceJTrends in Plant Science，2002，7 (9)：405-410 4 Ron M, Sandy V， Martin G, et al Reactive oxygen gene network of plantsJ Trends in Plant Science， 2004， 9 (10)：490-498 5 陈惠萍，陈晓敏，蔡世英香蕉果实后熟过程中活性氧代谢的变化J园艺学报，2002，27(5)：369-370 6 郑国华，潘东明，丘友萍，等柚果实采后组织含水量、保护酶活性与汁胞粒化的关系J福建农林 大学学报, 1999, 28（4）：428-433 7 胡西琴，邵蒲芬 宽皮柑桔果实贮藏期间汁胞粒化与某些生理特性的关系J园艺学报, 1997, 24 （2）：133-136 8 陈昆松，张上隆，李芳，等胡柚果实采后枯水的研究J园艺学报, 1995, 22（1）21-23. 9 林河通，席玙芳，陈绍军. 龙眼果实采后失水果皮褐变与活性氧及酚类代谢的关系J. 植物生理与分子 生物学学报，2005，31（3） ：287-297. 10华东师范大学生物系主编植物生理学实验指导M北京：人民教育出版社, 1980：143-144. 11Popham P L, Novacky A. 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