稀有人参皂苷IH901酶法转化与制备研究.pdf

1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 天然产物研究与开发Nat Prod Res Dev2009, 21: 103921044 文章编号: 100126880 (2009) 0621039206 收稿日期: 2009205218 接受日期: 2009207228 基金项目:厦门市科技创新资金项目(3502Z20062008,3502Z20061143) 3 通讯作者Tel: 86259222069983; E2mail: xmqingxuanyahoo. com. cn 稀有人参皂苷IH901酶法转化与制备研究 童庆宣 3 ,陈良华,明艳林,郑国华,齐晓辉,郑志忠 厦门华侨亚热带植物引种园天然产物研发中心,厦门361002 摘 要:本研究利用酶制剂蜗牛酶,酶法转化三七二醇组皂苷制备稀有人参皂苷IH901,正交实验优化酶解条 件,建立酶法转化工艺。结果表明:超声法提取三七总皂苷正交实验优化条件为用75%乙醇溶液, 15倍溶剂用 量,超声波提取210 min作为最佳条件,三七总皂苷得率为12. 21%;酶法转化二醇组人参皂苷制备稀有人参皂 苷IH901,正交实验优化的条件为物料比为6/1、 反应时间9 h、 反应温度为45、pH值为3. 0,酶解得率为 54124%;经硅胶柱分离获得IH901单体化合物, HPLC测定纯度达98%。酶法转化制备皂苷IH901的工艺方法 简便,切实可行,可为中试生产提供参考。 关键词:二醇组人参皂苷;酶法转化;稀有人参皂苷I H901 中图分类号:Q946. 91; R284. 2文献标识码:A Study on Enzymatic Transformation and Preparation of Rare Ginsenoside IH901 TONGQing2xuan 3 , CHEN Liang2hua,M I NG Yan2lin, ZHENG Guo2hua,Q IXiao2hui, ZHENG Zhi2zhong The Research and Developm ent Center forNatural Products, Xiam en Oversea Chinese Subtropical Plant Introduction Garden, Xiam en 361002, China Abstract:Rare ginsenoside I H901 was preparated through enzymatic transfor mation from protopanaxadiol ginsenoside of Panax notoginsengby snailase, hydrolysis conditions were opti mized by the orthogonal test, the enzymatic conversion processwas estabilished. The results showed that orthogonal test for optimization conditions of Ultrasonic extraction of Panax notoginoside(PNS) was solvent for 75% ethanol solution, 15 times the amount of solvent, 210 min ultrasonic ex2 traction as the bestoptimization of conditions, PNSwas 12. 21 percent rate; the affecting factorsof enzymatic transforma2 tion were studied and optimized, and the bestoptimal conditionswere obtained as following: 6/1 formaterial ratio, 9 h for reaction time, 45as reaction temperature and 3. 0 as pH value, the optimum rate of crude hydrolysate was 54. 24%. The ginsenoside IH901 was purified by silica gel column chromatogram. its purity was about 98% analyzed by HPLC. Enzymatic conversion process of I H901 preparation is simple, practical, can provide a reference in the trial production. Key words:protopanaxadiol ginsenoside; enzymatic transfor mation; rare ginsenoside I H901 三七为五加科人参属植物(Panax notoginseng (Burk) F. H. Chen) ,人参皂苷是三七的主要有效成 分,其中二醇组人参皂苷含量占大部分。人参皂苷 长期以来是人参类药材药理药效学研究的热点,近 年来研究表明天然二醇组人参皂苷如Rb1、Rb2等 口服后由肠道细菌所分泌的糖苷酶选择性水解C23 位糖配体,生成仅在C220位保留一个葡萄糖的次生 皂苷,称为稀有人参皂苷IH901 (Compound K,人参 皂苷M1) (图 1) 。I H901被认为是二醇组人参皂苷 的最终药用活性形式,在抗肿瘤 125 、 抗衰老5, 6 ,抗 炎症 7 等方面均表现较高活性。鉴于 IH901药物 的应用前景,目前制备人参皂苷I H901的研究备受 关注,由于其是肠道菌代谢的产物,在自然界不存在 而无法从人参类药材中直接分离获得,主要通过微 生物发酵转化和酶法转化的方法将人参皂苷在体外 进行改造获得 8 ,其研究目标主要锁定在对人参二 醇型皂苷C23和C220位的糖基结构修饰,即利用生 物修饰方法进行人参皂苷糖基改造,使人参、 西洋参 中含量较高的二醇型人参皂苷Rb, Rc, Rd等的糖基 经过水解作用,定向转化为稀有人参皂苷IH901。 本文通过植物化学方法,研究从三七中获得二醇组 皂苷酶解原料,利用酶制剂蜗牛酶转化制备稀有人 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 参皂苷IH901,正交试验优化酶解反应条件,最终确 定利用三七二醇组皂苷体外酶转化法制备稀有人参 皂苷IH901的工艺流程。 图1 IH901化学结构图 Fig11 Chemical structure of Ginsenoside I H901 1 材料与方法 1. 1 实验材料 三七药材购自厦门光华大药房,对照品人参皂 苷Rb1、Rc、Rd、Re、Rg1购自中国药品生物制品检定 所;对照品人参皂苷IH901由山东省天然药物工程 技术研究中心 提 供(纯 度 大于98% ) ;蜗 牛 酶 ( snailase)、 柚皮苷酶(naringinase)和木聚糖酶(xyla2 nase) 购自Sigma Chemical Co;果胶酶(Pectolase)和 纤维素酶(Cellulase)购自Yakult of Japan;2 葡聚糖 苷酶( 2 glucanase)购自Fluka 1. 2 仪器与试剂 旋转蒸发仪(Eyela Corporation) ;紫外分光光度 计(上海Unico UV22802H) ;冷冻干燥机( Ther mo, Modul Yod2230) ;液相色谱仪(Agilent 1100) ;核磁 共振仪 (AV 2400 Bruker BioSpin) ;乙腈购自merck 公司,其它化学试剂均为国产分析纯试剂。 1. 3 实验方法 1. 3. 1 超声波法提取三七总皂苷 称取三七粉末样品,加入10倍量95%乙醇,超 声提取60 min,抽滤,滤液减压浓缩成浸膏,加少量 的超纯水溶解,用乙醚脱脂脱色后,正丁醇多次萃取 获得三七总皂苷;为优化提取条件,称取9份20 g 样品,选定对提取率影响较大的溶剂用量、 超声时间 和乙醇浓度作为考察因素,每个因素取3个水平,按 照三因素三水平正交设计进行正交试验,考察不同 因素对总皂苷提取的影响,确定三七总皂苷最佳提 取条件。 1. 3. 2 硅胶柱分离制备二醇组皂苷 硅胶G(200300目)于110 活化60 min,湿 法装柱,三七总皂苷用少量洗脱剂CHCl3: n2BuOH: MeOH: H2O (20: 40: 15: 20下层)溶解,上样于硅胶 柱介质顶部;用洗脱剂冲洗,等量收集;用薄层层析 鉴定收集洗脱液,合并相同组份,减压浓缩,冻干备 用。 1. 3. 3 酶法转化制备稀有人参皂苷IH901 1. 3. 3. 1 最佳转化酶的筛选 选用果胶酶、 纤维素酶、 蜗牛酶、 2 葡聚糖苷酶、 柚皮苷酶和木聚糖酶6种酶作为筛选对象;二醇组 皂苷与酶以物料比8: 1溶解于pH 4. 6的磷酸 2 柠檬 酸缓冲液中;在40 恒温水浴中反应24、48、72、96 h,每隔24 h取各实验组离心管;终止反应,加入正 丁醇溶液分三次萃取,萃取液浓缩用甲醇溶解定容; 通过TLC检测不同酶解反应时间内的酶解产物,根 据TLC的斑点和颜色深浅判定酶解产物,比较不同 酶的酶解作用大小。 1. 3. 3. 2 酶法转化的正交优化 根据酶筛选结果,选择物料比、 反应时间、 反应 温度和pH值作为考察因素,每个因素设3个水平, 采用L9 (3 4 )正交实验优化酶法转化。按正交设计 的物料比加入二醇组皂苷和酶,在一定温度、pH值 下反应;终止反应后离心获得反应酶解物,沉淀用蒸 馏水洗涤,然后用少量甲醇多次溶解,离心,用容量 瓶中定容至10 mL。根据药典紫外分光光度计法测 定酶解物含量,以I H901标准品作标准曲线,得到浓 度在050g/mL之间回归方程:Y= 0.0192X- 010019 ( r 2 =0. 9996) ,根据回归方程计算产物浓度, 按公式:酶解物得率% = (10 酶解物浓度/二醇组 皂苷原料量)100%计算酶解物得率。 1. 3. 4 稀有人参皂苷I H901分离纯化和纯度测定 将1. 2 g粗制酶解物溶于少量洗脱剂中,湿法 上样于硅胶柱 (2 30 cm)顶部;用氯仿和甲醇为洗 脱剂梯度洗脱,用TLC检测收集组份,合并含目的 物组份,减压浓缩,结晶得稀有人参皂苷IH901;化 合物经波谱结构鉴定,纯度测定采用高效液相色谱 (HPLC)外标法。色谱条件:色谱柱为C18柱Di2 mension(1504. 6 mm) ;柱温: 25;检测波长: 203 nm;流速: 1. 0 mL /min;流动相:水 2 乙腈 (20: 80) ;进样量为10L。外标法测定以标准品IH901 为对照品;精密称取对照品和供试品,配制成溶液, 分别精密取10L注入仪器,记录色谱图,测定对照 品和供试品主成分的峰面积,按公式:供试品浓度= (供试品峰面积/对照品峰面积) 对照品浓度计算 出供试品浓度,按公式:纯度 = ( 供试品浓度 供试 品配制体积 ) / 供试品称取的量 100%计算制备的 0401天然产物研究与开发 Vol121 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. I H901样品的纯度。 2 结果与分析 2. 1 正交实验优化超声波法提取三七总皂苷的结 果 参考罗晓健 9 等测定方法 ,测定样品中总皂苷 含量,以药材中总皂苷含量为考察指标,正交试验测 定结果见表1。由极差R可知,各因素对三七总皂 苷提取的影响程度的依次顺序为 A ( 溶剂用量) B (时间) C(乙醇浓度% ) ,即溶剂用量对三七总皂 苷的提取影响最大,其次是提取时间,而乙醇溶度影 响最小,同时确定该实验的最佳因素优化条件应该 为A2B3C2,即用75%乙醇溶液, 15倍的溶剂用量, 超声波提取210 min作为最佳优化条件,根据优化 的条件进行验证实验,结果在最佳优化条件下提取 总皂苷得率为12. 21% ,该得率大于正交实验各组 总皂苷得率。 表1 正交实验结果与分析 Table 1 Design and result of orthogonal test 实验号 No. A溶剂用量 Dosage(倍) B时间 Time(min) C乙醇浓度 Concentration(% ) 总皂苷得率 Yield(% ) 110 (6 +4)90 (60 +30)609. 398 210 (6 +4)150(90 +60)7510. 414 310 (6 +4)210 (120 +90)909. 997 415 (9 +6)90 (60 +30)7510. 388 515 (9 +6)150(90 +60)9010. 128 615 (9 +6)210 (120 +90)6011. 326 720(12 +8)90 (60 +30)9010. 023 820(12 +8)150(90 +60)609. 398 920(12 +8)210 (120 +90)7510. 466 k1 9.9379.93710.041- k2 10.6149.98010.423- k3 9. 96310. 59610. 049- R0. 6770. 6600. 382- 2. 2 三七总皂苷和二醇组皂苷的TLC鉴定 取制备的三七总皂苷用甲醇溶解, TLC检测用 正丁醇:乙酸乙酯:水= 4: 1: 5为展开剂, 10%硫酸 乙醇溶液为显色剂,显色后皂苷呈不同程度的紫色 (图 2) 。从图可知三七总皂苷中含有常见的二醇组 皂苷和三醇组皂苷,与2005版药典鉴定图谱基本一 致。三七总皂苷经硅胶柱分离,不同皂苷由于极性 的差异被逐渐洗脱分离,收集的组份经TLC跟踪检 测获得3个组份,记为组份A、B和C。三个组份的 TLC鉴定图谱(图3) ,由图可知:组份A主要含有人 参皂苷Re和Rg1为主的三醇组皂苷,组份B主要 含人参皂苷Rb1为主的二醇组皂苷,而组份C主要 含齐墩果酸型皂苷,从而证明用硅胶柱层析得到分 离的二醇组皂苷和三醇组皂苷。 2. 3 转化酶的筛选 根据 中华人民共和国药典 , HPLC和TLC均 图2 三七总皂苷的薄层层析图 Fig12 TLC of Panax notoginsenosides 1. Rb1; 2. Rc; 3. Rd; 4. Re; 5. Rg1; 6.三七总皂苷Pa2 nax notoginsenosides 是人参皂苷定性分析检测方法, HPLC方法灵敏度 高,但TLC方法简单方便。本实验筛选6种酶不同 时间对二醇组皂苷转化效果,样品量大故选用快速 简便的TLC作为检测方法。根据TLC的斑点和颜 1401 Vol121 童庆宣等:稀有人参皂苷IH901酶法转化与制备研究 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 图3 二醇组皂苷薄层层析图 Fig13 TLC of Protopanaxadiol ginsenoside 1. Rb1; 2. Rc; 3. Re; 4. Rg1; 5.组份A fraction A; 6.组份B fraction B; 7.组份C fraction C 色深浅判定6种酶在不同时间内酶解产物的变化, 结果表明果胶酶、 蜗牛酶、 纤维素酶和柚皮苷酶96 h 内均能转化二醇组皂苷为IH901,2 葡聚糖苷酶和 木聚糖酶转化能力较差。蜗牛酶在24 h内就出现 大量转化产物皂苷IH901,中间产物少,酶解转化效 率最高,因此确定最佳转化酶为蜗牛酶。 图4 6种酶不同酶解时间酶解产物TLC图谱 Fig14 TLC of hydrolysate by 6 kind of enzymes in different re2 action time a.二醇组皂苷Protopanaxadiol ginsenoside; b.对照品I H901 control IH901; 1.果胶酶酶解产物hydrolysate by pectinase; 2.纤维素酶酶 解产物hydrolysate by cellulose; 3.蜗牛酶酶解产物hydrolysate by snailase; 4.2 葡聚糖苷酶酶解产物hydrolysate by 2 glucanase; 5.柚 皮苷酶酶解产物hydrolysate by hesperidinase; 6.木聚糖酶酶解产物 hydrolysate by xylanase 2. 4 正交实验优化酶法制备IH901工艺的结果 测定酶解物中皂苷含量,以酶解物中皂苷含量 为考察指标,正交实验结果见表2。由表中极差R 大小,可知各因素对蜗牛酶酶解转化二醇组皂苷反 应的影响大小顺序为 a( 物料比) c(温度) d (pH 值) b(时间h) ,即物料比对酶解反应影响最大, 其次是反应温度,最后是pH值和时间,同时得出 a2b2c1d1组合为最佳工艺优选,即在温度为45 条 件下,在pH为3. 0的缓冲溶液中以物料比为6: 1 组成反应底物和酶的混合物、 酶解反应9 h作为最 佳优化条件。根据优化条件进行验证实验,结果在 最佳优化条件下酶解产物得率为54. 24% ,该得率 大于正交实验各实验组的酶解物得率,从而证明了 正交优化的效果。 表2 正交实验结果与分析 Table 2 Design and result of orthogonal test 实验号 No. 物料比 Material: solvent 时间 time(h) 温度 Temperature () pH值 pH value 酶解物得率 Yield (% ) 13: 1645350. 333 23: 19503. 643. 296 33: 112554. 241. 444 46: 16504. 247. 944 56: 1955346. 463 66: 112453. 649. 056 712: 16553. 613. 787 812: 19454. 240. 731 912: 11250336. 009 k145.02537.35546.70744.2692 k2 47.82143.49742.41735.3802 k3 30. 17642. 17033. 89843. 3732 R17. 6456. 14212. 8098. 8892 2. 5 柱层析分离纯化稀有人参皂苷IH901及其纯 度测定 通过硅胶柱柱层析,以氯仿:甲醇= 9: 14: 1 为洗脱剂梯度洗脱,用TLC检测收集组份,减压浓 缩,结晶,获得目的化合物I H901, TLC鉴定图谱(图 4) ,可知经过硅胶柱层析有效去除酶解产物中的杂 质,纯化后TLC检测为单斑点,且纯化物和对照品 I H901的混合物TLC也为单斑点,二者Rf值相同, 可初步判定为二者为同一化合物。1. 2 g粗制酶解 物经硅胶柱柱层析分离获得I H901为0. 4111 g,柱 层析分离纯化得率为34. 26%。 对照品I H901高效液相色谱图见图5A,纯化得 到的I H901进行HPLC分析,得到化合物的单峰图 谱,峰型对称(图5B) ,同时以稀有人参皂苷IH901 对照品为外标,精确吸取对照品I H901溶液和制备 2401天然产物研究与开发 Vol121 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 的目的化合物IH901溶液各10L,注入HPLC仪, 用外标法测定I H901的纯度,测定结果显示所得化 合物的纯度在98%以上。 3 讨论 IH901是二醇型人参皂苷转化而来的非天然人 参皂苷,由于3位和20位糖苷键的特异性,制备只 能通过生物转化方法获得,转化方式通常有酶转化 和微生物转化方法。由于酶转化法具有酶解反应温 和,条件易于控制,操作方便且利于工艺研究开发等 优点,酶法转化成为制备稀有人参皂苷的主要研究 方法。目前据报道所用的酶主要有柚苷酶、 果胶酶、 纤维素酶及乳糖酶工业酶制剂转化二醇型人参皂苷 图5 IH901的薄层层析图 Fig15 TLC of ginsenoside I H901 1.酶解复合物enzyme hydrolysis complex; 2.制备的 IH901 prepared IH901; 3.制备的I H901和对照品 IH901的混合物mixture of prepared IH901 and con2 trol IH901; 4.对照品IH901 control IH901 图6 人参皂苷IH901的高效液相色谱图 Fig16 HPLC of ginsenoside IH901 A.对照品IH901的高效液相色谱图HPLC of control IH901; B.制备的IH901高效液相色谱图HPLC of prepared I H901 混合物来制备I H901 10, 11 ;也有直接从具有转化活 性的菌株中分离专一性更强的转化酶,如从食用微 生物B ifidobacteriumsp. Int57和Bif . sp. SJ32中提取 的粗酶,来转化人参皂苷Rb1, Rb2和Rc制备 I H901 12, 13 ;也有从人肠道菌Fusodobacterium K260 分离纯化的4聚体 2 葡萄糖苷酶,直接转化Rb1生 成I H901 14 。但是 ,上述转化方法普遍存在酶解转 化时间长、 酶解产物转化率不高、 转化酶来源困难、 纯化复杂且难度大等问题,制备方法还无法应用于 工业化生产。 本文通过实验比较,研究了6种酶转化二醇组 人参皂苷的效果,酶对二醇组皂苷转化作用大小依 次为蜗牛酶果胶酶柚皮苷酶纤维素酶 2 葡 聚糖苷酶木聚糖酶。蜗牛酶在24 h内就出现大 量转化产物皂苷IH901,酶解得率为54. 24% ,酶转 化效率最高。蜗牛酶是一种含有多种具有糖苷键水 解能力的复合酶,可能由于不同酶之间相互协同水 解二醇组皂苷上的C20位和C3位糖苷键,从而表现 出该酶解转化的高效率。本研究正交优化结果为物 料比对酶转化作用的影响最大,而姜彬慧等 15 利用 2 葡聚糖苷酶对三七茎叶总皂苷进行转化,结果为 反应时间影响最大,其次是酶的体积分数,表明不同 的酶酶解转化影响因素不同。 本工艺中就稀有人参皂苷IH901的转化制备考 虑了药物来源、 提取方法、 转化方法等三大关键技术 环节,分别体现了低成本,提取简便和高转化效率等 方面,工艺优化结果稳定,方法可行,建立的制备工 艺流程可用于规模化生产,为稀有人参皂苷IH901 的临床应用奠定基础。 参考文献 1 Hasegaua H, Uchiyama M. Antimetastatic efficacy of orally administered ginsenoside Rb1in dependence on intestinal bacterial hydrolyzing potential and significance of treat ment with an active bacterial metabolite.Planta M ed, 1998, 64: 3401 Vol121 童庆宣等:稀有人参皂苷IH901酶法转化与制备研究 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. 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