课件：酶赵玉娥.ppt

第三章（Chapter 3） 酶(Enzyme),酶的应用和研究史,公元前两千多年，我国已有酿酒记载。 1857年，微生物学家Pasteur提出发酵是酵母细胞生命活动的结果。 1878年，Kuhne首次提出Enzyme（酵素、酶）一词。 1897年，Buchner兄弟用不含细胞的酵母提取液，实现了发酵。 1926年，Sumner首次从刀豆中提纯出脲酶结晶，并证明其蛋白质本质。 1982年，Cech首次发现RNA也具有酶的催化活性，提出核酶(ribozyme)的概念。 1995年，Jack W.Szostak研究室首先报道了具有DNA连接酶活性的DNA片段，称为脱氧核酶(deoxyribozyme)。,酶是一类由活细胞所产生的，具有催化活性和高度专一性的特殊蛋白质。它们是生物体系的催化剂。,3.1 概述 3.1.1 酶的概念,3.1.2.1 酶的命名 1.习惯命名法（1961之前） （1）根据作用底物命名； （2）根据酶促反应性质命名； （3）将底物和反应性质结合命名； （4）有的为区别同一类酶还标明酶的来源和性质。,3.1.2 酶的命名和分类,2.系统命名法 按国际系统命名法原则，每个酶都有一个习惯名和一个系统名。系统名应标明酶的所有作用底物和反应性质（底物之一是水时可以略去），不同的底物之间用“:”隔开。若底物有构型要求，也需标出。 草酸氧化酶-草酸：氧氧化酶 乙酰辅酶A水解酶-乙酰辅酶A：水水解酶,3.1.2.2 酶的系统分类法及编号,1. 按照国际系统分类法，每个酶都有一个特定的编号。 2. 分类原则： （1）将所有酶促反应按反应性质分为六大类。分别用1、2、3、4、5、6来编号表示。 （2）根据底物中被作用的基团或键的特点将每一大类分为若干亚类，用1、2、3、4等来编号表示。 （3）根据底物中被作用的基团或键的特点将每亚类又分为若干亚亚类，用1、2、3、4等来编号表示。 （4）亚亚类中酶的顺序号也用阿拉伯数字来表示。 4位编号以“.”隔开，前面冠以”EC”（国际酶学委员会缩写）。,酶的国际系统分类法编号示例,1. 氧化还原酶类,氧化还原酶类催化氧化还原反应。可分为脱氢酶和氧化酶两种。 AH2+B BH2+A 乳酸NAD+ 乳酸脱氢酶 丙酮酸NADH2 黄嘌呤O2+H2O 黄嘌呤氧化酶 尿酸H2O2,黄嘌呤氧化为尿酸,2. 转移酶类,转移酶类催化功能基团的转移反应。使一个底物的基团或原子转移到另一个底物分子上。如转氨酶。 AB+C A+BC 丙氨酸-酮戊二酸 谷丙转氨酶 丙酮酸谷氨酸,3. 水解酶类,水解酶类催化底物分子的加水分解。 AB+HOH AOH+BH 如： 肽+ HOH 肽酶 羧酸胺 磷酸酯+HOH 磷酸酯酶 醇HPO42-,4. 裂合（裂解）酶类,裂合酶类催化底物失去或加上某一部分（即裂解或缩合反应）（很多裂合酶催化底物脱去一部分形成双键或相逆的反应）如醛缩酶、水化酶、脱氨（羧）酶等。 AB A+B 如：柠檬酸+ CoA 柠檬酸合成酶 草酰乙酸乙酰辅酶A 1，6二磷酸果糖 醛缩酶 磷酸二羟丙酮3-磷酸甘油醛,5. 异构酶类,异构酶类催化同分异构体之间的相互转变。使底物分子内部排列改变。如磷酸甘油酸变位酶、6 - 磷酸葡萄糖异构酶等。 A B 如：6 磷酸葡萄糖 6-磷酸葡萄糖异构酶 6-磷酸果糖,6. 合成酶类,催化两种或两种以上化合物合成一种化合物的反应。反应需吸收能量，通常与ATP的分解相偶连。 A+B+ATP AB+ADP+Pi 或 A+B+ATP AB+AMP+PPi 如： CH3COCoA+CO2+ATP 乙酰辅酶A羧化酶 HOOCCH2COCoA+AMP+PPi,3.12.3 根据酶蛋白分子特点 和分子大小分类,单体酶：仅由一条肽链构成的酶。单体酶种类很少，一般多是催化水解反应的酶，如溶菌酶、羧肽酶等。相对分子质量在35，000以下。一般由一条多肽链组成。（有的单体酶是由多条多肽链组成，如胰凝乳蛋白酶，由三条肽链组成，链间由二硫键相连构成一个共价整体。这类含几条肽链的单体酶往往是由一条前体肽链经活化断裂生成的。） 寡聚酶：由几条或几十条多肽链构成，但亚基之间无共价连接，容易分开。相对分子质量在35，000到几百万之间。如三磷酸甘油醛脱氢酶。 多酶复合体：由几种酶嵌合形成的复合体。有利于一系列反应的连续进行。相对分子质量在几百万以上。如脂肪酸合成酶复合体。,3.2 酶的化学本质,酶是蛋白质的证明： （1）已经提纯的结晶酶被证明都是蛋白质。 （2）酶是两性电解质。 （3）酶蛋白具有一级结构、空间结构，也有简单蛋白质和结合蛋白质两类。许多酶的氨基酸排列顺序已经被测定。 （4）酶具有胶体性质的一系列特征。 （5）酶受蛋白水解酶作用丧失活性。 （6）引起蛋白质变性的化学和物理因素也能使酶丧失活性。,3.2.2 酶的组成,据酶分子组成分类,单纯蛋白质酶类,结合蛋白质酶类,酶蛋白质,辅助因子,小分子有机物 金属离子,全酶(holoenzyme)酶蛋白+辅酶（辅助因子） 酶促反应的专一性及高效率取决于酶蛋白部分，而辅助因子决定酶促反应的性质。,辅酶,主要可溶性维生素和相应辅酶,维生素 辅酶 功能 1. B1(硫胺素) TPP -酮酸氧化脱羧 2. B2(核黄素 ) FMN、FAD 氢载体 3. PP 尼克酸（酰胺） NAD+、NADP+ 氢载体 4. 泛酸（遍多酸） CoASH 酰基载体 5. B6 吡哆醇（醛、酸） 磷酸吡哆醇（醛） 转氨、脱羧、消旋 6. 叶酸 FH4(THFA) 一碳基团载体 7. 生物素 羧化辅酶 8. C（抗坏血酸） 氧化还原作用 9. 硫辛酸 酰基载体、氢载体 10. B12（氰钴氨素） 甲基钴氨素 变位酶辅酶 脱氧腺苷钴氨素 一碳基团载体,3.3 酶的特性,3.3.1 酶作为生物催化剂的特性 高效性 不改变反应平衡点 降低反应活化能,活化能与酶催化的中间产物理论,酶（E）与底物（S）结合生成不稳定的中间物（ES），再分解成产物（P）并释放出酶，使反应沿一个低活化能的途径进行，降低反应所需活化能，所以能加快反应速度。,3.3.2 酶的作用有高度专一性,一种酶只能对一定的底物发生催化作用。 1. 绝对专一性 有的酶对底物的化学结构要求非常严格，只作用于一种底物，发生专一性反应，生成产物。,如： 脲酶 NH2CONH2+H2O 2NH3+CO2,2. 相对专一性 有的酶对底物的化学结构要求比绝对专一性略低，它们能作用于一类化合物或一种化学键。 1） 键专一性 有的酶只作用于一定的键，而对键两端的基团并无严格要求。 如：脂肪酶 2）基团专一性 一些酶，除要求作用于一定的键以外，对键两端的一个基团要求严格，对另一个基团则要求不严格。 如：胰蛋白酶,3、立体异构专一性,只对一定构型的化合物起作用，对其对映体无作用。 如 L-精氨酸酶,消化道内几种蛋白酶的专一性,（芳香）,（硷性）,（丙）,胰凝乳蛋白酶,胃蛋白酶,弹性蛋白酶,羧肽酶,胰蛋白酶,氨肽酶,羧肽酶,3.3.3 酶活性在体内的可调控性 酶量的调控：改变酶的合成和降解速度； 酶活性的调控：酶原激活、反馈调节、抑制剂调节、共价修饰调节、反馈调节、激素调节等。,3.3.4 酶的不稳定性 一切使蛋白质变性的理化因素都可以导致酶失去活性。,3.4 酶的结构和功能,3.4.1 酶的活性部位,结构是功能的物质基础,必需基团,活性中心外必需基团 ：酶构象必需基团,活性中心,结合基团,辅助因子活性基团（结合酶所需）,催化基团,活性中心：酶分子中直接和底物结合并和酶催化作用直接相关的部位。包括结合部位与催化部位。,必需基团：与酶的催化活性密切相关的化学基团。,1. 酶作用的专一性主要取决于酶活性中心的结构特异性（即酶蛋白部分） 2. 保持活性中心的空间结构是维持酶活性所必需的,3.4.2 酶的别构（变位）部位,别构部位（别构中心、调节位点）： 有些酶分子表面除活性中心外，还有被称为别构剂或效应物的化合物的特异结合位点，这些调节剂结合以后引起酶的构象改变，从而对酶促反应的速度有调节作用，酶分子上的这种部位称为别构部位或调节部位。（别构剂通常为小分子代谢物或辅因子。） 别构酶在别构部位结合调节物后构象改变、活性增强或减弱的现象称为别构效应。能使酶的催化活性增强的别构剂称为别构激活剂（正效应物），反之则为别构抑制剂（负效应物）。 具有别构部位，与别构剂结合后构象和活性改变的酶称为别构酶。,别构酶活性结构,活性中心：催化作用,别构中心：调节酶促反应速度,若底物作为调节剂，一般变构酶分子上有二个以上的底物结合位点。（同促作用、异促作用） 别构酶一般是寡聚酶。催化部位和调节部位可在同一亚基上，也可在不同亚基上。 正协同效应(别构酶的一个亚基与底物或调节物结合后，分子构象产生有利于后续底物或调节物结合的变化). 负协同效应（negtive cooperative effect）,反应过程中间代谢物易作为别构剂作用,3.4.3 酶原的激活,有些蛋白质在细胞内初合成时没有生物活性，需经蛋白水解酶或其他离子的专一水解后，使分子构象发生改变后才具有活性。这种蛋白质称为前体蛋白质。如其活性形式是酶，则这种前体称为酶原。通过水解使酶原变为有活性的酶的过程称为酶原激活。 酶原只有在特定的部位和条件下才能被激活，这具有重要的生理意义-自身保护及应激反应。 酶原激活机理：酶原分子内肽键的一处或多处断裂，使分子构象发生一定程度的改变，从而形成或暴露酶的活性中心。 有些酶对其自身的酶原有激活作用，这种现象称为自身催化。,例：胰蛋白酶酶原的激活,3.4.4 同工酶,概念：具有不同分子结构但却能催化同一种化学反应的一组酶。往往存在于同一种属或同一个体的不同组织或同一细胞的不同亚细胞结构中，由不同的基因或等位基因编码合成。 意义： 生物学意义：使不同的组织与细胞具有不同的代谢特点。 研究意义：作为遗传的标志可用于分子遗传学研究（同工酶是基因分化的产物）；可用于蛋白质结构和功能研究； 医学价值：可作为临床诊断指标。,乳酸脱氢酶同工酶形成示意图,多肽,亚基,mRNA,四聚体,结构基因,a b,不同组织中LDH同工酶的电泳图谱,另外：肌酸激酶CK2、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶,3.4.5共价调节酶,酶的共价调节：在其他酶的作用下，调节剂与酶分子上的某些基团进行可逆的共价修饰，从而使酶在活性与非活性状态间互变。对酶活性的这种调节作用称为酶的共价调节。活性可被共价调节的酶称为共价调节酶。,# 酶的共价修饰形式：磷酸化与脱磷酸化(最常见) 乙酰化与脱乙酰化 甲基化与脱甲基化 腺苷化与脱腺苷化,例：糖原磷酸化酶的共价调节,糖原磷酸化酶a的4条肽链上都有一个丝氨酸残基，它们的 OH都连上了一个磷酸基。这些磷酸基被水解掉后成为活性丧失的磷酸化酶b，且形成二聚体形式。 蛋白激酶催化ATP或CTP位上的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上。蛋白磷酸酶催化逆过程。,磷酸化酶激酶的共价磷酸化调节,酶含量的调节,（一）酶蛋白合成的诱导和阻遏； （二）酶降解的调控,3.4.6 诱导酶,诱导酶(induced enzyme)是在环境中有诱导物（通常是酶的底物）存在的情况下，由诱导物诱导而生成的酶。 例：大肠杆菌分解乳糖的半乳糖苷酶、催化淀粉分解为糊精、麦芽糖等的-淀粉酶（多种微生物都能产生这种酶）。 诱导酶的合成除取决于细胞内所含的基因以外，还取决于诱导物。因此，诱导酶的合成是内因+外因作用的结果。 意义：诱导酶在微生物需要时合成，不需要时就停止合成。这样，既保证了代谢的需要，又避免了不必要的浪费，增强了微生物对环境的适应能力。,3.4.7 核糖酶,核糖酶：具有催化活性的RNA分子（核糖核酸），又称为核酶。（L19RNA、26SrRNA、RNaseP） 脱氧核糖酶：具有催化活性的DNA分子（脱氧核糖核酸），又称为脱氧核酶。,3.4.8 抗体酶,抗体酶：具有催化功能的抗体分子。,抗体：机体在抗原物质刺激下产生的一种能与抗原分子特异性结合的球蛋白。,抗体酶意义： 催化天然酶不可催化的反应 治疗用途。,抗原.抗体结合与酶.底物结合,抗原抗体特异性结合 酶.底物特异性结合,酶的催化遵从一般催化剂的催化规律： （1）加速反应速率，反应前后质和量无变化； （2）加速热力学化学反应，不触发热力学上不可能进行的化学反应； （3）缩短反应达到平衡的时间，不改变平衡点； （4）对正负反应都有催化作用。,3.5 酶的催化机制,3.5.1 酶的催化作用、过渡态、分子活化能,化学反应体系中反应能否进行及速度的快慢与活化分子（含能达到或超过某一限度的分子）的多少直接相关。 酶（E）帮助（S） 形成并稳定过渡态，使反应沿一个低活化能的途径进行，所以能加快反应速度。,酶活性的热力学表现？：帮助底物形成过渡态，降低活化能,3.5.2 中间产物学说,酶（以活性部位）（E）与底物（S）结合生成不稳定的中间物（ES），结合导致底物分子内某些化学键的极化，呈不稳定状态（过渡态），比较容易再分解成产物（P）并释放出酶，使反应沿一个低活化能的途径进行，降低反应所需活化能，所以能加快反应速度。（单分子反应、双分子反应）。,酶发挥作用的途径：酶是怎样降低活化能的（？）如何同底物结合（？）然后加速反应的（？）。,诱导契合学说,当酶分子与底物分子接近时，酶分子受底物分子的诱导，构象发生变化（酶活性中心的某些氨基酸残基或基团在底物诱导下获得合适的空间定位），以适合于底物的契合，进而结合成复合物。反应物生成脱离后，酶分子复原。,酶与底物结合的机制：1,底物构象改变学说,当酶分子与底物分子接近时，底物分子受酶分子的影响，构象也发生变化。即酶对底物分子产生的引力、张力等作用使底物扭曲，使ES进入过渡状态，底物中的敏感键变形为更易反应的状态。产物生成脱离后，酶分子复原。,酶与底物结合的机制：2,3.5.4 使酶具有高催化效率的因素,3.5.4.1 近效应与定向排列（诱导契合、底物形变）,高效催化机制：1,酶将底物分子按特定顺序和空间方位定向结合到酶的活性中心，使它们互相接近（近效应），并获得有利于反应进行的正确定向（定向排列）；底物和酶蛋白结合时，酶分子发生构象变化，使反应中所需要的酶中的催化基团与结合基团正确地排列并定位，以便能与底物契合（定向排列，诱导契合学说） ；底物分子也发生构象变化，敏感基团获得有利于反应的正确排列与定向（定向排列，底物形变学说）。这样就使得分子间反应犹如分子内反应，形成过渡态时所需活化能明显低于分子间反应，加速反应速度。,3.5.4.2 共价催化：亲核催化与亲电催化,有些酶和底物以共价键形成一个反应活性很高的不稳定的共价中间产物，以较大的概率转变为过渡状态，降低反应活化能。 亲核催化：指酶活性中心的亲核基团提供一对电子与底物分子中缺少电子具有部分正电荷的C原子形成共价键，从而产生不稳定的共价中间物。 亲电催化：指酶活性中心上的亲电子催化基团从底物分子的亲核原子上夺取一对电子，形成共价键，从而产生不稳定的共价中间物。,亲核基团：化合物中能提供电子对的基团或原子。His 的咪唑基，Cys 的硫基，Ser 的羟基。 亲电子基团：能接受电子对的基团或原子，是电子对的受体。-NH3+，H+、Fe 2+、Cu 2+、Zn 2+等。,高效催化机制：2,3.5.4.3 底物构象改变学说,当酶分子与底物分子接近时，底物分子受酶分子的影响，构象也发生变化。即酶对底物分子产生的引力、张力等作用使底物扭曲，使ES进入过渡状态，底物中的敏感键变形为更易反应的状态。产物生成脱离后，酶分子复原。,高效催化的机制：3,3.5.4.4 酸碱催化,酶的酸碱催化是广义的酸碱催化，指酶分子上的酸性或碱性基团，如氨基、羧基、巯基、酚羟基及咪唑基等作为质子供体或质子受体对底物进行催化。（酯类水解、双键的加水脱水等）； 酸碱催化的影响因素：功能基的解离程度和供、受质子的速度； 咪唑基是是最活泼的功能基：（1）pI为6，生理pH下可作为质子供体、受体；（2）供出和接受质子的速度都很快； 酶分子中存在多种酸碱基团，因此酸碱催化效率比一般酸碱催化剂高得多。,高效催化的机制：4,3.6 酶促反应动力学,酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响反应的各种因素的科学。 影响酶促反应的因素：温度、酶浓度、底物浓度、pH值、激活剂和抑制剂等。 研究酶促动力学的前提条件： （1）反应速度测量的都是初速度； （2）研究某一因素的影响时，其他因素都恒定处于最佳状态。,酶促反应速度的测定,反应速度一般用单位时间内底物或产物量的变化来表示。 一个反应体系的反应速度在开始的极短时间内，能反应该反应体系各因素的影响，而反应一段时间之后，由于各种因素的变化，反应的速度就会受到影响。因此考查各因素对反应速度的影响时都应测初速度。 另外，在研究某一种因素的影响时，其他因素应该都处于最佳状态。,3.6.1 酶浓度的影响,研究条件：底物浓度足够大；无酶抑制剂存在；其他条件最适。 结果：酶促反应速度和酶浓度成正比（以反应速度对酶浓度做图，得一过原点直线）。 V=KE 原因：所有酶分子都被饱和，酶的催化潜力得以完全发挥，这种情况下反应速度只与酶浓度有关。,3.6.2 底物浓度的影响,单底物、单产物反应； 酶浓度、pH值、温度等反应条件都处于最适状态； 反应速度取初速度，即底物的消耗量很小（一般在5以内）时的反应速度。,研究前提,3.6.2.1 矩形双曲线,酶浓度和其他条件不变时，底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线,3.6.2.2 单分子酶促反应的米氏方程及Km,米氏方程:,米氏常数:,米氏常数的意义（1）,（1）物理意义与概念：（由上式可得）Km值等于酶反应速度为最大速度一半时的底物浓度。单位为mol/l。,（2）根据米氏方程，Km值愈小，达到最大反应速度需要的底物浓度越小，表示酶与底物亲和力愈大。1 /Km可近似地表示酶与底物的亲和力。,（3）Km 是酶的特征性常数，只与酶的性质，酶所催化的底物和反应条件(温度、pH、有无抑制剂等)有关，与酶的浓度无关。 各种酶的 Km 值大致在 10-110-6 M 之间。,（4） Vmax和米氏常数的测定,基本原则： 将米氏方程变化成直线方程，再作图求出Km。 例：双倒数作图法（Lineweaver-Burk法） 米氏方程的双倒数形式：,1 Km 1 1 = . + v Vmax S Vmax,双倒数作图法,练习：已知某酶的Km值为0.05mol.L-1，要使此酶所催化的反应速度达到最大反应速度的80时底物的浓度应为多少？,Km在实际应用中的重要意义,（1）鉴定酶：可以鉴别不同来源或相同来源但在不同发育阶段、不同生理状态下催化相同反应的酶是否为同一种酶。,（2）判断酶的最佳底物：如果一种酶可作用于多个底物,就有几个Km值，其中Km最小对应的底物就是酶的天然底物。如蔗糖酶既可催化蔗糖水解(Km=28mmol/L),也可催化棉子糖水解(Km=350mmol/L),蔗糖为天然底物。,（3）计算一定速度下的底物浓度：如某一反应要求的反应速度达到最大反应速度的99%，则S=99Km,3.6.3pH对酶反应速度的影响,过酸过碱导致酶蛋白变性 影响底物分子解离状态 影响酶分子解离状态 影响辅助因子的解离,pH,最适 pH,v,最适pH：酶促反应速度最快时的环境pH。,3.6.4温度与酶反应速度的关系, 在达到最适温度以前，反应速度随温度升高而加快 酶是蛋白质，其变性速度亦随温度上升而加快 酶的最适温度不是一个固定不变的常数.反应时间越长，最适温度越低。,v,最适温度：酶促反应速度最快时的环境温度。,3.6.5激活剂对酶作用的影响,类别 金属离子：K+、Na+、 Mg2+、Cu2+、Mn2+ 、 Co2+、Fe2+ 阴离子： Cl-、Br- 有机分子 还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽 金属螯合剂：EDTA,凡是能提高酶活性的物质，称为酶的激活剂（activator）。,3.6.6抑制剂对酶作用的影响,凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质统称为酶的抑制剂（inhibitor） 。 类型：不可逆抑制剂 可逆抑制剂 应用：研制杀虫剂、药物 研究酶的作用机理，确定代谢途径,抑制剂类型和特点,竞争性抑制剂 可逆抑制剂 非竞争性抑制剂 反竞争性抑制剂,非专一性不可逆抑制剂 不可逆抑制剂 专一性不可逆抑制剂,1.非专一性不可逆抑制剂,抑制剂作用于酶分子中的一类或几类基团，这些基团中包含了必需基团，因而引起酶失活。 如：重金属对疏基酶的抑制,2.专一性不可逆抑制剂,这类抑制剂选择性强，只能专一性地与酶活性中心的某些基团不可逆结合，引起酶的活性丧失。 实例：有机磷杀虫剂,-Ser-OH,抑制剂与酶以非共价键结合，两者结合疏松，用透析等物理方法除去抑制剂后，酶的活性恢复。,3.6.6.2可逆抑制作用,反应模式,定义 抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。这种抑制作用称为竞争性抑制作用。,1、竞争性抑制作用,特点： Km增大，Vm不变；抑制作用的强弱取决于底物与抑制剂浓度的相对比例；底物浓度增加到足够大，抑制作用可解除。,实例1：丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用,实例2：磺胺药物的药用机理,非竞争性抑制作用 I与酶活性部位以外的部位可逆结合，不影响S与E的结合，也不影响ES与I的结合，但结合了I的酶无活性，等于减少活性酶分子。,+ I,EI+S,ESI,ES,P+ E,E+S,+ I,特点：Km不变，Vmax变小。 实例：重金属离子（Cu2+、Hg2+、Ag+、Pb2+）,反竞争性抑制作用,ESI,ES,P+ E,E+S,+ I,特点：Km变小，Vmax变小。,抑制剂不直接与酶结合，而是与ES结合形成ESI， 使酶失去催化活性， ESI不能分解成产物（ES的 实际有效生成量减少），又不能重新分解游离出底物。,3.7 酶的分离提纯及活力测定 3.7.1 分离提纯,胞内酶分离提纯步骤： 选材：材料预处理。暂时不用需低温或制成丙酮干制剂保存。 破碎cell：（1）物理法 - 超声、机械（手工研磨、搅拌器、匀浆器、高速组织捣碎器、细菌磨、球磨机）、高压、爆破性减压、快速冻融、专用波振荡等；（2）酶法（溶菌酶等）；（3）化学法（渗透作用、菌体溶解剂等）。 抽提：把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液-低温下用水、低盐缓冲液或稀酸、稀碱液抽提。抽提液的具体组成和抽提条件的选择，取决于酶的溶解性、稳定性，还要有利于切断酶与其他物质的连结。 分离或提纯：把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来。,据酶存在及作 用部位分类,胞内酶：合成后在细胞内起作用的酶。游离（溶酶）或与细胞器结合（结酶）。,胞外酶：合成后分泌到细胞外起作用的酶。消化相关的酶多是胞外酶。（直接用盐析、单宁沉淀、有机溶剂沉淀等方法）,物理破碎法 (1)研磨 手磨法是实验室内常用的方法。用石英砂或氧化铝作助磨剂来制备无细胞抽提液。此法简单但效率低，制备量少。球磨法，将干菌体放人球磨机，经数小时研磨，用水或缓冲液抽提。石磨法是选择坚硬的石磨，装上动力研磨。细菌磨也是实验室中较好的选择。 (2)机械捣碎 匀浆器和高速组织捣碎器等对细胞作机械破碎. (3)高压法 在结实的圆柱体容器内装上菌体与助磨剂，在215下，于活塞上加压冲击，以破碎细胞。 (4)爆破性减压法 将菌体悬浮在N2C02高压下平衡，37振荡数分钟，然后突然减压，使细胞壁、膜破碎. (5)专用波振荡 专用波振动通过在液体中形成局部减压（空化作用），生成旋涡，漩涡生成与消失时，产生很大压力，从而使细胞破碎。 (6 )快速冰冻融化法 由于突然冰冻，使胞内水形成结晶及胞内外浓度突然改变，可使某些细胞破碎。,化学破碎法 (1)有机溶剂溶解法：向菌体中加醋酸乙酯、甲苯、乙醚及氯仿，使细胞渗透性改变，保温一定时间后，可以使菌体自溶。 ( 2)渗透作用：将指数生长期的菌体用缓冲液洗净并悬于含蔗糖、EDTA的稀Tris缓冲液中，待平衡后，离心，加MgC12剧烈搅拌，可使某些水解酶从细胞内释放出来。 (3)表面活性剂法：膜结合酶在细胞破碎后很难溶解下来，常借助表面活性剂来解决。在适当PH及离子强度的条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解. (4)其他：如噬菌体法-当细菌感染噬菌体后，噬菌体附着于菌体细胞壁，导致菌体自溶等. (5)干燥处理：用空气干燥、真空干燥、冷冻以及脱水干燥法干燥、悬浮、抽提。如空气干燥，一般在2530 或高到3540的气流中吹干，然后将干菌体悬浮于35倍的水中或缓冲液中，室温搅拌23h抽提。,酶破碎法,酶处理：作用于细胞壁的酶有白细胞酶、溶菌酶等，用以处理细胞，使酶释放出来。溶菌酶专一性地分解菌体细胞壁上多糖分子的1，4糖苷键，从而破坏细胞壁.,抽提,抽提溶剂：稀盐、稀酸或稀碱的水溶液（大多数酶蛋白属于球蛋白）。抽提液的具体组成和抽提条件的选择，取决于酶的溶解性、稳定性，还要有利于切断酶与其他物质的连结。 抽提液pH：首先，选用pH不应超过酶的PH稳定范围；其次，应远离待抽提酶的等电点（酸性蛋白宜用碱性溶液抽提；碱性蛋白宜用酸性溶液抽提。在某些情况下，抽提还兼有切断酶与细胞内其它成分间联结的作用，在不影响酶活性的前提下，可考虑酸碱性强一些，如在pH4-6时抽提碱性蛋白效果很好。 抽提液盐浓度：抽提液一般采用等渗溶液。最普通的为0.0200.050mol/L的磷酸缓冲液, 0.15mol/L NaCl等。焦磷酸钠和柠檬酸钠的缓冲液有助于切断酶和其他物质的联系,也常用。（有时用水抽提亦佳, 低渗还可破坏细胞结构。） 抽提温度：温度通常控制在0-4左右.如果酶比较稳定时，可以例外。如胃蛋白酶可在37保温抽提。 抽提液用量：常采用原料量的15倍。有时为提高抽提效果可反复抽提或加大抽提液用量。 其他：如加入蛋白酶抑制剂,以防止蛋白酶（亚细胞结构破坏溶出）破坏目的酶；为防止氧化，加入Cys或维生素C、惰性蛋白及底物等。,结合酶抽提,（1）和颗粒结合不太紧的结和酶，在颗粒结构受损伤时，抽提也不难。例如：酮戊二酸脱氢酶、延胡索酸酶，可用缓冲液抽提出来；CytC可用0145mol/L的三氯乙酸溶液抽提出来。 （2）和颗粒结合紧密的酶，常以脂蛋白络合物形式存在，有的做成丙酮粉以后，就可以抽提出；有的要使用正丁醇等强烈手段处理（正丁醇兼有高度的亲脂性和亲水性，能破坏蛋白间的结合使酶进入溶液，如琥珀酸脱氢酶）；近年来，广泛采用表面活性剂，如胆脂酸盐、 Triton、Tween、Teepol、十二 烷基磺酸钠等，抽提呼吸链酶系（如链霉菌葡萄糖异构酶的抽提，向菌体悬浮液中加入01十二烷基吡啶氯化铵酶的抽出率提高到8倍；有时使用促溶剂如高氯酸；有时还用酶处理，如脂肪酶、核酸酶、蛋白酶等。,表面活性剂对葡萄糖异构酶抽提效果的影晌,浓缩 提取液或发酵液的酶蛋白浓度一般很低，如发酵液中酶蛋白浓度一般为0.1一1。因此，在分离纯化过程中，酶溶液往往需要浓缩。浓缩的方法很多，如：盐析或溶剂沉淀法、超过滤法、离子交换树脂法等。这些方法既是浓缩的方法，又是分离纯化的手段再如真空浓缩、冷冻浓缩法、蒸发法、凝胶吸水法、聚乙二醇吸水法等。 冷冻干燥法 将酶溶液冻成固体后抽真空，使水分子直接从表面升华，最后酶呈干粉状。采用这种方法能使多种酶活性长期保存。但操作需注意几个问题：首先被冻的最好是酶的水溶液。如果混有有机溶剂，会降低水的冰点，在干燥时样品融化而起泡导致酶变性，同时，会使真空泵失效。其次，如果混有磷酸盐，在冷冻干燥时会引起pH的变化，例如：PH 7的磷酸盐在冷冻时由于磷酸二氢钠会结晶析出，在溶液完全冷冻以前，pH便变成3.5左右。因此，在冷冻前，需将酶溶液脱盐。,依据溶液相对纯水熔点升高，冰点下降原理，对少量样品，一是将溶液冻成冰，然后缓慢溶解，这样冰块(不含酶)就浮于表面，酶溶解并集中于下层溶液(约为原体积的1/4)；二是让酶溶液慢慢冻结后移去水结成的冰。这种方法也会发生离于强度和pH的变化。 蒸发法 通常采用的减压蒸发法和实验室常用的超蒸发法，都因效率低、费时等在工业上很少应用。目前，工业上应用较多的是薄膜蒸发法。薄膜蒸发法，即将待浓缩的酶溶液在高度真空下转变成极薄的液膜，液膜通过加热而急速汽化，经旋风汽液分离器，将蒸汽分离、冷凝而达到浓缩目的。薄膜蒸发器有：升膜式、降膜式、刮膜式、离心式等多种。根据物料不同而加以选择。,超过滤 超过滤是在加压的条件下，将酶溶液通过一层只允许小分子物质选择透过微孔半透膜而酶等大分子物质被截留，从而达到浓缩的目的。如果采用不同孔径的膜，同时又具有分级分离的作用。这种方法具有下列优点：不需加热，更适用于热敏物浓缩；无相变化、设备简单、操作方便；能在广泛的pH条件下