课件：血型交叉配血.ppt

,血型与交叉配血,主要内容：,红细胞血型概述 抗体检查和鉴定 交叉配血方法 日常工作中问题对策,血型的发现,1900年，奥地利科学家兰德斯坦纳,红细胞,血清,凝集,不凝集,遇到,红细胞抗原,血型系统（Blood group systems）29 245 血型集合（ Blood group collections）6 12 血型系列（series）： 低频率系列（700 series，low-incidence antigens) 33 高频率系列 (901 serise,high-incidence antigens) 12,Rh血型系统,Du比正常D阳性细胞抗原弱，但一旦输给Rh阴性的受血者后，自然有免疫产生抗D的可能。同时Du型人者接受Rh阳性的细胞后，也有可能产生抗D抗体。 作为供血者，Du型归类为Rh阳性， 作为受血者Du型归类为Rh阴性者。,红细胞抗体(1),预期抗体：若已知红细胞ABO血型，按 Landsteiners法则可预知的ABO血型 抗体，即抗-A和抗-B。 预期抗体也叫做规则抗体 意外抗体：抗-A或抗-B以外的抗体。在ABO亚型 中，变异的抗-A1或某种抗-B等抗体， 也称为意外抗体。 意外抗体过去也叫做不规则抗体,红细胞抗体(2),天然抗体：没有可察觉的抗原刺激，而机体对抗原免疫应答的产物。天然抗体多为IgM抗体，能与含有相应抗原的红细胞结合，在盐水介质中出现肉眼可见的凝集反应，所以也叫盐水抗体。IgM抗体的最适反应温度为0-25。 免疫抗体：抗原刺激机体而产生的。免疫抗体多为IgG抗体，在盐水介质中只能致敏含有相应抗原的红细胞，但不产生凝集，需要采用抗球蛋白搭桥、酶处理细胞或聚凝胺介导等方法，才能产生凝集反应。IgG抗体的最适反应温度为37。,免疫血液学的传统方法,凝集实验和溶血实验 玻片法/试管法/微孔板法 抗人球实验,在抗原抗体反应中的去离子和低离子,盐水凝集法： 例如，ABO血型鉴定试验 包括玻片法、试管 法和微孔法 但灵敏度相对较低，只在 一些基层医院血库使用 低离子强度盐水法： 通过降低介质溶液离子强度，减少红细胞膜外围的离子云，促进红细胞凝集，因而其灵敏度有所提高。,聚凝胺试验,原理：聚凝胺是一种高价阳离子季胺盐多聚物，溶解后能产生很多正电荷，可以中和红细胞表面的负电荷，使红细胞之间距离减小，能引起正常红细胞可逆性的非特异性凝聚。如果是抗体致敏的红细胞，加入中和液后，凝集不可逆；无抗体致敏的红细胞，加入中和液后，凝集解散。 程序：按试剂盒说明书操作。,聚凝胺凝集法： 通过多聚季氨盐溶液提供大量正电荷来中和红细胞表面负电荷，减少红细胞间的排斥，促进红细胞凝集，其灵敏度有较大提高。此方 法目前在国内使用较多。（Rh,Duffy）,抗人球试验 - 检测 IgG,抗人球试验： 在盐水凝集法或低离子强度盐水法的基础上，加入抗人球蛋白抗体，通过抗人球蛋白抗体的特异性桥连作用，促进红细胞的凝集。可分为直接和间接抗人球试验。 K, k, Fya, Fyb, JKa, JKb, Kpa, Kpb, S, s, Lua, Lub,间接抗人球蛋白试验(IAT),经典IAT LISS-IAT:试管法 卡 PEG-IAT 酶IAT 聚凝胺IAT,经典IAT,程序：2滴血清、1滴2-5%的红细胞，37孵育45-60分钟，生理盐水洗涤3遍后倾倒上清液，控干，加2滴抗人球蛋白试剂，离心后判读结果。用抗体致敏的红细胞检测试验结果的正确性。,LISS-IAT,原理：通过降低红细胞周围的离子氛，使抗体易于接近抗原，促进抗体在更短的时间内致敏红细胞，再使用抗人球蛋白试剂，使被致敏的红细胞产生凝集 程序：2滴血清、1滴2-5%的红细胞，加2-4滴LISS液后混匀，37孵育15分钟，离心观察细胞的凝集情况，用生理盐水洗涤3遍后倾倒上清液，控干，加2滴抗人球蛋白试剂，离心后判读结果。,PEG-IAT,原理：PEG（聚乙二醇）是一种水溶性的中性多聚体，当含有抗原与相应抗体的溶液中加入PEG时，由于空间排斥效应作用，使溶液中的抗体饱和度提高，加速溶液中的抗原-抗体复合物的形成。 程序：2滴血清、1滴2-5%的红细胞，加4滴PEG溶液后混匀，37孵育15分钟，生理盐水洗涤3遍后倾倒上清液，控干，加2滴抗人球蛋白试剂，离心后判读结果。,微柱凝胶技术(卡),原理：微管内有凝胶颗粒和试剂。凝胶颗粒具有分子筛作用，离心后，不凝集的红细胞通过全程进入微管底部，而凝集的红细胞则悬浮停留在颗粒中。 程序：按厂家说明操作,反应原理 微柱凝胶免疫反应的本质是红细胞凝集试验，也可称之微柱凝胶血凝 试验（Microcolumn Gel Heamagglutination Assay，MGHA）在微柱凝胶 管中，红细胞和相应抗体结合后，形成红细胞凝集团块。在一定离心力下， 该凝集团块位于胶表面或胶中；而红细胞未和相应抗体结合，仍为分散的 红细胞，在同样的离心力下，红细胞沉降到微柱管尖底部。,4+ 红细胞复合物（凝集）位于凝胶表面 3+ 大部分红细胞复合物位于凝胶表面，少部分位于凝胶中部 2+ 大部分红细胞复合物位于凝胶中部，少部分位于凝胶中上部 1+ 红细胞复合物位于凝胶中下部 与同一卡中阴性管结果对照，如与阴性结果有差别，即为 红细胞完全沉积在凝胶管尖底部 完全溶血 凝胶和液体无凝集或未凝集的红细胞，液体出现透明清澈红色 不完全溶血 残留红细胞在胶表面、胶中或胶底部，液体出现透明清澈红色 混合凝集 红细胞复合物位于凝胶表面和凝胶底部,反应强度,现象及说明, 完全 不完全 混合凝集,抗人球蛋白试验(Coombs试验),直接抗人球蛋白试验(DAT) 检测红细胞是否在体内被抗体或补体致敏,用于检测自身免疫溶血性贫血、药物引起的溶血、新生儿溶血病、溶血性输血反应 间接抗人球蛋白试验(IAT) 在体外抗体致敏红细胞,用于抗体筛选和鉴定、交叉配血、血型鉴定,酶试验,原理：蛋白水解酶可将红细胞表面的多肽链打断，使多肽链带负电荷的唾液酸也一起离开红细胞表面，减少了红细胞之间的排斥力，缩短了红细胞之间的距离，容易产生凝集反应 程序：2滴血清、1滴2-5%红细胞，加入2滴酶，37孵育15分钟，离心看结果。 注：酶会破坏一些抗原结构，如M、N、Fya、Fyb 等,影响输血效果的免疫血清学问题,速发型输血后溶血反应 血管内溶血 主要原因: ABO血型不和 迟发型输血后溶血反应 血管外溶血 主要原因: 针对红细胞抗原的同种抗体 血型抗原的同种免疫 红细胞抗原免疫强弱依次为Rh（DE C c e ）、 Kell、Duffy、Kidd,传统方法的局限性,不利于标准化管理 重复性较差 要求操作者的经验丰富 难以实现自动化操作,凝胶凝集试验,凝胶凝集试验 - 原理 (1),通过离心使红细胞被挤过装有过滤介质的小柱 凝集的红细胞被阻挡在小柱中过滤介质的顶部或中央， 而未凝集的红细胞则到达小柱的底部 血型或AHG试剂被加入到过滤介质 由于红细胞和血清成分以不同的速度通过小柱（重力加速度不同），从而消除了血清中未结合的球蛋白中和AHG的可能性，因而，在抗人球试验中，不用清洗红细胞,凝胶凝集试验,凝胶抗人球试验,新技术卡式检测法： 1986年法国Dr.Yves Lappierre发明了用于分离凝集红细胞的凝胶卡式检测法。经过不断改进和临床的大量应用，目前在发达国家已作为临床常规的红细胞血型血清学检测新技术。 1994年凝胶卡式检测法用于临床常规的红细胞血型血清学检测，已得到美国FDA权威机构的认证。,凝胶酶试验,酶法： 利用木瓜酶或菠萝酶来破坏红细胞表面的唾液酸， 使细胞膜表面失去电荷，减少红细胞间的排斥；同时暴 露某些隐蔽抗原，增强凝集反应。主要用于一些不完全 抗体的检测。,凝胶凝集试验 - 原理(2),标准化的孵育时间 标准化的离心时间 标准化的判读 - 消除主观因素对弱反应结果的判读 结果稳定保存,凝胶试验应用于血型血清学,血型实验室中的一次革命 在全世界许多发达国家已被公认为是常规免疫血液学实验的“金标准”。,1990年，卡式检测法的发明人Dr. Yves Lapierre等用低离子强度盐水法（试管法）、聚凝胺试验（试管法）和卡式检测法（凝胶）研究了400例已知抗体的样本。血清与细胞的比例是按照试管法标准配置。结果为： 卡式检测法检出359例（检出率为90%） 低离子强度盐水法检出243例（检出率为61%） 聚凝胺试验检出301例（检出率为75%）,凝胶试验应用于血型血清学,2019/8/21,33,可编辑,结果判断模式,凝胶试验应用于血型血清学,临床输血技术规范,明确规定部分病人应做“抗体筛选”检测，第四章第17条：“凡遇以下情况必须按全国临床检验操作规程有关规定做抗体筛选试验：1、交叉配血不合的； 2、对有输血史、妊娠史或短期内需接受多次输血者。,为什么要开展输血前的“抗体筛选”检查,1、目前已知红细胞有26个抗原系统（确认21个，如ABO、Rh、MN、LW、MNS、JK等），500多种抗原（确认200多种）。红细胞抗原的多样性决定了抗体的多样性，检测抗A、抗B、抗D（ABO血型、Rh血型）可确保绝大多数病人的输血安全，但仍不能避免因血型不合（ABO、Rh血型以外）而引发的溶血。,2、临床有的病人出现慢性（迟缓性）溶血反应，易忽视或引不起临床医师重视。 （理论上讲，成年人每输1U的浓缩红细胞，在不丢失、不被破坏（溶血）的前提下，应能提升Hb5-10g/L (0.5-1g/dl),保持15-30天。如果输3-4U RBC，病人Hb上升不到10g/L，或几天后（1周内）Hb仍旧下降到原来水平，甚至更低。这种情况，就要考虑是否有慢性溶血反应存在。） 3、有利于早期发现和确认具有临床意义的抗体，获得充足的时间来选择相配合的血，避免由于寻找不到相合的血液而造成患者病情的延误。,抗体筛选检查,一、什么叫“抗体筛选”检查 1、不规则抗体的含义：通常把抗A、抗B以外的所有红细胞血型抗体称为不规则抗体。如抗D、抗N、抗M、jk-抗体。 2、“抗体筛选”的含义：用具备有临床意义的血型抗原的O型红细胞，检测病人血清（含多种抗体）；如果出现聚集现象，则提示病人有不规则抗体存在，可判为“抗体筛选”阳性。,抗体筛选技术要求,尽可能多的检测出有临床意义的抗体。 尽可能少的检测出无临床意义的抗体。 尽可能快的完成抗体检测,方法选择：每种方法都有自己的特点，适应于不同范围及情况,盐水法：可以用于检测干扰ABO定型的盐水反应活性抗体，如：MN、P血型抗体。但此方法会检查出无临床意义的抗体，如冷凝集素抗I及抗IH等，而且会漏检IgG性质的抗体。 低离子聚凝胺法（LIP-IAT）：所需试验时间少（35分钟）、方法灵敏度高，准确性高，但无法排除无临床意义抗体的干扰。 间接抗人球方法：是很灵敏且有效的检测抗体的方法，同时此方法可以有效的避免无临床意义抗体的干扰。缺点：耗时间长，步骤多。,抗体特异性鉴定,使用谱细胞确定抗体的特异性，谱细胞一般由8-16种含有不同抗原的O型红细胞配套组成，根据谱细胞的反应格局一般可以鉴定常见的抗体。,检测新生儿溶血的“三项试验”,直抗试验：即用直接抗球蛋白试验的方法，检测新生儿红细胞上是否存在免疫抗体。 游离试验：是检测新生儿血清中的血型抗体。 释放试验：和直抗试验相同，也是检测新生儿红细胞上的致敏的血型抗体，只是方法不同。,交叉配血试验的涵义,目的：是检查供、受血者血液中是否含有不相合的抗原 和抗体成分的试验。 发现ABO血型鉴定的错误：如将O型受血者误定为A型，当与A型献血者交叉配血时，病人血清与献血者红细胞即可出现凝集，从而避免严重的溶血性输血反应。 发现不规则凝集素：如含抗A1不规则凝集素的A2型血清，与A1型献血者红细胞配血时，可出现凝集，这种不规则凝集素一般为冷凝集素，如效价不高，影响不大。但若为免疫性抗体，37条件下效价较高，就必须选用亚型相同的血液，否则可产生溶血性输血应。 发现ABO血型以外的其他抗体：如抗P1，抗H等天然抗体和抗D等免疫性抗体，虽然输入的血液ABO血型相同，但ABO血型以外的其他抗体存在时，同样可能引起严重的溶血性输血反应。特别是现在许多化验室因为条件的限制不可能对ABO及RH（D）以外的血型全部进行鉴定，全靠交叉配血发现血型的不同和ABO、RH（D）血型以外的其他抗体的存在。,程序,查询受血者既往血型检查纪录； 对受血者血样作ABO、RH血型鉴定及血型抗体筛选、抗体鉴定； 选择预先进行血型检查的合格供血者作交叉配血试验； A.主侧配血：受血者血清 + 供血者红细胞检测对供者红细胞起反应的抗体； B.次侧配血：受血者红细胞 + 供血者血清检测对受者红细胞起反应的抗体； C.自身对照：受血者红细胞 + 受血者血清显示自身抗体、直接Coomb,s阳性红细胞缗钱状凝集（假阳性）以及在低温下的冷凝集。,结果,交叉配血试验的任何步骤中均不产生溶血和凝集的结果，供者的血液成分才可发给患者输注。红细胞抗原与相对应的免疫抗体相遇，在有补体存在就可发生溶血。溶血反应与凝集反应在交叉配血上意义相同，都是抗原抗体反应。 溶血的标本不应用作配血。,交叉配血中责任性错误：,1. 无论是对病人还是工作都要有高度的工作责任感，并严格按照规程操作。 2. 各种器材要干净，干燥（或用等渗盐水洗涤），防止溶血。 3. 配血、发血和登记时要仔细核对病人的姓名、病房、床号、住院号、血型。不要加错血清、红细胞和试剂，防止由于滴管、吸管、试管的紊乱，而造成被检者之间、血清和红细胞之间的相互污染。 4. 病人和献血者的血标本必须符合标准，不要长期放在室温下，以免污染和滋生细菌。等渗盐水必须等渗、新鲜、无微生物滋生。 5 观察结果要仔细，微弱凝集或肉眼观察未凝集的标本，要用显微镜观察。注意特异性凝集与继发性血液凝固、缗钱状凝集形成的区别。,6. 观察结果，要遵守规定时间，冬季要注意保温，避免冷凝集素干扰结果。 7. 注意病人的输血史，有无不良反应，女病人要注意妊娠及分娩史。对反复输血的病人，每取一次配血标本，不要连用三天以上，更不能供反复多次配血用。因为任何一次输血都有产生抗体的可能，因此前次输血使用过的配血标本不能代表病人再次输血时体内的情况，所以，超过三天，应另取病人标本配血。 8. 登记结果和填发报告要仔细正规，查对无误后，才能发出报告。特别要注意不要在配血结果尚未出来时就已填好报告，防止很忙时将配血试管遗忘在离心机内。 9. 配血后应将配血标本置冰箱保存，保留至血液输完至少七天后，以备复查。,假阳性及其控制对策：,1. 红细胞缗钱状凝集： 红细胞相互重叠，连接成串，象一串重叠的钱币，又称串钱状凝集。可由以下原因引起。患者纤维蛋白原升高或异常蛋白血症（多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症），新生儿脐带血中含有华顿胶，实验室中温度过高、作用时间太长致水分蒸发、血清浓缩。红细胞缗钱状凝集不是抗原抗体反应，不是配血禁忌，如献血者正常，明确是假凝集后，可以输血。 控制对策：多加生理盐水可稀释血液使缗钱状红细胞散开用高倍显微镜仔细观察红细胞凝集块的形态（红细胞未被破坏）察看病人诊断用洗涤后的红细胞配血。,2. 冷凝集：在较低温度下出现凝集而温度25时凝集即可消失的凝集称为冷凝集。多数正常人的血清在04时能凝集本人的红细胞，所以又称自身凝集，这种冷凝集素的效价一般不超过1：16，这种凝集是可逆的。但一些自身免疫性疾病、非典型性肺炎、病毒性肝炎、肝硬化、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤等疾病患者的血清中，可以出现高效价的冷凝集素且能与本人及其它各型人的红细胞发生凝集。注意配血报告要注明有冷凝集现象。 控制对策：标本在血清没有完全析出之前不要放入冰箱可将配血结果置37水浴箱温浴之后看，并反复观几次将红细胞用37生理盐水洗涤或用2Me处理血清以消除冷凝集素之后进行配血可用自身或兔红细胞反复吸收放散的方法除去血清中的冷凝集素。,3. 自身免疫性温型抗体： 自身免疫性溶血性贫血的病人血清中可有温型自身抗体。其特点是反应温度在37比室温作用强或相同，能凝集自身和其他各型红细胞，病人红细上吸附了这种抗体，在自身或他人血清中，均可出现凝集。 控制对策：可用递增温度（由22 37 45）生理盐水洗涤红细胞后再进行配血。如果最后仍有凝集，可选用凝集较弱的血与患者输注。缓慢输注，密切观察，一旦病人出现反应应立即停止输注。此类病人万不得已不要输血,可用其他办法替代.,4. 全凝集与多凝集： 全凝集：人的红细胞都含有H抗原，如果标本被棒状杆菌污染，血清中可出现H抗体，这种抗体与含有H抗原的各型红细胞发生凝集，这种血清称为全凝集血清。取多个已知O型血人的红细胞与此怀疑的血清作试验，如都能凝集，即可证明为全凝集血清。 多凝集：人的红细胞上含有一种无活性的T隐性受体，在实验室中某些细菌或细菌产生的酶污染红细胞后可以使T受体致活，而正常人血清中多数都含有抗T抗体，因此这种被活化了的T受体的红细胞能被各型人的红细胞凝集（新生儿的血清除外）。这种现象称又称为T凝集现象。T凝集现象也可偶见于某些有明显细菌感染的病人且多为O型病人，其次为A和B型，AB型病人出现T凝集现象的则未见报道。病人的T凝集现象具有以下特点：病人的红细胞不被本人的红细胞凝集，冷凝集的病人血清能凝集自己的红细胞；T凝集在室温较强，37较弱或消失，冷凝集在37消失，在4最强；病人有感染史，多凝集的表现未暂时性的，一般在病愈后即自行消失；血库储存的血液制品出现全凝时，细菌培养可为阳性；多凝集的凝块较大，但游离红细胞较多。 控制对策：试管、滴管等应经常保持清洁，不被细菌污染如怀疑为全凝集或多凝集，首先用多份AB型血清加以证明。注意标本的保存，新鲜不被污染。,5. 类B抗原形成(即获得性B抗原)：,某些A型老年癌症患者和肠道革兰氏阴性杆菌（如大肠杆菌O86、普通变形杆菌等）感染的病人，其红细胞除能被抗A血清凝集外，也能与抗B血清发生凝集。血清中仍含有正常的抗B，好像红细胞获得了一种与B类似的抗原称为类B抗原。此类病人可能导致血型鉴定错误,所以必须要有正反定型才能判定血型.交叉配血、输血时一定要谨慎。有人认为有些细菌的酶含有乙酰基酶能使特异性A物质末端的N乙酰氨基半乳糖水解成半乳糖。类B抗原有以下特点：类B与抗B的反应与正常B抗原与抗B的反应弱，一般无溶血现象。类B是获得性的，不符合遗传规律，病情好转，类B就消失。类B与抗B结合疏松，用红细作吸收放散试验，可放散出大量抗B。类B病人的唾液不含该血型物质。在AB血的交叉配血时，如发现主侧凝集，应考虑类B存在，应重新定血型并检查唾液中的血型物质。类B与多凝集不同，前者只与抗B反应，在AB型血清中不凝集，后者与AB型血清中凝集。,6. 抗储存红细胞抗体： 红细胞在37储存2天，在室温室温储存47天，在4冰箱储存23个月以后，能与少数人的血清发生非特异性凝集。这种血清中抗体叫做抗储存红细胞抗体，能与酶处理红细胞发生非特异凝集或溶血，造成交叉配血的紊乱。此抗体对输血无影响。,7. 自发性或继发性凝固： 这种凝固不是抗原抗体的反应，而是因为采血动作缓慢，血液自行凝固，或是用血浆配血时，当用具或生理盐水中Ca离子较多，即可发生继发性凝固。这种凝固往往看到白色的纤维蛋白网。 控制对策：防止Ca离子污染，注意判断结果时继发性凝固与红细胞凝集的区别。,假阴性及其控制对策,1. 红细胞过浓或过淡： 抗原抗体比例适当，反应最明显。如果红细胞悬液（最适为3%5%）过浓，血清中的抗体全被吸收呈后带现象，以致凝集不明显，不凝集；如果红细胞悬液过淡，血清中的抗体浓度相对太高呈前带现象，以致凝集不明显，不凝集。 控制对策：按规定配制红细胞悬液，微弱凝集用显微镜看结果。,2. 溶血性抗原或血型物质的中和作用 未经洗涤的红细胞悬液中，带有血浆中的血型物质。特别是轻度溶血时，部分红细胞溶解，释放出大量溶解性抗原，可将血清中对应抗体中和，导致抗体不足，使红细胞不凝集。 控制对策：不使用溶血标本，红细胞洗涤后使用。,3.血型抗体水平下降： 老年人血型抗体水平下降某