课件：第十四章食品中有害物质的检测.ppt

第十四章 食品中有害物质的检测,第一节 概论 第二节 食品中有害物质常用的检测方法 第三节 食品中农药残留及其检测 （第四节 食品中兽药残留及其检测） 第五节 食品中霉菌毒素及其检测 （第六节 食品中天然毒素及其检测） （第七节 食品中源于包装材料的有害物质及其检测） （第八节 食品加工过程中形成的有害物质及其检测） （第九节 食品中其他有害物质及其检测）,第一节 概论 一、有害物质与有毒物质的概念 在自然界中, 当某物质或含有该物质的物料被按其原来的用途正常使用时, 若因该物质而导致人体生理机能、自然环境或生态平衡遭受破坏时, 则称该物质为有害物质。 有毒物质: 一般的定义为凡是以小剂量进入机体, 通过化学或物理化学作用能够导致健康受损的物质。 有毒物质是相对的 剂量决定,二、食品中有害物质的种类与来源 食品中有害物质分三大类： 是生物性有害物质, 如黄曲霉、口蹄疫致病菌等； 是化学性有害物质, 如DDT、氯丙醇、河豚毒素、重金属、放射性元素等； 是物理性有害物质, 如金属屑、石子、动物排泄物等。,1、内源性危害：食品中天然存在的有毒有害成分，如河豚毒素、苦杏仁苷等；存在于食品中的生 理作用成分，如蛋白酶抑制剂；食物中的营养不平衡。 2、外源性危害：食品中的微生物污染，如经口传染的病菌、细菌毒素、霉菌毒素；人为掺假，有意加入的食品添加剂，如亚硝酸盐；意外或偶然进入食品的化学物质，如残留农药、重金属、多氯联苯。 3、诱发性危害：在食品加工、储藏过程中诱发食品内或生物体内生成有害物质，如油脂氧化产生过氧化物、亚硝酸盐与胺反应生成亚硝基化合物。 三、加强食品中有害物质检测的必要性,食品危害的潜在来源：,第二节 食品中有害物质常用的检测方法,薄层色谱法,气相色谱法,高效液相色谱法,质谱法,色质联用,酶联免疫吸附剂测定,第三节 食品中农药残留及其检测,杀虫剂、杀菌剂、除草剂、杀螨剂、植物生长调节剂、杀鼠药,农药残留是指农药施用后，残存在生物体、农副产品和环境中的微量农药原体、有毒代谢产物、降解物和杂质的总称。 残留的数量叫残留量。,农药残留是目前影响我国食品和农产品安全的主要因素，已经给我国农产品销售、出口和消费者的身体健康带来了严重影响。,对人体危害：通过食物和水的摄入、空气吸入和皮肤接触等途径对人体造成多方面的危害，如急、慢性中毒和致癌、致畸、致突变作用等； 对环境危害：污染环境，破坏生态平衡。 污染食品：使一些食品残留少量农药。,食品中农药残留的来源： 1. 施用农药对农作物的直接污染 2. 农作物从污染的环境中吸收农药 3. 通过食物链、生物富集污染食品 4. 其他来源的污染：事故性污染,主要农药,有机氯杀虫剂 有机磷杀虫剂 拟除虫菊杀虫剂 氨基甲酸酯杀虫剂,1.有机氯农药（Organochlorine pesticides, OCPs） 主要有六六六粉(六氯环己烷)、DDT(二氯二苯三氯乙烷) 毒性特点： 难分解、半衰期10年以上，高残留； 污染食品严重，脂溶性强，蓄积于脂肪和脂肪高的组织； 中等毒性，致癌、致畸作用。 性质： 不溶于水，易溶于脂肪、丙酮、乙醇、石油醚、环己烷，对光、热、酸稳定，对碱不稳定。,特点： 由于这类农药具有较高的杀虫活性, 杀虫谱广, 对温血动物的毒性较低, 持续性较长, 加之生产方法简单, 价格低廉, 因此, 这类杀虫剂在世界上相继投入大规模的生产和使用, 其中, “六六六”、DDT等曾经成为红极一时的杀虫剂品种。但, 从20世纪70年代开始, 许多工业化国家相继限用或禁用某些OCPs, 其中主要是DDT、“六六六”及狄氏剂。我国早已停止生产和使用有机氯农药。但由于其性质稳定, 在自然界不易分解, 属高残留品种, 因此在世界许多地方的空气、水域和土壤中仍能够检测出微量OCPs的存在, 并会在相当长时间内继续影响食品的安全性, 危害人类健康。,2.有机磷农药（OPPs） 是含有CP键或COP、CSP、CNP键的有机化合物。应用广。 （1） 分类： 高毒有机磷 （早期发展，现已被禁止使用） 如对硫磷（1605）、内吸磷（1059）、甲胺磷（3911）等； 中等毒有机磷 如乐果、杀螟松、倍硫磷等； 低毒有机磷 如敌百虫、马拉硫磷、双硫磷等。,（2）特点 化学性质不稳定，易分解，污染食品后残留时间短，在生物体不易蓄积。 在加工处理过程（碾磨、洗涤、去皮、烹调）中可减少。 以急性毒性为主，表现出神经中毒症状。长时间接触对肝脏功能有损。,过量或施用时期不当或使用高毒农药 是造成有机磷农药污染食品的主要原因,特点： 有机磷杀虫剂由于药效高, 易于被水、酶及微生物所降解, 很少残留毒性等, 因而从20世纪40年代到70年代得到飞速发展, 在世界各地被广泛应用, 有140多种化合物正在或曾被用作农药。但是, 有机磷杀虫剂存在抗性问题, 某些品种存在急性毒性过高和迟发性神经毒性问题。从70年代以后, 有机磷杀虫剂的研究和开发速度大大放慢了, 但在杀虫剂领域, 目前它仍被广泛使用。,3.氨基甲酸酯类 是一种高效、低毒、低残留的农药。 通式： 常见的有：甲萘威、呋喃丹、速灭威等。,甲萘威,这些氨基甲酸酯农药在农业生产与日常生活中, 主要用作杀虫剂、杀螨剂、除草剂、杀软体动物剂和杀线虫剂等。20世纪70年代以来, 由于有机氯农药受到禁用或限用, 且抗有机磷农药的昆虫品种日益增多, 因而氨基甲酸酯的用量逐年增加, 这就使得氨基甲酸酯的残留情况倍受关注。,4.拟除虫菊酯类 是模拟天然除虫菊酯化学结构而合成的农药。常用的有 氯菊酯、溴菊酯、氯氰菊酯、甲醚菊酯。 特点： 高效、低毒、低残留，在环境中的降解以光解为主； 对胆碱酯酶无抑制作用； 亲脂性强，可溶于多种有机溶剂，在水中的溶解度小, 在酸性条件下稳定，在碱性条件下易分解。,1973年第一个对光稳定的拟除虫菊酯苯醚菊酯开发成功之后, 溴氰菊酯、氯氰菊酯、杀灭菊酯等优良品种相继问世。目前, 已合成的菊酯数以万计, 迄今已商品化的拟除虫菊酯有近40个品种, 在全世界的杀虫剂销售额中占20左右。拟除虫菊酯主要应用在农业上, 如防治棉花、蔬菜和果树的食叶和食果害虫, 特别是在有机磷、氨基甲酸酯出现抗药性的情况下, 其优点更为明显。除此之外, 拟除虫菊酯还作为家庭用杀虫剂被广泛应用, 它可防治蚊蝇、蟑螂及牲畜寄生虫等。,食品中农药残留分析检测技术,1. 薄层色谱法（TLC） 2. 气相色谱法（GC）占70% 3. 气相色谱-质谱法（GC-MS） 4. 液相色谱法（HPLC） 5. 液相色谱-质谱法（LC-MS） 6. 超临界流体色谱（SFC） 7. 毛细管电泳（CE） 8. 免疫分析（IA）,食品中有机氯农药残留量测定 GB/T 5009.19 GC-ECD法 配标准混合使用液 样品提取（用丙酮、己烷、乙醚、石油醚等）与净化（用H2SO4磺化）、浓缩（ KD减压浓缩）、GC检测、ECD（电子捕获）检测器。 色谱柱用硬质玻璃柱，若用不锈钢柱，易引起农药分解。 采样液体样品时，应用玻璃瓶，不能用塑料瓶。 检测器的温度不应低于250，否则，检测器很难平衡。 注意尾吹气流量及分流比。 TLC法,食品中有机磷农药残留量的测定 GB/T 5009.20-2003 原理：,果蔬中有机磷残留,提取,有机溶剂,净化,气化,注入GC,浓缩,色谱柱中 分离,FPD 检测,记录色谱峰,比较样品和标准品的色谱峰,外标定量（多用峰高）,蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类 农药残留量的快速检测 GB/T 5009.199-2003 方法一 速测卡法（纸片法） 实验原理： 胆碱脂酶可催化靛酚乙酸脂（红色）水解为乙酸与靛酚（蓝色），有机磷或氨基甲酸脂类农药对胆碱脂酶有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变，由此可判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸脂类农药的存在。,实验试剂： 1、固化有胆碱脂酶和靛酚乙酸脂试纸卡片（速测卡）； 2、pH 7.5 磷酸盐缓冲液：分别称取15.0g磷酸氢二钠Na2HPO412H2O与1.59g无水磷酸二氢钾KH2PO4，用500 mL蒸馏水溶解。 实验步骤： 1、整体测定法 （1）选取具有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，剪成1cm左右方形碎片,取5g放入带盖瓶中，加入10 mL缓冲溶液，振摇50次，静置2min以上. (2) 取一片速测卡，用白色药片沾取提取液，放置10min以上进行预反应，有条件时在37恒温装置中放置10min。预反应后的药片表面必须保持湿润。,（3）将速测卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min，使红色药片与白色药片叠合发生反应。 注意：每批测定应设一个缓冲液的空白对照卡。 2、表面测定法（粗筛法） （1）擦去蔬菜表面泥土，滴23滴缓冲液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液处轻轻摩擦。 （2）取一片速测卡，将蔬菜上的液滴滴在白色药片上。 （3）放置10 min以上进行预反应，有条件时在37 恒温装置中放置10 min。预反应10 min，预反应后的药片表面必须保持湿润。 （4）将速测卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min，使红色药片与白色药片叠合发生反应。 注意：每批测定应设一个缓冲液的空白对照卡。,结果判断： 结果以酶被有机磷或氨基甲酸脂类农药抑制（为阳性）、未抑制（阴性）表示。 与空白对照卡比较，白色药片不变色或略有浅蓝色均为阳性结果。白色药片变为天蓝色或与空白对照卡相同，为阴性结果。 对阳性结果的样品，可用其他方法进一步确定具体农药品种和含量。,注意事项及说明： 1、速测卡灵敏度指标如下表所示。 部分农药检出限参考表,2、速测卡符合率：在检出的30份以上阳性样品中，经气相色谱法验证，阳性结果的符合率应在80%以上。 3、葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇和番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，可采取整株（体）蔬菜浸提或采用表面测定法。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株（体）蔬菜浸提法，减少色素的干扰。,方法二 酶抑制率法（分光光度法） 实验原理： 根据有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制乙酰胆碱酯酶的活性原理，向蔬菜的提取液中加入生化反应底物碘化硫代乙酰胆碱和乙酰胆碱酯酶，如果蔬菜不含有机磷或氨基甲酸酯类农药残留或残留量低，酶的活性就不被抑制，加入的底物就能被酶水解，水解产物与加入的显色剂反应产生黄色物质。如果蔬菜的提取液含有农药并残留量较高时，酶的活性被抑制，底物就不被水解，当加入显色剂时就不显色或颜色变化很小。用分光光度计在412nm处或农药残毒快速检测仪测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率，就可以判断蔬菜中含有机磷或氨基甲酸酯类农药残留量的情况。,2019/8/23,39,可编辑,第四节 食品中兽药残留及其检测,典型的兽药是指用于预防和治疗畜禽疾病的药物。但是, 随着集约化养殖生产的开展, 一些化学的、生物的药用成分被开发成具有某些功效的动物保健品或饲料添加剂, 也属于兽药的范畴。兽药的主要用途有防病治病、促进生长、提高生产性能、改善动物性食品的品质等。兽药残留是指动物性产品的任何可食部分含有兽药母化合物或其代谢物。兽药最高残留限量（MRLVD）是指某种兽药而在食物中或食物表面产生的的最高允许兽药残留量（单位 g/kg, 以鲜重计）。 兽药残留主要是由于各种正常用药和药物滥用造成的,另外,休药期(是指自停止给药到动物获准屠宰或其动物性产品获准上市的间隔时间)过短, 是造成动物性食品兽药残留过量的另一个重要原因。,第五节 食品中霉菌毒素及其检测,食品中黄曲霉毒素B1的测定 GB/T 5009.222003 黄曲霉毒素（AFT）是一组化学结构类似的化合物，根据其在365nm紫外光下呈现的荧光颜色可分为B、G两大类。根据Rf值不同，又分为B1、B2、G1、G2、M1、M2等，其中以AFTB1毒性、致癌性最强，且含量多。 常以B1为主要指标。 黄曲霉毒素的基本结构为二呋喃环和香豆素。 AFT主要污染：花生、花生油、玉米、大米、乳制品、腌制鱼肉等，M1和M2主要存在于牛奶中。,性质： 难溶于水，不溶于乙醚、石油醚及己烷。 易溶于油、甲醇、丙酮、氯仿、苯及乙腈等有机溶剂。 对光、热、酸较稳定，对碱和氧化剂则不稳定。 其纯品为无色结晶，紫外线对低浓度AFT有破坏性。 据统计全世界每年平均有2%的谷物由于霉变不能食用。霉菌毒素引起的中毒大多通过被霉菌污染的粮食，油料作物以及发酵食品等引起。霉菌毒素多数有较强的耐热性, 一般的烹调加热方法不能使其破坏。当人体摄入的霉菌毒素量达到一定程度后, 可引起中毒。霉菌中毒往往表现为明显的地方性和季节性，临床表现较为复杂，有急性中毒、慢性中毒以及致癌、致畸和致突变等。,薄层层析法 原 理 样品中黄曲霉毒素B1，经有机溶剂提取、浓缩、薄层分离后，在波长365nm紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定黄曲霉毒素B1的含量。,仪器和试剂 (1)仪器 小型粉碎机、样筛、电动振荡器、玻璃浓缩器、玻璃板5cm20cm、薄层板涂布器、展开槽(内25cm6cm4cm)、紫外光灯100一125w带波长365nm滤光片、微量注射器 (2)试剂 三氯甲烷、正己烷或石油醚(沸程3060或 6090)、甲醇、苯、乙腈、无水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水、丙酮。以上试剂在试验前需先进行空白试验，如不干扰测定即可使用，否则需逐一进行重蒸。 硅胶G(薄层色谱用)、三氟乙酸、无水硫酸钠、氯化钠、苯一乙腈(98+2)混合液、甲醇水溶液(55+45)。 黄曲霉毒素B1标准液：准确称取11.2mg AFTB1标准品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100mL，避光、于冰箱4保存。此标准液浓度约为10ugmL。先用紫外分光光度计测定其浓度，再用苯一乙腈混合液调整其浓度恰为10.0ugmL。在350nm，AFTB1在苯一乙腈(98+2)混合液中的摩尔消光系数为19800。,黄曲霉毒素B1标准使用液： I液(1.0ugmL)：取1mL AFTB1标准液(10.0ugmL)于10mL容量瓶中，用苯一乙腈混合液稀释、定容。 液(0.2ugmL)：取I液1mL，按上法定容5mL。 液(0.04ugmL)：取液1mI，按上法定容5mI。 次氯酸钠溶液(消毒用)：取100g漂白粉，加入500mL水，搅拌均匀。另将80g工业用碳酸钠(Na2CO310H2O)溶于500mL温水中。将两液合并、搅拌、澄清、过滤。此液含次氯酸约25gL。污染的玻璃器皿用次氯酸钠溶液浸泡可达到去毒的效果。,分析步骤 一、样品处理 取大样，经粗碎及连续多次用四分法缩减至0.5l kg后全部粉碎。粮食样品全部通过20目筛，花生样品全部通过10目筛，混匀。 二、提取 称取20.00g经粉碎样品，置于250mL具塞锥形瓶中，加30mL正己烷或石油醚和100mL甲醇水溶液，瓶塞上涂一层水、盖严防漏。振荡30min，静置片刻，以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，待下层甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶内。取20.00mL甲醇水溶液(相当于4.0g样品)置于另一125mL分液漏斗中，加20mL三氯甲烷，振摇2min、静置分层，如出现乳化现象，可滴加甲醇促使分层。放出三氯甲烷层，经盛有约10g预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸，过滤于50mL蒸发皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并于蒸发皿中。,将蒸发皿放在通风柜，于65水浴上通风挥干，然后于冰盒上冷却23min后，准确加入1mL苯一乙腈混合液。用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，若有苯的结晶析出，将蒸发皿从冰盒上取出，继续溶解、混合，晶体即消失，再用此滴管吸取上清液转移于2mL的具塞试管中。,三、测定 单向展开法 a薄板制备：称取3g硅胶G，加23倍量的水，研磨12min呈糊状后，倒入涂布器推成5cm20cm，厚度约0.25mm的薄层板3块。在空气中干燥15min，在100活化2h，取出，放干燥器中保存。 b点样：在距薄层板下端3cm的基线上用微量注射器或血色素吸管滴加样液。一块板可滴加4个点，点距边缘和点间距为lcm，点直径约3mm，在同一板上滴加点的大小应一致，滴加时可用吹风机用冷风边吹边加。,滴加样式如下： 第一点：10L AFTB1标准使用液(0.04gmL)。 第二点：20L样液。 第三点：20L样液+10L 0.04gmL AFTBl标液。 第四点：20L样液+10L 0.2gmL AFTB1标液。 c展开与观察：在展开槽内加10mL无水乙醚，预展12cm，取出挥干。再于另一展开槽内加10mL丙酮一三氯甲烷(8+92)，展开1012cm，取出，在紫外光下观察结果。,d确证试验: 第一点：10L 0.04gmL AFTBl标准使用液。 第二点：20L样液 于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上，反应5min后，用吹风机吹热风2min(板上温度不高于40)，再于薄层板上滴加以下两点。 第三点：10L 0.04gmL AFTBl标准使用液。 第四点：20L样液。 按上法展开并观察，样液是否产生与AFTB1标准点相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为样液与标准的衍生物空白对照。,e稀释定量： 若样液中荧光强度比最低检出量强，则根据其强度估计，减少滴加微升数，或将样液稀释后再滴加不同微升数，直至样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。滴加式样如下： 第一点：l0L AFTB1标准使用液(0.04gmL)。 第二点：根据情况滴加10L样液。 第三点：根据情况滴加15L样液。 第四点：根据情况滴加20L样液。,f结果计算： 式中：X 一 样品中AFTBl的含量，ugkg； V1一加入苯一乙腈混合液的体积，mL； V2出现最低荧光时滴加样液的体积，mL； D一样液的总稀释倍数； m1加入苯一乙腈混合液溶解时相当样品的质量，g； 0.0004AFTBl的最低检出限量，ug。,双向展开法 （滴加两点法） (1)点样：取薄层板三块，在距下端3cm基线上滴加AFTB1标液与样液。即在距左边缘0.81cm处各滴加10uL AFTB1(0.04ugmL)标准液，在距左边缘2.83cm处各滴加20uL样液。然后在第二块板的样液点上加滴l0uL AFTBl(0.04ugmL)标准液，在第三块板的样液点上加滴10uL AFTB1(0.2ugmL)标准液。,(2)展开： a横向展开：10mL无水乙醚，展至板端后，取出挥干。根据情况，可再重复l2次。 b纵向展开：以丙酮一三氯甲烷(8+92)展开至1012cm为止。 (3)观察与评定结果： a在紫外灯下观察第一、二块板，若第二块板的第二点在AFTB1标准点的相应处出现最低检出量，而第一板在与第二板的相同位置上未出现荧光，则样品中AFTBl含量5ugkg.,b若第一块板在与第二块板的相同位置上出现荧光点，则将第一块板与第三块板比较，看第三块板上第二点与第一块板上第二点的相同位置上的荧光点是否与AFTB1标准点重叠，如果重叠，再进行确证试验。在具体测定中，三块板可以同时做，也可按顺序做。当第一块板出现阴性时，第三块板可以省略，如第一块板为阳性，则第二块板可省略，直接做第三块。,(4)确认试验：另取薄层板二块，于第四、五两板距左边缘0.81cm处，各滴加10u LATTB1(0.04ugmL)标准液及一小滴三氟乙酸；在距左边缘2.83cm处，于第四板滴加20uL样液及一小滴三氟乙酸；于第五板滴加20uL样液、10uLAFTBl(0.04ugmL)标准液及一小滴三氟乙酸，反应5min后，用热风吹2min(板上温度不高于40)。再用双向展开法展开后，观察样液是否产生与AFTB1标准点重叠的衍生物。观察时，可将第一板作为样液的衍生物空白板。若样液AFTB1含量较高时，则将样液稀释后，按单向展开法中d做确认试验。,(5)稀释定量： (6) 结果计算： 同单向展开法。 说明及注意事项 用过后受污染的玻璃器皿，应经次氯酸溶液(25gL)，浸泡消毒数小时后再清洗之！,酶联免疫(ELISA)法 实验原理： 采用间接竞争ELISA方法，样品中的黄曲霉毒素B1经提取、脱脂、浓缩后与定量特异性抗体反应，多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合，加入酶标记物和底物后显色，与标准比较测定含量。,主要的食品包装材料及其有害物的种类,食品加工过程中形成的有害物质,烟熏、油炸、焙烤、腌制等加工技术, 在改善食品的外观和质地, 增加风味, 延长保存期, 钝化有毒物质（如酶抑制剂、红细胞凝集素）以及提高食品的可利用度等方面发挥了很大作用, 但随之还产生了一些有害物质, 相应的食品存在着严重的安全性问题, 对人体健康可产生很大的危害。在这几类食品加工过程中形成的有害物质主要可分为三类：N-亚硝基化合物、多环芳烃和杂环胺。 在习惯吃熏鱼的冰岛、芬兰和挪威等国家, 胃癌的发病率非常高。我国胃癌和食管癌高发区的居民也有喜食烟熏肉和腌制蔬菜的习惯。,N-亚硝基化合物,N-亚硝基化合物(NOC)是一大类有机化合物, 根据其化学结构, 可分为两类：一类为亚硝胺, 另一类为N-亚硝酰胺。 通过对300多种N-亚硝基化合物的研究, 已经证明约90具有强致癌性, 其中N-亚硝酰胺是终末致癌物, 亚硝胺需要在体内活化后才能成为致癌物。 含有N-亚硝基化合物较多的食品有： 干鱿鱼（300 g/kg）、熏肉（0.36.5 g/kg）、熏鱼（49 g/kg）、咸鱼（1224 g/kg）、咸肉