课件：组织病理学制片技术.ppt

Notice,1.上课请关手机（或调成振动，接电话到室外）。 2. 选修课自愿选择，试听一次，下次课班长提交选修课学生名单(包括email)。 3. 学分问题 平时表现 如：纪律、问答、作业。 结课测验? 对本课程的意见和建议；,组织病理学制片技术 Histopathologic technology,生命科学研究中心 邢立强 ,2,目的和要求 Aims and Requirements,了解生物组织的特点及取材的注意事项； 熟悉切片的原理、一般要求及注意事项； 掌握石蜡切片制作技术；,病理学常用的观察手段 The common survey means in pathology,1、大体标本观察：主要用肉眼、量尺及各种衡器等辅助工具，对所检标本的大小、形状、色泽、重量、表面及切面、病灶特点进行观察及测量。 2、组织切片的观察：取正常或病变组织进行切片、染色(HE染色最常用)在显微镜下进行观察。,病理学标本的种类 Types of pathologic samples,1、活体组织检查(Biopsy)：简称活检，从患者活体局部切取、钳咬、细针吸取和摘取等手术方法获取病变组织进行病理检查。 2、脱落细胞学检查(Exfoliative cytological exam)：对患者痰液、胸腹水、尿液以及阴道刮片、食管拉网、纤维胃/支气管镜所取得的材料进行涂片，以检查脱落细胞，是早期发现和诊断肿瘤的好方法。,3、尸体解剖(Autopsy)：通过尸检可查出病因和病变，及时发现和确诊某些传染病、新发现的疾病，积累经验，提高诊疗水平。 4、动物实验(Animal experiment)：根据研究需要，在动物身上复制人类某些疾病的模型、进行观察研究，了解疾病的病因、发病机制及药物疗效等。 5、组织/细胞培养(Tissue and Cell culture)：将某种组织或单细胞在适宜的培养基中体外培养，来研究各种病因作用下组织、细胞的病理变化及治疗效果。,病理技术的应用 Application of pathologic technique,帮助临床查明死因(尸检); 手术后病变标本，明确诊断(临床活检); 为教学、科研提供资料;,取材(Sample collection)固定(Fixation)脱水(Dehydration)透明(Transparentizing) 浸蜡(Paraffin soaking)包埋(Embedding),第一节 组织处理 Tissue processing,1. 人为因素 2. 标本大小 3. 取材时间 4. 包埋方向 5. 边缘标记,一、取材(Samples collection),6. 小标本的处理方法 7. 特殊情况取材 8. 取材数量 9. 清除多余成分 10. 重复取材 11. 核对取材 12. 剩余组织存放,二、固定(Fixation),固定就是用物理或化学方法，阻止组织细胞离体或培养细胞脱离生存环境后发生形态学变化。 (一)固定的目的 1. 迅速阻断组织细胞离体后的自溶性变化，防止腐败，尽量保持组织细胞生活状态下的形态结构。 2. 使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变成不溶性物质，并保持原有的空间位置。 3. 固定剂有硬化作用,增加组织的硬度,便于制片。 4. 组织中的各种物质经固定后产生对染料的亲和力，利于染色和观察。,（二）常用的固定方法,1. 浸泡固定法 2. 灌注固定法 3. 细胞涂片的固定方法 4. 微波固定法 5. 蒸气固定法,（三）常用的固定液,1. 单纯固定液 (1) 甲醛(formaldehyde) (2) 酒精(alcohol) (3) 苦味酸(picric acid) (4) 丙酮(acetone) (5) 醋酸(acetic acid),2. 混合固定液 (1) Bouin液 ：用于结缔组织及脂肪染色； (2) Zenker液：常用于三色染色； (3) 4%多聚甲醛-磷酸二氢钠-氢氧化钠液；,（四）固定后的处理 1. 一般固定液(甲醛等)固定组织后，用流水冲洗以清除组 织内的固定液终止固定。 2. 含有乙醇、乙酸及苦味酸的固定液，组织固定后不需要或不能用水冲洗。 3. 含有铬酸、重铬酸钾和锇酸的固定液，组织固定后应充分水洗，一般为1224h。 4. 用含汞的固定液固定组织后，要进行脱汞处理，可在组织脱水前或切片染色前进行，一般多在染色前脱汞。其方法为切片脱蜡入水后，入0.5%碘乙醇510min，水洗后再入3%5%硫代硫酸钠或95%乙醇12min，再充分水洗，蒸馏水洗后进行染色。,（五）固定时的注意事项 1. 标本 应新鲜并及时取材，快速放入固定液中。特殊标本应单独固定和存放。 2. 固定液的用量 一般固定液用量为组织块体积的1020倍，贵重的固定液不少于35倍。避免组织紧贴容器底部，影响固定效果。对于特殊染色的组织(如神经染色及酶组织化学染色等)固定时应考虑组织块的大小、固定液种类、固定时间和温度等。酶组织化学染色组织的固定应置于冰箱4固定。,3. 防止组织变形 柔软或较薄的组织先平铺在吸水纸上，再投入固定剂中；含气或脂肪多的组织易浮于液面，可在组织表面覆盖棉花以达到充分固定。 4. 固定液的穿透性 一般固定液在24h内不能穿透厚度大于23mm的实体组织或5mm的多孔疏松组织，故取材组织块的厚度原则上不应超过34mm。 5. 固定时间 固定的时间与固定液的种类、组织类型、块大小、温度等有关。一般1.5cm1.5cm0.2 0.3cm大小的组织块, 固定时间为1224h。 6. 固定温度 大多数可在室温(25)固定，在低温(如4)固定时，固定时间要相应延长。,三、脱水(Dehydration) 组织经固定和水洗后含大量水分，水与石蜡不能混溶。因此在浸蜡和包埋前，必须进行脱水。 常见的脱水剂有乙醇、正丁醇、丙酮等。 为防止水份丢失过快，造成组织变形，一般采用梯度脱水法。也就是使脱水剂的浓度逐渐升高，脱水过程尽量缓和，减少组织变形。,四、透明(Transparentizing),常用的透明剂有二甲苯、苯、甲苯、氯仿、环己酮、苯甲酸甲酯、香柏油、冬青油和苯胺油等。 目前也有用环己酮作为透明剂，环己酮为无色无毒液体，可与苯、二甲苯和酒精等相混合，也可溶解石蜡。而且脱水时组织不收缩变硬，用于快速石蜡切片效果较好。,五、浸蜡(Paraffin wax soaking),用熔化的切片石蜡逐渐替换组织中二甲苯的过程。,六、组织的包埋和包埋方法 (Embedding) （一）常规石蜡包埋 （二）脱落细胞标本的包埋 （三）微小标本的包埋,第二节 组织切片法 (Tissue sectioning),组织切片法包括石蜡切片法、冰冻切片法、火棉胶切片法、树脂包埋薄切片法和大组织石蜡切片法等。常用的切片工具包括组织切片机、切片刀和自动磨刀机等。,一、组织切片机和切片刀 1. 石蜡切片机 2. 火棉胶切片机 3. 恒冷箱切片机 4. 震动切片机,石蜡切片机,震动切片机,恒冷箱切片机,切片刀 切片刀是切片机的重要部件，常见的有两种： 一种为可重复使用的钢刀，一般有4cm、8cm、14cm、18cm、2024cm等，根据切片刀的形态，有平凹型、深平凹型、平楔型、双凹型。 另一种为一次性钢刀片，是一种薄型切片刀片，用于普通石蜡切片。使用时固定在特制的刀架上。,各种切片刀的剖面图,a平凹形 b深平凹形 c平楔形 d双凹形,石蜡切片机用一次性钢刀片,二、组织切片(Tissue sectioning),石蜡切片仍是目前各种切片制作方法中最常用、最普遍的一种方法。,2019/8/23,34,可编辑,(一)切片前的准备 1. 备齐常用器具, 如玻片、毛笔和铅笔或刻字笔。 2. 检查切片机的工作状态, 将固件都拧紧，检查切片刀是否锋利, 切片刀质量是保证切片的关键。如果使用一次性刀片, 应根据切片情况及时调整刀刃位置。,3. 清洁玻片的方法 （1）新载玻片的处理： 先用清洁液浸泡1224h, 流水充分冲洗后, 用蒸馏水洗35遍, 95%酒精浸泡2h, 用绸布擦干或用烘箱烤干备用。清洁液是用重铬酸钾和浓硫酸按比例配成的洗液。 常用的有以下几种配方： 重铬酸钾(g):浓硫酸(ml):蒸馏水(ml)=1:1:10; 重铬酸钾:浓硫酸:蒸馏水=2:3:25; 重铬酸钾:浓硫酸:蒸馏水=2:5:15。,（2）盖玻片的处理：盖玻片可按以上方法处理，但因盖玻片很薄，以上处理程序应缩短。清洁液浸泡2h，流水冲洗。也可用以下方法清洗:盖玻片立排于卧式染缸(排2行，中间隔以载玻片)。松紧度以玻片可轻松转动为好，以下步骤应保持液体进入每个玻片间隙，玻片之间不能有气泡。用1%盐酸酒精浸泡2h，然后流水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗数次。入95%酒精浸泡23h，无水酒精浸泡20min，倒掉酒精放60烘箱烤干备用。,（二）切片制作过程 1. 蜡块在冰箱中预冷，然后固定在切片机上。将切片刀装在刀架上。调整蜡块与刀的位置，使蜡块切面与刀刃接近。 2.切片机多为轮转式，使用时左手执毛笔，右手旋转切片机转轮。先修出标本，直到组织全部暴露于切面为止，标本过小时修块应多加注意，大标本要切全。切出蜡带后，用毛笔轻轻挑起一端，用镊子夹起另一端，正面向上放入展片水槽中(水温一般低于蜡熔点1012)，待切片展平后，即可进行捞片。,3. 切片时刀是由下向上运动，为得到完整的切片，防止组织出现刀纹裂缝，应将组织硬脆难切的部分放在上端(如皮肤组织的表皮部分，胃肠等组织的浆膜面等)。 4. 捞片时注意组织片的摆放位置，尽量整齐美观。要留出贴标签的空间， 5. 捞片时注意在切片和玻片之间不要留有气泡。捞好的切片应在60左右烤箱内烤至少30min。以防染色时脱片。,（三）石蜡切片制作时的注意事项 (Attentions) 1. 组织的取材和固定 ； 2. 组织脱水、透明和浸蜡 ； 3. 切片组织块固定不牢时； 4. 切片刀和切片机 ； 5. 特殊要求切片的制作 。,第三节 冰冻切片法 (Frozen sectioning),冰冻切片可用于新鲜组织、甲醛固定的组织和低温冰箱冷藏的组织块等。已固定的组织块经流水冲洗后再进行切片。,一、冰冻切片法 （一）恒冷箱切片机 提前开机预冷，一般工作温度设定在-22左右。待刀台、样品台和箱内达到设置温度后即可切片。顺序如下：将组织用OCT粘在样品托后放置在速冻台上；组织冻结后，将样品托固定到样品台上；调整组织切面与刀刃位置，初步修出组织切面后，放下防卷板，关闭观察窗，开始切片。切出的切片粘贴到载玻片上，直接冻存或吹干固定。 （二）半导体制冷切片机,二、冰冻组织的取材及保存方法,（一）取材 负责诊断的医师应亲自检查大体标本，做多切面详细检查，必要时可在解剖镜下观察。选取最具代表性的组织制片，必要时应多点取材。如切面有特殊要求，应向技术人员说明。取材和切片的剩余组织须进一步做石蜡切片进行对照，有利于病理医师对照阅片，不断提高观察冰冻切片的水平。,（二）保存方法 组织速冻的方法很多，常用方法为液氮和干冰丙酮法。 1. 液氮法：将组织块平放于瓶盖或标本盒等适当容器内，缓慢放入盛有液氮的容器内。当组织块冻结后，取出用铝箔包好，做好标记后入液氮罐或-70低温冰箱保存。可保存数月至数年。如短期内使用，可保存于-30冰箱。,2. 干冰-丙酮法：将组织块放入盛有OCT包埋剂的标本盒内，使组织块完全浸没。将丙酮倒入盛有10g干冰的保温杯调成糊状。将装有组织块的标本盒放入保温杯，待包埋剂成白色冻块时，取出如上法保存。此法组织速冻快，组织结构保存好。,3. 异戊烷-液氮法：此法的优点可防止冰晶破坏组织细胞的形态结构，对含水较多的组织适宜用此法进行速冻。先用甲基纤维素包埋组织块。将盛有异戊烷的小烧杯放入装有液氮的大保温杯或冰壶内，搅拌异戊烷待杯底出现一层白色糊状物时，放入包埋好的组织块，数秒钟即可取出，按上述方法保存。,（三）注意事项 1. 液氮速冻时，标本盒不能直接浸入液氮，以免组织膨胀破碎。 2. 速冻的包埋剂应适量。 3. 新鲜组织不能放入-10冰箱内缓慢冷却，否则组织内水分可逐渐析出形成冰晶，造成组织结构破坏。 4. 冷冻后的组织块应密封保存，防止失水。 5. 在组织块复温时，应在37加温速融，自然复温将造成组织结构破坏。,第四节 脱落细胞制片技术 Preparation of Exfoliative cytologic samples,脱落细胞标本包括：胸水、腹水、尿液、脑脊液穿刺液和一些涂片、刷片及印片的细胞，在临床上具有非常重要的诊断价值。,一、细胞标本的取材 细胞标本取材和制片方法一般有印片法、穿刺法、沉淀法和活细胞标本的制备等。 (一)印片法 常用于活检和手术标本，新鲜标本沿病灶中心剖开，将载片轻压于切面上，吹干后立即浸入固定液内5l0min，取出自然干燥，低温储存。优点是操作简单，细胞抗原保存好。,(二)穿刺液沉淀法 常用于淋巴结、软组织、肝、肾和肺等，穿剌液少，可直接涂片，细胞尽量涂均匀。穿刺液多，细胞丰富，可置离心管内，以500rpm低速离心5l0min，弃上清，将沉淀制成细胞悬液(2105细胞/ml)。,涂片镜检, 以细胞较密不重叠为好。干燥后固定。胸水、腹水、尿液和脑脊液等如细胞较少时，也可用此方法制片。此法细胞保存好，操作简单。注意涂片时，尽量涂均匀。 (三)单核细胞分离法 主要用于外周血和胸腹水中淋巴细胞的分离。如为血性胸腹水，经上述方法分离淋巴细胞然后在37培养30min，离心沉淀取上清，制成浓度为2106细胞/ml的细胞悬液，吸50l涂片，略干后固定l0min。,2019/8/23,57,宫颈脱落细胞涂片 见分化不良细胞体积大、核深染；正常上皮细胞核小、胞浆丰富。,二、血涂片的制作 血涂片的显微检查是血液细胞学检查的基本方法，临床上应用极为广泛，制备厚薄适宜、分布均匀、染色良好的血涂片是血液学检查的基本技术之一。 (一)操作步骤 1. 消毒：先按摩取血部位，使血流通畅；再用酒精消毒采血针和取血部位(如指尖)。 2. 取血：待酒精干后，刺破皮肤，使血自然流出，勿挤。取干净载片，让血滴在离载片一端中45mm处，注意手指持握载片的边缘，勿触及其表面。不能使载片接触取血部位的皮肤。,3. 推片：取一张边缘光滑的载片。将其一端置于血滴前方，向后移动到接触血滴，使血液均匀分散在推片与载片的接触处。然后使推片与载片呈3040角，向另一端平稳地推出。涂片推好后，通过摇摆使之快速干燥。 4. 染色：用特种玻璃铅笔在血膜两侧画两条线，防止染液外溢。再将瑞氏染液(伊红-亚甲基蓝)滴在血膜上，至染液淹没全部血膜，染半分钟。加等量蒸馏水(或缓冲液)与染液混合再染5分钟。最后用蒸馏水把染液冲掉，用吸水纸吸干，自然干燥后，即可观察。,（二）注意事项 活细胞标本制备中玻片的清洗：新玻片常有游离碱,因此应用清洗液或10%盐酸浸泡24h,然后再彻底清洗。用过的玻片可放入适量肥皂水或合成洗涤剂