课件：生物制药学——第五章固相析出分离法.ppt

,第五章 固相析出分离法,结晶法（晶体） 沉淀法（无定形固体）,固相析出分离法： 改变溶液条件，使溶质以固体形式从溶液中分出的操作技术。,思考对比固相析出分离法与溶液萃取分离法有何异同？,盐析法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法 其他沉淀法,,,第一节 盐析法,一、基本原理,盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀形式析出，从而达到纯化目的的方法。,,两性电解质，静电力作用，相互排斥； 形成水化膜，避免相互碰撞。,（1）生物大分子在水溶液中的特性,,（2）作用原理,破坏水化膜 中和电荷,,（3）盐析过程,“盐溶”低盐浓度下，蛋白质溶解度增大。 “盐析”高盐浓度下，蛋白质溶解度下降。,,蛋白质在水中的溶解度与离子强度的关系,Cohn经验公式： lgS = - Ks S 蛋白质溶解度，g / L； 盐离子强度， = ci Zi 2， ci 盐离子强度，mol / L； Z i i 离子化合价； 常数； Ks 盐析常数。,,Ks盐析法（溶解度剧烈下降） 在一定的pH和温度下，改变盐离子强度（浓度）进行盐析 分辨率不高 用于提取液的前期分离,盐析法（溶解度变化缓慢） 一定的盐离子强度下，改变pH和温度进行盐析 分辨率比Ks盐析法高 用于后期分离,,,a、盐析作用规律 半径小的高价离子作用较强，半径大的低价离子作用较弱（感胶离子序）。,阴离子：柠檬酸根酒石酸根SO42-F-IO3- H2PO4- CH3COO- Cl- ClO3-Br- NO3- ClO4- I- CNS- 阳离子：Th4+Al 3+ H+Ba2+Sr2+ Ca2+ Cs+ Rb+NH4+K+ Na+Li+,1）无机盐的种类,一般高价阴离子盐析作用较好,,b、用盐的参考要求,盐析作用要强 较大的溶解度，受温度影响小 必须是惰性的 来源丰富、经济,,c、硫酸铵特点,优点：价廉，溶解度大（767g/L），随温度变化小 缺点：水解变酸；高pH释氨，腐蚀；残留量对产品有影响。,,硫酸铵使用注意事项: 1、硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用，使用前用H2S处理. 2、高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0左右），使用前也需要用氨水调节至所需PH。 3、硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意。,,蛋白质种类不同（和 Ks不同）， 盐析沉淀所需的无机盐量也不同。 先后加入不同量的无机盐可分级沉淀不同蛋白质。,2）溶质（蛋白质等）种类,,蛋白质浓度大，盐的用量小，共沉作用明显，分辨率低； 蛋白质浓度小，盐的用量大，共沉作用小、分辨率高,3）蛋白质浓度的影响,一般常将蛋白质浓度控制在23为宜。,,适当稀释，可使盐析分布曲线互相重叠的两个蛋白质分级沉淀。,,4）温度的影响,一般在高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降。 必须考虑到蛋白质对热稳定性。 - 淀粉酶、蛋白酶,磷酸盐沉淀碳氧血红蛋白,,5）pH的影响,影响蛋白质表面净电荷的数量。 通常调整体系pH值使其在pI附近；且pr稳定性好。 在高盐溶液中蛋白质等电点的偏移现象。,,盐析时，将盐加入到溶液中有两种方式：,在实验室和小规模生产中溶液体积不大时，或硫酸铵浓度不需太高时，可采用这种方式。,1. 盐析用盐的浓度表示,（1）加硫酸铵的饱和溶液,三、盐析操作,Va：加入的饱和（NH4 )2S04 体积 V0：蛋白质溶液原始体积 P1、P2：分别表示初始和最终溶液的饱和度，,,（2）直接加固体硫酸铵,在工业生产溶液体积较大时，或需要达到较高的硫酸铵饱和度时，可采用这种方式。为达到所需的饱和度，应加入固体硫酸胺的量，可查表或由下式计算而得：,X：1L溶液需加人固体（NH4 )2SO4 的质量（g)； G：饱和溶液中的盐含量，0时为515，20为513； A：常数，0时为0.27， 20为0.29。,,,2.盐析方法和注意事项,1）分级盐析法,注意：试验用提取物的浓度应与生产时一致； 在高盐浓度下，有的生物活性物质的活力会受到抑制。,,2）重复盐析法：用较低的盐饱和度多次重复盐析。 3）反抽提法：先共沉淀，再用稀盐溶去杂蛋白。,,3）盐析注意事项,沉淀反应在缓冲溶液中进行； 盐析完全需要一定时间； 能否多次盐析靠试验确定； 盐析后应及时脱盐（常用透析）。,防止非均态出现； 防止低温增溶（少数在0-10）； 注意分离方法与介质的密度和黏度的关系。,,脱盐的方法,,四、盐析方法的应用,盐析法由于成本低，操作安全简单，对许多生物活性物质具有很好的稳定作用，常用于蛋白质、酶、多肽、多糖、核酸等物质的初级分离。,,硫酸铵分级盐析法粗提胸腺素工艺流程,硫酸铵分级盐析分离血浆中主要蛋白质操作流程,2019/8/24,29,可编辑,,第二节 有机溶剂沉淀法,向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。,优点： 产品更纯净；易分离；分辨能力比盐析法高；沉淀不用脱盐。 缺点： 易使蛋白质变性；需在低温下进行；易燃易爆；成本高，有一定毒性。,,A 降低溶剂介电常数（介电常数D有机 D水） ，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了酶、蛋白质、核酸等带电粒子之间的作用力，因相互吸引而聚合沉淀。 B 破坏水化膜：由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏水化层，降低蛋白质分子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白质沉淀。 C 相反力：疏水基团暴露并与有机溶剂疏水基团结合形成疏水层。,一、有机溶剂沉淀法基本原理（p174）,,有机溶剂沉淀法机理,降低介电常数 破坏水化膜,,,1、有机溶剂种类及用量,选择原则： 水溶性要好（与水无限混溶） 介电常数要小 致变性作用要小 毒性要小、挥发性适中,用量计算：,,2、溶液pH值： 目标蛋白与杂质带有相同的电荷，一般pI附近 3、温度：（预冷） 低温防止变性，有利于提高收率（溶解度下降）；（有机溶剂溶于水放热） 4、无机盐含量: 离子强度低有利于沉淀，0.010.05mol/L 5、金属离子助沉淀作用： Ca2+、Zn2+等多价阳离子。 6、样品浓度: 0.52% 稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小 浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低,举例：固体发酵生产-淀粉酶的提取工艺研究 -淀粉酶（米曲霉）菌体 + 水 过滤 水抽提清液 加乙醇（70%）搅拌 -淀粉酶,* pH影响 收率% 酶活 收率 酶活 6.5 pH * 适宜的pH 5.6 6.0,* 温度影响 收率% 酶活 酶活 收率 10 20 T * 适宜的温度10 20 ,,有机溶剂沉淀实例,,第三节 其他沉淀方法,1.等电点沉淀 调节体系pH值，使两性电解质的溶解度下降，析出的操作称为等电点沉淀。 原理： 蛋白质是两性电解质，当溶液pH值处于等电点时，分子表面净电荷为0，双电层破坏和水化膜变薄，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。,,等电点沉淀法只适用在等电点时溶解度很低的两性生化物质，如酪蛋白。,,操作时的注意事项： （1）由于无机离子的影响，蛋白质的等电点通常会发生“漂移”，阳-高，阴-低 （2）溶质的稳定性 （3）由于在等电点附近，溶质仍然有一定的溶解度，等电点沉淀法往往不能获得高的回收率，因此等电点沉淀法通常与盐析、有机溶剂沉淀法联合使用。,,2、成盐沉淀法 金属离子沉淀、有机酸类复合盐沉淀 3、亲和沉淀 加入载体-配基复合物 4、高分子聚合物沉淀法 PEG、Dextron、PVPP等。 5、表面活性剂沉淀法,,几种主要沉淀方法比较,,各种沉淀方法应用范围,盐析法：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。 等电点沉淀法：用于氨基酸、蛋白质等两性物质的沉淀。但单独应用较少，多与其它方法结合使用。 非离子多聚体沉淀法：用于分离生物大分子。 生成盐复合物沉淀：用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。 选择性沉淀（热变性或酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。,,固体有两种状态：结晶和无定形 结晶：析出速度慢，溶质分子有足够时间进行排列，粒子排列有规则 无定形固体：析出速度快，粒子排列无规则 结晶的概念： 溶液中的溶质在一定条件下，因分子有规则的排列而结合成晶体。 特征：晶体的化学成分均一，具有各种对称的晶体，离子和分子在空间晶格的结点上呈规则的排列.,第四节 结 晶,,典型的晶体结构,,只有同类分子或离子才能排列成晶体，因此结晶过程有良好的选择性。 通过结晶，溶液中大部分的杂质会留在母液中，再通过过滤、洗涤，可以得到纯度较高的晶体。 结晶过程具有成本低、设备简单、操作方便，广泛应用于氨基酸、有机酸、抗生素、维生素、核酸等产品的精制。,结晶操作的特点,,结晶包括三个过程： 过饱和溶液的形成； 晶核的形成； 晶体的生长。,溶液达到过饱和是结晶的前提，过饱和度是结晶的推动力。,一、结晶过程,饱和溶液 过饱和溶液,,饱和曲线和过饱和曲线,,二、过饱和溶液的形成方法,(1)溶剂蒸发法 (2)温度诱导法 (3)盐析结晶法 (4)透析结晶法 (5)有机溶剂结晶法,(6)等电点法 (7)微量扩散法 (8)化学反应结晶法 (9)共沸蒸馏结晶,,三、 提高晶体质量的途径,晶体质量包括三个方面的内容： 1、晶体大小 2、晶体形状 3、晶体纯度,,晶核的形成,晶核的形成是一个新相产生的过程，需要消 耗一定的能量才能形成固液界面。 (1) 初级成核:过饱和溶液中的自发成核现象（不稳定区）。 (2) 二次成核：向稍微过饱和溶液中加入晶种，会有新晶核产生 机理: 附着在晶体表面的微小晶体受到剪切作用，或碰撞而脱离晶体，形成新的晶核。,,在过饱和溶液中已有晶核形成或加入晶种后，以过饱和度为推动力，晶核或晶种将长大，这种现象称为晶体生长。晶体生长速度也是影响晶体产品粒度大小的一个重要因素。如果晶核形成速度大大超过晶体生长速度，则过饱和度主要用来生成新的晶核，因而得到细小的晶体，甚至无定形；如果晶体生长速度超过晶核形成速度，则得到粗大而均匀的晶体。,晶体的生长,,1、影响晶体大小的因素,（1）过饱和度低 过饱和度高成核速度大于晶体生长的速度（细小） 过饱和度低成核速度小于晶体生长的速度（粗大） （2）冷却的速度缓慢 快速冷却能达到较高的饱和度，得到细小晶体 缓慢冷却能达到较低的饱和度，得到粗大晶体 （3）搅拌速度-适当 适当搅拌加快扩撒，提高晶体长大的速度， 搅拌过快，则愈快愈逾小 （4）晶种-控制晶体形状、大小和均匀度,,2、影响晶体形状的因素： 过饱和度、改变溶剂体