细胞信号转导的技术方法.ppt

细胞信号转导的技术方法,蛋白激酶磷酸化及其活性测定,蛋白激酶磷酸化的检测,裂解培养的细胞获得裂解上清 以免疫共沉淀法获得蛋白激酶 SDS-PAGE 再加入蛋白激酶磷酸化特异性抗体 以Phospho Ab-HRP Western 化学发光检测试剂盒测定蛋白激酶的磷酸化程度。,经典蛋白激酶活性分析实验流程,以免疫共沉淀法获得蛋白激酶 加入该激酶底物和32-ATP，激酶使底物磷酸化 放射自显影，确定磷酸化条带,以免疫共沉淀法获得蛋白激酶 加入该激酶底物，激酶使底物磷酸化 再加入底物磷酸化特异性抗体 以Phospho Ab-HRP Western 化学发光检测试剂盒测定底物的磷酸化程度，进而推出蛋白激酶活性,非放射性蛋白激酶活性分析实验流程,较传统激酶活性测定方法的优点,无需接触放射性物质 敏感度高：可以检测到每个磷酸化分子 特异性：利用磷酸化特异性抗体可以进行位点特异性分析 信噪比高 低背景 系统完整：提供一整套直接从细胞裂解液中测试酶活的试剂 节约时间：由几天降到几分钟,Dynamic processes of p38 activation by LPS in RAW cells,Effect of individual MAPK pathways on PRAK activity in intact cells,Control Aniso. Arsenite TNF,-80kDa -47kDa -39kDa,-80kDa -47kDa,kDa 97.4- 68.0- 43.9- 29.0- 18.4- 14.3-,Control Aniso. Arsenite TNF,A,B,The major kinases of p38 and p38,P38 MAP Kinase Pathway,蛋白磷酸化位点分析及其功能鉴定,Phosphopeptide map of HSP27 phosphorylated by PRAK in vitro,T182 is the regulatory phosphorylation site of PRAK,DNA重组技术的应用 活性诱变体 无活性诱变体 结构与功能的研究,PCR primer,PCR primer,The relationship between the members of MAPK family,MAPK Dural Phosphorylation Sites L-12 Length * * hp38 DFGLARHTDD-EMTGYVATRWYRAPE 25 hP38b DFGLARQADE-EMTGYVATRWYRAPE 25 hp38g DFGLARQADS-EMTGYVVTRWYRAPE 25 hp38d DFGLARHADA-EMTGYVVTRWYRAPE 25 hJNK1 DFGLARTAGTS-FMMTPYVVTRYYRAPE 27 hJNK2 DFGLARTACTN-FMMTPYVVTRYYRAPE 27 hJNK3 DFGLARTAGTS-FMMTPYVVTRYYRAPE 27 hERK1 DFGLARIADPEHDH-TGFLTEYVATRWYRAPE 31 hERK2 DFGLARVADPDHDH-TGFLTEYVATRWYRAPE 31 hBMK1 DFGMARGLCTSPAEH-QYFMTEYVATRWYRAPE 32 YHOG1 DFGLARIQDP-QMTGYVSTRWYRAPE 25 YSMK1 DFGLARGIHAGFFKCHS-TVQPHITNYVATRWYRAPE 36 YMPK1 DFGLARGYSENPVEN-SQFLTEYVATRWYRAPE 32 YKSS1 DFGLARCLASSSDSRET-LVGFMTEYVATRWYRAPE 35 YFUS3 DFGLARIIDESAADNSEPTGQQSGMTEYVATRWYRAPE 38 domain VII VIII,Loop-12(T-Loop) sequence of MAP kinases,Construction of p38 loop-12 to ERK like structure,p38 .DFGLARHTDDE-MTGYVATRWYRAPE. p38(E) .DFGLARHTDDE-MTEYVATRWYRAPE. p38(6+) .DFGLARHTDDEHDHTGFMTGYVATRWYRAPE. p38(6+E) .DFGLARHTDDEHDHTGFMTEYVATRWYRAPE. p38(VAP) .DFGLARVADPE-MTGYVATRWYRAPE. p38(DL) .DFGLARHTDDD-LTGYVATRWYRAPE. p38(VAPD6+LE) .DFGLARVADPDHDHTGFLTEYVATRWYRAPE. ERK2 .DFGLARVADPDHDHTGFLTEYVATRWYRAPE.,MAPK,MKK,Substrates,Loop-12 is a key structure to determine the selection of substrate,(.TXY.) -,病毒技术对于揭示细胞信号通路的作用 腺病毒 逆转录病毒,细胞信号分子特异性抑制剂的应用,几种MAPK通路抑制剂的化学结构示意图:,O,NH2,OCH3,O,PD98059,HN,N,S,O,F,CH3,N,OH,N,F,N,H N,SB202190,SB203580,CH=CH,CH=CH,OH,OCH3,OH,OCH3,O,O,Curcumin,Effects of SB203580 and PD98059 on endogenous PRAK activity,细胞信号分子的荧光标记,LPS EGF Control,LPS、UV刺激心肌细胞共聚焦显微镜大体扫描,LPS,Control,UV,细胞信号分子的三维结构分析,蛋白质三维结构分析对于揭示信号分子的功能的作用,蛋白质与蛋白质相互作用的研究,SH3,SH2,Kinase,Src,蛋白激酶结构域,1、蛋白质结合实验,2、免疫共沉淀实验,2、FRET 和 BRET,与信号分子相互作用蛋白质分子的相互作用,酵母双杂合系统,Identification of MEF2C as a substrate for p38,图12.1 白细胞的渗出过程,噬菌体展示技术,报告基因技术 研究细胞信号转导通路通过转录因子对基因启动子转录活性的影响。,p38 is involved in the enhancement of TNF- promoter transactivity,Induction of c-Jun through MEF2C phosphorylation by p38,蛋白质与核酸相互作用技术 研究细胞内蛋白质尤其是转录因子与特定核酸序列的相互作用。,EMSA,对细胞内信号分子的干预技术 研究细胞内蛋白质尤其是转录因子与特定核酸序列的相互作用。,反义核酸技术的应用,RNAi,RNAi,Figure 1. Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA. Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization of 4-cell stage embryos. (A) Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe. (B) Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA (purple staining). (C) Embryo from parent injected with purified mex-3 antisense RNA. These embryos (and the parent animals) retain mex-3 mRNA, although levels may be somewhat less than wild type. (D) Late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3