《CR与DNA测序》PPT课件.ppt

知识体系,PCR技术,简史,原理,反应体系,技术特点,结果检测,测序技术 原理,衍生技术,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,C C A C T G G,G G T G A C C,A G G T A C T G,T C C A T G A C,T C C A T G A C,A G G T A C T G,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,+,母链DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,参与DNA复制的物质,底物(substrate): dNTP 加入 聚合酶(polymerase): DNA聚合酶 分离 模板(template) : DNA母链 提取 引物(primer): 人工合成 其他的酶和蛋白质因子 Mg2+, PCR仪,Part I 聚合酶链反应 （Polymerase chain reaction, PCR）,一、PCR技术简史 PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适的条件：摸板DNA 、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、合适的缓冲体系，以及DNA变性、复性及延伸的温度与时间。,第一节 常规PCR技术,提高效率的思路,双链,单链,循环,DNA聚合酶,仪器改进,高温,低温,PCR的改进与完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺点是： Klenow酶不耐高温， 90会变性失活，每次循环都需 要重新添加。 引物链延伸反应在37下进行，容易发生模板和引物 之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的 DNA片段不均一。,这种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致聚合酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。,1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。 1988年Saiki 等从一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。 此酶具有以下特点：,耐高温，在70下反应2h后其残留活性大于原来的90%， 在93下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95下反应 2h后其残留活性是原来的40%。 在热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶。 大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度 (2.0Kb)。,由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。,二、PCR技术的基本原理,类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：,1、基本原理,退火（annealing）（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，将温度降至引物的Tm值左右或以下（55左右），引物与模板DNA单链的互补序列配对结合，形成杂交链。,变性（denature）：模板DNA经加热至95左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。,延伸(extension)：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。,以上三步为一个循环，约需24分钟，每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次，大约23小时后，新生DNA片段理论上可达到2n-1个分子拷贝。,PCR反应的基本原理示意图,3 TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAGGATCTATCCAACGGCTAGGCATTT 5 5 ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 3,变性（950C，30s）,3TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAGGATCTATCCAACGGCTAGGCATTT5,5 ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATCCTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 3,退火（450C550C，30s 1min）,5ataagcccgaaaggt3,3 aacggctaggcattt5,TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT,ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA,5 ataagcccgaaaggttcg,tccaacggctaggcattt 5,延伸（720C，1 几分钟）,TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT,ataagcccgaaaggttcgttGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA,ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA,TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCtatccaacggctaggcattt,循环 25 30,5,3,5,3,目的DNA扩增106-7倍,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,目的片段？,1、标准的PCR反应体系 （50100ul）,三、PCR反应体系与反应条件,10缓冲液 1/10体积 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各1u mol/L 模板DNA 1 02 1 05 拷贝 Taq DNA聚合酶 1 5u Mg2+ 1.5mmol/L 双蒸水 至50100ul,2、PCR引物设计,PCR反应中有两条引物，即5端引物和3引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5端引物与位于待扩增片段5端上游的一小段DNA序列相同；3端引物与位于待扩增片段3端的一小段DNA序列互补。,TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT,ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA,5 ataagcccgaaaggttcg,tccaacggctaggcattt 5,5,3,5,3,基准,引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 引物内部不应出现互补序列。 两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 端的互补重叠。,引物设计的基本原则：,引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。 引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。 引物的5 端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。,几种常见引物设计缺陷,引物设计软件,Primer Premier5.0 （自动搜索）* Oligo6 （引物评价） Vector NTI Suit DNAsis Omiga DNAstar Primer3 （在线服务）,3、模板的制备,PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。 模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。,标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。,4、PCR反应条件的控制,PCR反应的缓冲液 提供合适的酸碱度与某些离子 镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L 底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，20200umol/L TaqDNA聚合酶 2.5U（100ul） 引物 浓度一般为0.1 0.5umol/L,反应温度和循环次数 变性温度和时间 95，30s 退火温度和时间 低于引物Tm值5 左右，一般在4555 延伸温度和时间 72，1min/kb（10kb内） Tm值=4(G+C) 2(A+T),循环次数 一般为25 30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。,四、PCR反应特点,PCR反应的特异性决定因素为： 引物与模板DNA特异正确的结合；（关键） 碱基配对原则； Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； 靶基因的特异性与保守性。,1、特异性强,2、灵敏度高,PCR产物的生成量是以指数级增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在细菌学中最小检出率为3个细菌。,3、简便、快速,不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。,4、对标本的纯度要求低,五、PCR扩增产物的分析,1、凝胶电泳分析 琼脂糖凝胶电泳: 通常应用12%的琼脂糖凝胶，供检测用。 聚丙烯酰胺凝胶电泳：610%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。,紫外线/灯下观察结果,594bp,600bp,2652bp,800bp,50bp,350bp,M 1 2 3,HCMV PCR产物电泳分析结果,PCR扩增结果,9 8 7 6 5 4 3 2 1,467bp,205bp,2、酶切分析 3、分子杂交 4、核酸序列分析,酶切结果,酶切结果,第二节 常用的PCR衍生技术,（1）逆转录 所谓逆转录，是指以RNA为模板，利用宿主细胞中4种dNTP为原料在引物的3端以5 3方向合成与RNA互补的DNA链的过程，此过程与中心法则相反，故称为逆转录（reverse transcription）。在逆转录过程中以RNA指导的DNA聚合酶称为逆转录酶（reverse transcriptnase）。实际上，逆转录并非转录，而是一种复制形式，必须有引物存在才能完成。,1. 逆转录PCR （ reverse transcription PCR, RT-PCR）,（2）逆转录酶,1970年Temin在Rous肉瘤病毒、Baltimore在白血病病毒中各自发现了逆转录酶，以后发现所有RNA肿瘤病毒中都含有逆转录酶。逆转录酶是逆转录病毒RNA编码的，是多功能酶： 具有RNA指导的DNA聚合酶活性，能和其它DNA聚合酶一样，沿5 3方向合成DNA，并需要引物提供3-OH ；,具有RNA酶H（RNaseH）活性，能特异性水解RNA-DNA杂交体上的RNA； 具有DNA指导的DNA聚合酶活性，以逆转录合成的单链DNA为模板合成互补DNA链。 逆转录酶对DNA没有3 5外切酶活性，因此它没有校对功能，错误率相对较高。,细胞总RNA的检测,1. Total RNA extracted from 293 transfected with pAd-CMV-E6/E7 2. Total RNA extracted from 293 transfected with pAd-K14-E6/E7,3. RT-PCR的反应体系,逆转录体系,逆转录反应在420C进行1h 后，加热至950C5min，灭活逆转录酶。取2 l反应产物，按DNA为模板的PCR反应步骤，进行扩增反应。, HPV-16 E6/E7在转录水平的RT-PCR检测结果,1. Marker ：100bp DNA Marker ; 2. RT-PCR 产物：E6/E7基因; 3. 阴性对照 RT-PCR鉴定pAd-CMV-E6/E7 转染的293细胞中E6/E7的表达,2 . 巢式PCR 先用一对外侧引物扩增含目的基因的大片段，再用内侧引物以大片段为模板扩增获取目的基因。筑巢PCR可以提高PCR的效率和特异性。适于模板含量较低的样本。,目的片段,第一轮PCR,第二轮PCR,3. 多重PCR 在一次反应中加入多对引物，由于每一对引物与模板DNA的不同片段相结合，因而扩增片段长短不同。由此可检测是否存在某些基因片段的缺失或突变。,片段1,片段2,DNA甲基化是由DNA甲基转移酶催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（mC）的一种反应。在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位点。它在基因组中呈不均匀分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的区域，在哺乳动物中mC约占C总量的27。,4. 甲基化特异性PCR,基本原理是用亚硫酸氢钠处理基因组DNA，未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，然后用3对特异性的引物对所测基因的同一核苷酸序列进行扩增。扩增产物用DNA琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描观察分析结果。,针对扩增的DNA甲基化区域，一般需要设计三条引物：正常序列引物、甲基化对应引物以及DNA序列修饰引物。通过三组PCR，判断DNA序列中甲基化的存在与否。,5. 原位PCR,在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点。在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列。, 固定组织或细胞,蛋白酶K消化处理,PCR扩增：原位PCR仪,杂交,显微镜观察结果,6. 定量PCR,广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。 狭义概念的定量PCR技术（严格意义的定量PCR技术）是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果(扩增效率为零)。,实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。, 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种： 荧光探针和荧光染料,TaqMan荧光探针： PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。,在PCR反应的退火过程中，荧光探针便会和模板杂交。进一步在PCR反应的延伸过程中， Taq酶的53外切酶活性可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光物质发出荧光。 从而荧光监测系统可接收到荧光信号。即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。,SYBR荧光染料： 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。,扩增曲线：4个阶段, Ct值（循环阈值，Cycle threshold）：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数,荧光域值（threshold）：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：荧光信号开始由本底信号进入指数增长阶段的拐点时的荧光信号强度。,荧光阈值,循环次数, Ct值与起始模板的关系,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。,Part II DNA测序技术,DNA的测序是分子生物学研究中非常重要和关键的内容。对DNA一级结构的研究，有助于探索基因结构与功能、基因与疾病关系，进而推动生命科学研究获得质的飞跃。测定基因组的全部核苷酸序列、阅读和分析全部遗传信息，正是人类基因组计划（human genome project, HGP)的最主要目标之一。,将DNA片段用荧光等分析仪，测出DNA序列碱基排列顺序。 DNA 序列测定方法： 1. Sanger的双脱氧法：A/T/G/C四个反应。 2.化学降解法：G反应；G+T反应；T+C反应和C反应。 3.自动测序法。,DNA 测序的主要方法有两种，即双脱氧链终止法（Sanger 法、酶促法）和化学裂解法（Maxam-Gelbert 法）。二者均依赖于高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。不管是酶促法还是化学法，都是分为4个反应体系进行测序反应，寡核苷酸链分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基。4种反应体系的寡核苷酸链产物，进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影后，读出待测DNA的连续序列。,一、 Sanger 双脱氧链终止法,（一）原理(单链) DNA链中的核苷酸是以3，5-磷酸二酯键相连接，合成DNA所用的底物是2-脱氧核苷三磷酸（dNTP），在Sanger 双脱氧链终止法中被掺入了2，3-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP),当ddNTP位于链延伸末端时, 由于它没有3- OH，,不能再与其它的脱氧核苷酸形成3,5-磷酸二酯键，DNA合成便在此处终止，如果此处掺入的是一个ddATP，则新生链的末端就是A，依次类推可以通过掺入ddTTP、 ddCTP、 ddGTP ，则新生链的末端为T、C或G，根据这个原理，Sanger与1977年建立了双脱氧链终止测序法。他本人也因此而获得了诺贝尔奖。,Sanger,双脱氧核苷三磷酸,互补链合成过程,以单链或双链DNA为模板，采用DNA引物引导新生DNA的合成，因此又称为引物合成法，或酶促引物合成法。主要是基于DNA聚合酶的催化特性：以DNA为模板，根据碱基配对的原则逐个将dNTP加到与模板结合的寡核苷酸引物的3-OH末端，形成正确的模板DNA互补链；能以dNTP作为底物，也能利用ddNTP作底物，将其掺入寡核苷酸链的3 末端而终止新生互补链的延伸。,如果在DNA的合成反应中，除了加入4种正常的脱氧核苷三磷酸（dNTP）外，再加入一种少量的2,3 ddNTP，那么多核苷酸链的延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，所以反应产物是一系列的长短不一的核苷酸链。 在4组独立的DNA合成反应中，分别加入4种不同的ddNTP，结果将生成4组核苷酸链，它们将分别（随机）终止于每一个A，每一个G，每一个C，每一个T的位置上。对这4组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列。,在测序反应中通常设置4个反应，各反应管中同时加入一种DNA模板和引物、DNA聚合酶I（失去5 3外切核酸酶活性）、其中一管中分别加入1种 ddNTP （ 如ddTTP、dTTP）以及4种dNTP（ dATP 、dCTP 、dGTP 、dTTP ），引物末端用放射性核素标记， ddTTP的比例很小（1:10），因此掺入的位点是随机的，经过适当的条件下温育，将会有不同长度的DNA片段合成。它们都具有相同的5末端，3末端都因掺入了ddTTP而以T结尾。在其它三管中同理加入相应的ddNTP。,Sanger双脱氧测序方法示意图,+G,+ddG,GATTCG,GATTC ddG,GATTCGAG,GATTCGA ddG,GG G,引物,电泳,双脱氧法测序原理示意图,几乎与双脱氧链终止法建立的同时，Maxam和Gilbert于1977年建立了一种以化学修饰为基础的DNA序列分析法，称为Maxam-Gilbert化学修饰法。,二、Maxam-Gilbert化学修饰法,（一） Maxam-Gilbert化学修饰法原理,基本原理：用化学试剂处理具末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割，由此产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混和物，经凝胶电泳按大小分离和放射自显影，便可根据X线片底板上显示相应带谱，直接读出待测DNA片段的核苷酸顺序。,化学修饰法的待测DNA片段有的是双链，有的是单链DNA。在进行碱基特异性化学切割反应前，首先对待测DNA片段作末端标记，使其末端(5端或者是3端)带上放射标记。如果待测DNA是双链，必须使其形成末端标记的单链。,对末端标记的DNA链进行化学断裂反应分两步进行： 第一步是在4个反应管中分别以肼、硫酸二甲酯(DMS)和甲酸对特定的碱基进行化学修饰； 第二步是以六氢吡啶取代被修饰的碱基并将DNA链断裂。,DNA化学裂解反应体系 反应体系 碱基修饰试剂 碱基修饰反应 主链断裂试剂 断裂点 G 硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化 六氢吡啶 G G+A 甲酸 脱嘌呤作用 六氢吡啶 G和A C+T 肼 嘧啶开环 六氢吡啶 C和T C 肼