《XY0905沉淀》PPT课件.ppt

第四章 沉淀,Precipitation（沉淀） Electrical double layer（双电层） 与结晶的区别？,主要内容：,知识点：盐析法，等电点沉淀法，有机溶剂 沉淀法，选择性变性沉淀法，金属离子沉淀法。 重点：上述几种沉淀方法的概念、原理及其适用范围；盐析法的影响因素对沉淀效果的影响，并能根据实际情况予以灵活应用和选择。 难点：常用沉淀方法的灵活运用。,概述,沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。采用沉淀的手段，主要是为了通过沉淀达到浓缩的目的，或者通过沉淀，固液分相后，除去留在液相或沉积在固体中的非必要成分；其次，沉淀可以将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。 沉淀方法用于分离纯化是有选择性的，即有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分。,沉淀法,生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些就是溶液的各种理化参数。任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。 沉淀法就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，从而将溶液中的欲提取的成分和其它成分分开的技术。 沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。,操作方式,沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。 操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤通常按三步进行： 首先加入沉淀剂， 沉淀剂的陈化，促进粒子生长； 为离心或过滤，收集沉淀物。 加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。,沉淀法的分类,根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为： （1）盐析法； （2）等电点沉淀法； （3）有机溶剂沉淀法； （4）非离子型聚合物沉淀法； （5）聚电解质沉淀法； （6）高价金属离子沉淀法等。 上述各种方法中，除第（3）种有机溶剂沉淀法也能适用于抗生素等小分子外，其他各种方法只适用蛋白质等大分子，故以下的讨论均限于蛋白质。,第一节 蛋白质表面特性,蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、构象以及分子周围的环境所决定。 蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。 一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。,蛋白质表面构成,蛋白质是两性高分子电解质（amphoteric polymer），主要由疏水性各不相同的20种氨基酸组成。在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势，使亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区构成。,蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域,沉淀屏障,1、蛋白质周围水化层（hydration shell)可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。 2、蛋白质分子间的静电排斥作用（存在双电层） 结论：实现蛋白质沉淀可通过降低蛋白质周围水化层和双电层厚度，降低蛋白质溶液的稳定性。,蛋白质胶体溶液的稳定性,蛋白质可以看作是一个表面分布有正、负电荷的球体，这种正、负电荷是由氨基和羧基的离子化形成的，换句话说，该球体是带有均衡电荷分布的胶体颗粒。因此，蛋白质的沉淀，实际上与胶体颗粒的凝聚和絮凝现象相似。 静电斥力 吸引力 蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离，因溶液是电中性的，水中应有等当量的反离子存在，蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。（凝聚）,蛋白表面的双电层（图1）,蛋白表面的双电层（图1）,吸引力,颗粒间的相互作用 颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。 Van der Waals 力 Keeson 引力（偶极力） Debye 引力 （诱导力） London 引力 （色散力）是最重要的一种引力，因为所有分子都是可以被极化的，所以它是普遍存在的。,离子强度与两颗粒间的作用能的关系图,DLVO理论,颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。在低离子强度时，颗粒距离处在中间状态，双电层斥力占优势，可看为一个凝聚的势垒；在高离子强度时，吸引力超过排斥力，相互间的总位能表现为吸引位能。 虽然这个理论所假定的条件并不完全适合于蛋白质分子，但该理论对于理解破坏蛋白质溶液的稳定性仍有很大帮助，同时还有助于针对具体蛋白质选择最合适的沉淀剂及技术。,第二节 盐析沉淀,概念,（1）、什么是盐析？蛋白质在高离子强度的溶 液中溶解度降低，发生沉淀的现象。 Cohn经验方程 （2）、电解质对蛋白质溶解度的影响。 盐溶(salting-in)：电解质浓度低时 盐析（salting-out)：电解质浓度高时,1、中性盐盐析法,早在1859年，中性盐盐析法就被用于从血液中分离蛋白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分级中使用，得到了比较满意的结果。 在蛋白质溶液中加入中性盐后会压缩扩散双电层、降低电位，即中性盐既会使蛋白质脱水，又会中和蛋白质所带电荷，使颗粒间的相互排斥力失去，在布朗运动的互相碰撞下，蛋白质分子结合成聚集物而沉淀析出。,2、盐析的机理,盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解蛋白质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏了蛋白表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下降； 盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降； 盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水分子的极化，使水活度降低。,盐析机理（图1）,盐析机理（图2）,3、Cohn方程,现在常用 Cohn经验式来表示蛋白质的溶解度与盐的浓度之间的关系（右上） 有时为简单计，也可以用浓度代替离子强度，则上式成为（右下）,Cohn方程讨论,常数Ks代表图中直线的斜率；代表截距，即当离子强度为零，也就是纯水中的假想溶解度的对数。 与盐的种类无关，但与温度、pH和蛋白质种类有关; 从一些实验结果表明，Ks与温度和PH无关，但与蛋白质和盐的种类有关。但这种变化不是很大，例如以硫酸铵作为沉淀剂时，Ks值对不同的蛋白质来说，其变化不会超过1倍。 组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易沉淀。 虽然Cohn公式能够描述盐析状态下蛋白质的溶解度，但它不能体现低盐浓度（盐溶状态）下蛋白质的溶解度。,蛋白质与离子强度关系图,4、用盐析法分离蛋白质的二种方法,（1）在一定的pH值及温度条件下，改变盐的浓度（即离子强度）达到沉淀的目的，称为“s”分级盐析法。（Ks盐析：固定pH, 温度，改变盐浓度离子强度） （2）在一定的离子强度下，改变溶液的pH值及温度，达到沉淀的目的，称为“”分级盐析法。（盐析：固定离子强度，改变pH及温度。）,5、盐析操作,硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂，因为：（1） 价廉 ；（2） 溶解度大，稳定蛋白质 ；（3）水解变酸；（4）高pH 释氨，腐蚀；（5）残留产品有影响。 硫酸铵的溶解度在030范围内变化很小 20时的饱和浓度约为4.05mol/L（543g/L），饱和溶液密度为(1.235kg/L） 。 用1L水制备硫酸铵的饱和溶液，需加入761g硫酸铵，饱和溶液体积为1.425L 。,加盐方式,采用硫酸铵进行盐析时可按二种方式加入： （1）直接加入固体(NH4)2SO4 粉末，工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高； （2）加入硫酸铵饱和溶液，在实验室和小规模生产中，或(NH4)2SO4 浓度不需太高时，可采用这种方式，它可防止溶液局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。,盐析沉淀图,不同蛋白质的溶解度曲线,溶解度曲线(a)和盐析分布曲线(b),6、影响因素,盐析行为随蛋白质的相对分子质量和立体结构而异，反映在Cohn方程中就是对和Ks的影响。 主要影响因素有：无机盐的种类、浓度；温度和PH,不同盐溶液中碳氧血红蛋白的S与I的关系（25）,()NaCl； ()KCl； ()MgSO4；()NH4)2SO4；()Na2SO4； ()K2SO4； ()柠檬酸三钠,阴阳离子盐析效果,阴离子盐析效果 ： 柠檬酸PO43- SO42- CH3COO- Cl- NO3-SCN- 阳离子盐析效果： NH4+ K+Na+ 高价阳离子,pH值和温度的影响,随pH 变化 （1）对数关系 （2）等电点附近有极小值 随温度变化 随温度升高减小，热促失水膜,值随pH值变化,左图表示对卵清蛋白（Ovalbumin）和碳氧血红蛋白进行盐析时，随pH的变化。由于代表溶解度的对数，故 变化一个单位，溶解度就变化 10倍。通常在等电点附近有极小值。两种蛋白质的相对溶解度会随pH而变化很大；例如从图 上可见， 当 pH从5变到6时，在一定盐浓度下，两种蛋白质溶解度之比的变化可达几千倍。,温度和PH对盐析曲线的影响,蛋白质起始浓度的影响,二次盐析,可利用二次（多次）盐析（也叫分段盐摩擦的方法，分离不同的蛋白质。,盐析注意事项：,（1）稳定pH 用磷酸缓冲液 （2）硫酸铵加入后体积变大 （3）选择饱和度 （4）分步盐析 （5）初始蛋白浓度,第三节 等电点沉淀法,概述,在低的离子强度下，调pH至等电点，使蛋白质所带净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，形成沉淀。本法适用于憎水性较强的蛋白质，例如酪蛋白 在等电点时能形成粗大的凝聚物。但对一些亲水性强的蛋白质。如明胶，则在低离子强度的溶液中，调 pH在等电点并不产生沉淀。 在调节等电点时，如果采用盐 酸、氢氧化钠等强酸强碱，要注意防止酶的失活或蛋白变性。为了使pH缓慢变动，也可用乙酸、碳酸等弱酸和碳酸钠等弱碱。,大豆蛋白的溶解度随pH的变化,特点,（1）适用于疏水性强的蛋白质 （2）中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。 （3）无机酸通常价格便宜，无毒 （4）蛋白质对低pH 敏感，易失活 等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联合使用，以提高其沉淀能力。,等电点沉淀实例,（1）从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI=8.9，可先于pH 3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质（pI=3.0）。工业生产胰岛素（ pI5.3 ）时，先调pH至8.0除去碱性蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质（同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果） 。 （2）碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：发酵液调pH 4.0后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。用pH 9.0的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液重新溶解，加入2040%饱和度的硫酸铵分级，离心收集的沉淀Tris-HCl缓冲液再次沉淀，即得较纯的碱性磷酸酯酶。,第四节 有机溶剂沉淀法,概述,酶、蛋白质、核酸、多糖类生化物质的水溶液中加入乙醇、丙酮等水溶性的有机溶剂，它们的溶解度会显著降低，从溶液中沉淀出来。有机溶剂沉淀的优点是：分辨率比盐析法高，溶剂容易除去并可以回收。缺点是易使酶变性。,原理,加入有机溶剂使溶液的介电常数减小，增加了酶、蛋白质、核酸等带电粒子之间的作用力，因相互吸引而聚合沉淀。有机溶剂的加入也使水的极性减小，使两性电解质在溶液中的溶解度降低。有机溶剂会降低蛋白质分子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白质沉淀。 （1）介电常数 （2）溶剂化（蛋白质结合水被取代） （3）疏水基团暴露并与有机溶剂疏水基团结合形成疏水层,有机溶剂沉淀原理图,操作注意事项,使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行，以减少蛋白质的变性。 所用的有机溶剂须预先冷却到-10-20； 有机溶剂要缓缓加入，防止溶液局部升温。 中性盐会增加蛋白质在有机溶液中的溶解度，溶液中的中性盐浓度越高，沉淀蛋白质所需要的有机溶剂浓度也越大。 常用的有机溶剂有乙醇、甲醇、丙酮等。,有机溶剂沉淀实例,第五节 金属离子沉淀,概述,金属离子在蛋白质分级沉淀上的应用可以追溯到1905年，当时已观察到了金属离子对蛋白质溶解度的影响，但是，真正的认识是后来从金属离子与纯血浆蛋白的特异相互作用的研究中得到的。实验利用低浓度的锌和钡与冷乙醇的浓度或用量来提高血浆分级分离的质量和选择性，并使溶剂分离蛋白质的操作更易控制，最后发展为用锌或其它金属离子完全取代乙醇。,机理,金属离子的沉淀作用是由于它们能与蛋白质分子中的特殊部位起反应造成的。例如锌易与組胺酸残基中咪唑基结合，使蛋白质的等电点转移，从而降低蛋白质的溶解度。 近年来对于金属离子沉淀蛋白质的概念有所扩大，这是因为有些蛋白质不能为游离的金属离子所沉淀，而是需要使用它们的双螯合物与基因工程的聚組胺酸肽段相结合，从而使蛋白质沉淀。,分类,一般可分三类： 能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的一些金属离子，如：Mn2+、Fe2+ 、Co2+、 Ni2+ 、u2+、 Zn2+ 、 Cd2+ ； 能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的一些金属离子，如：Ca2+ 、 Ba2+、 Mg2+ 、 Pb2+ ; 能与巯基化合物强烈结合的金属离子，如：g2+ 、 Ag2+ 、 Pb2+ 。 实际应用时，金属离子的浓度常为0.02mol/L。复合物中金属离子的去除，可用离子交换法或EDTA金属螯合剂。,第六节 亲和沉淀,原理,亲和沉淀是分离过程的一部分，但是其沉淀原理与通常的沉淀方法有很大的不同。 它是利用蛋白质与特定的生物合成分子（免疫配位体、基质、辅酶等）之间高度专一的相互作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术。 所以其沉淀原理不是依据蛋白质溶解度的差异，而是依据“吸附”有特殊蛋白质的聚合物的溶解度的大小。,优势,亲和过程提供了一个从复杂混合物中分离提取单一产品的有效方法。 初始阶段，将一个目标蛋白质与键合在可溶性载体上的亲合配位体络和形成沉淀； 所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，洗去可能存在的杂质； 用一种适当的试剂将目标蛋白质从配位体中离解出来。,第七节 应用,广泛用于各类蛋白质的初步提纯和浓缩，在某些情况下还可用于蛋白质的高度纯化。 盐析后，一般需进行后续的脱盐处理，才能进行后续的纯化操作。,1、利用蛋白质沉淀大规模提纯白蛋白与免疫球蛋白的工艺,2、柠檬酸的生产,柠檬酸生物技术是工业和学术界都感兴趣的领域，长期以来柠檬酸生产是发展工业生物技术并促使新老技术交接的驱动力之一。,标准沉淀法回收柠檬酸流程图,新工艺,我国从上世纪60年代就开始研究非钙盐法的提取工艺，近三、五年取得了实质性突破。根据行业科技交流刊物的报道，已进行过中试或生产规模试验的技术有三类： （1）是中国科学院和阜阳柠檬酸厂合作的“工业离子色谱法（ILCS）法”（离色法）； （2）另一种是江南大学的“连续变温逆流色谱分离法”（色谱法）； （3）还有天津科技大学的“吸附交换分离法”（吸交法）。,3、萃取-沉淀法提取分离茶多酚,茶多酚是一类富含于茶叶中，主要由表儿茶、表没食子儿茶素及它们的没食子酸酯类等