《chapter1蛋白质》PPT课件.ppt

第四节 蛋白质分子结构与功能的关系,一.蛋白质一级结构与功能的关系 研究蛋白质一级结构与功能的关系主要是：研究多肽链中不同部位的残基与生物功能的关系。 进行这方面的研究常用的方法有：同源蛋白质氨基酸序列相似性分析、氨基酸残基的化学修饰等。 例1 镰刀形贫血病(一种血红蛋白分子病) 患者血红细胞合成了一种不正常的血红蛋白（Hb-S, hemoglobin - sickle） 它与正常的血红蛋白（Hb-A）的差别：仅仅在于链的N-末端第6位残基发生了变化 （Hb-A）第6位残基是极性谷氨酸残基，（Hb-S）中换成了非极性的缬氨酸残基 使血红蛋白细胞收缩成镰刀形，输氧能力下降，易发生溶血(导致贫血) 这说明了蛋白质分子结构与功能关系的高度统一性,例2 一级结构的局部断裂与蛋白质的激活 体内的某些蛋白质分子初合成时，常带有抑制肽，呈无活性状态，称为蛋白质原.蛋白质原的部分肽链以特定的方式断裂后，才变为活性分子。 胰岛素的激活：胰岛素，在刚合成时，是一个比成熟的胰岛素分子大一倍多的单链多肽，称为前胰岛素原 前胰岛素原的N-末端有一段肽链，称为信号肽. 信号肽被切去，剩下的是胰岛素原。 胰岛素原比胰岛素分子多一段C肽，只有当C肽被切除后才成为有51个残基，分A、B两条链的胰岛素分子单体.,例3 血液凝固与氨基酸序列的局部断裂,在动物体内的某些生物化学过程中，蛋白质分子的部分肽链必须先按特定的方式断裂，然后才呈现生物活性。蛋白质分子的这一特性具有它的重要生物学意义。它是在生物进化过程中发展起来的，是蛋白质分于的结构与功能具有高度统一性的表现。,1.血液凝固的生物化学原理,血液凝固是一系列复杂的生物化学过程。这一过程的主要环节有二：一是血浆中的凝血酶原受到血浆和血小板中一些因子的激活而形成凝血酶(thrombin)；二是血浆中的纤维蛋白原在凝血酶的激活下转变为不溶性纤维蛋白(fibrin)网状结构，使血液变成凝胶。,凝血酶原是一种糖蛋白。在凝血酶原致活物的催化下，凝血酶原分子中的二个肽键(Arg274-Thr275和Arg323-Ile324）发生断裂，释放出分子量力32000的氨基末端片段形成有活性的凝血酶。 凝血酶由二条肽链通过一个二硫键交联而成，一条肽键（A链)含49个残基，另一条肽键含259个残基。,纤维蛋白原分子长46nm，分子量为340 000，属纤维状蛋白质。每一分子含6条肽链，这6条肽链两两相同，分三种类，分别称为链(含600个残基左右)、链(461个残基)和链(410个残基)。整个分子由对称的两部分组成，6条肽链的N末端部分集中在中间。纤维蛋白原分子共含29个二硫键，6条肽链由这些二硫键交联成一个整体分子。肽链的氨基酸之间有顺序同源现象。,纤维蛋白原一级结构示意图,纤维蛋白原转变为纤维蛋白的过程是在凝血酶的作用下，从二条链和二条链的N末端各断裂一个特定的肽键(Arg-Gly-)，释放出二个纤维肽A和二个纤维肽B。 A、B肽切除后，减少了蛋白质分子的负电荷，促进了纤维蛋白分子的直线聚合和侧向聚合，从而形成网状结构的纤维蛋白。电子显微镜观察表明，纤维蛋白单体的聚合是按1/2错位的方式进行的。,例4 同源蛋白质 同源蛋白质：指在不同生物体中实现同一功能或相似功能的蛋白质。同源蛋白中的一级结构中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称为不变残基；其他位置的氨基酸称可变残基.不同种属的可变残基有很大变化.可用于判断生物体间亲缘关系的远近. 例：细胞色素C（位于线粒体中） 60 个物种中，有 27 个位置上的氨基酸残基完全不变，是维持其构象中发挥特有功能所必要的部位，属于不变残基. 可变残基可能随着进化而变异，而且不同种属的细胞色素 C氨基酸差异数与种属之间的亲缘关系相关。亲缘关系越近，氨基酸差异少，反之则反（进化树）.,黄色： 不变残基（invariable residues） 蓝色 ： 保守氨基酸（conservative residues） 未标记：可变残基（variable residues）,二.蛋白质的构象与功能的关系 别构效应（allosteric effect）：又称变构效应，是指寡聚蛋白与配基结合，改变蛋白质构象，导致蛋白质生物活性改变的现象。 可分为同促效应（正协同性、负协同性）和异促效应。它是细胞内最简单的调节方式。 例：血红蛋白的别构效应 一个亚基与氧结合后，引起该亚基构象改变 进而引起另三个亚基的构象改变 整个分子构象改变 与氧的结合能力增加,第五节 蛋白质的分离、纯化和表征,一.蛋白质的分子大小 蛋白质是分子量很大的生物分子，相对分子质量大于6 000。最高可达40 000 000（烟草花叶病毒）。 蛋白质相对分子质量的测定方法 1.根据化学组成测定最低相对分子质量 此法首先利用化学分析方法测定蛋白质分子中某一特殊成分的百分含量 然后，假定蛋白质分子中该成分只有一个分子或原子，据其百分含量可计算出最低相对分子质量： 最低相对分子质量（已知成分的相对分子、原子质量）/已知成分的百分含量 如果蛋白质分子中所含已知成分不是一个单位，则真实相对分子质量等于最小相对分子质量的倍数。 2.沉降速度法（超离心法） 在60 00080 000r/min的超速离心力作用下，蛋白质分子会沿旋转中心向外周方向移动 用光学方法（依折射率变化）测定界面移动的速度即为蛋白质的离心沉降速度 蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关,沉降系数是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用s表示。 一个s单位，为110-13秒,用S表示 相对分子质量越大，s值越大 蛋白质的沉降系数：1200S 由沉降系数s可根据斯维得贝格Svedberg方程(P296)计算蛋白质分子的相对分子质量。 3.凝胶过滤法(原理见P303) 凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构。如交联葡聚糖，商品名：Sephadex 一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外 洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大 只能测定球形pro，不能测定线形的或与凝胶能发生吸附作用的pro,测得几种标准分子量蛋白质的洗脱体积Ve 以相对分子质量对数（logMr）对Ve作图，得出标准直线 再测出未知样品洗脱体积Ve 从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量,4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 SDS:十二烷基硫酸钠，变性剂 普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比（净电荷、形状、大小） 用SDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理 蛋白质变性（肽链伸展）并与SDS结合，形成SDS-蛋白质复合物 不同蛋白质分子的均带负电（SDS带负电）；且荷质比相同（每2分子AA残基结合1分子SDS） 不同蛋白质分子具有相似的构象（雪茄烟状） 用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的相对迁移率（样品迁移距离/前沿染料迁移距离,R ）作图(lgMr=a-bR) 测出待测样品的迁移率 从标准曲线上查出样品的相对分子质量,影响迁移率的主要因素 凝胶的分子筛效应对长短不同的棒形分子会 产 生不同的阻力主要因素 凝胶的浓度和交联度 同一电泳条件下，分子小，受阻小，游动快，迁移率大。相对分子质量大者，迁移率小 优点：快速，样品用量少，可同时测几个样品 缺点：误差大，约为10（误差主要来源于迁移距离的测量误差） 此方法只能测得 亚基肽链的相对分子质量 二. 蛋白质的两性离解和电泳现象 蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时(Isoelectric point， pI)，蛋白质的溶解度最小（可用于pro的纯化），在电场中不移动。 在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳(Protein Electrophoresis)。,蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。,三.蛋白质的胶体性质 由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 四.蛋白质的沉淀作用 蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。 改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质。 在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。,1.可逆沉淀 (1)在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。 (2) 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。 (3)可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法（短时间）等。 盐溶（salting in）：指中性盐增加蛋白质溶解度的现象。 盐析：指向蛋白质溶液中加入大量的中性盐，使蛋白质脱去水化层而聚集的 可逆性沉淀的现象。 2.不可逆沉淀 (1)在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。 (2)由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 (3)如加热沉淀（制豆腐）、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀（豆浆解毒）和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。 五.蛋白质的变性 蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性.,变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。,六.蛋白质的紫外吸收 大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。 利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。 七.蛋白质的颜色反应 1.双缩脲反应： 两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成粉红色的复合物 含有两个或两个以上肽键的化合物，能发生同样的反应 肽键的反应，肽键越多颜色越深 受蛋白质特异性影响小 蛋白质定量测定；测定蛋白质水解程度,2.米伦氏反应 酪氨酸的显色反应（酚羟基反应） 米伦试剂为硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物 蛋白溶液中，加入米伦试剂，产生白色沉淀，加热后变成红色 3.乙醛酸反应 在蛋白质溶液中加入HCOCOOH，将浓硫酸沿管壁缓慢加入，不使相混，在液面交界处，即有紫色环形成 色氨酸的反应（吲哚环的反应） 鉴定蛋白质中是否含有色氨酸 明胶中不含色氨酸 4.坂口反应 精氨酸的反应（胍基的反应） 精氨酸与-萘酚在碱性次氯酸钠（或次溴酸钠）溶液中发生反应，产生红色产物 鉴定蛋白质中是否含有精氨酸 定量测定精氨酸,5.茚三酮反应 灵敏度不高 6.黄蛋白反应 浓硝酸与酪氨酸、色氨酸的反应 生成黄色化合物 指甲、皮肤、毛发 7.考马斯亮蓝G-250 本身为红色，与蛋白质反应呈蓝色 与蛋白的亲和力强，灵敏度高（595nm,11000微克/毫升）,本章小节,蛋白质的生物学作用：功能蛋白、结构蛋白 蛋白质的组成（元素组成、化学组成）及蛋白质含量的测定 二十种氨基酸的结构、分类及名称（三字缩写符） 氨