（生物医学工程专业论文）DNA甲基化检测基因芯片方法的研究.pdf

a b s t r a c t t h e s i s t i t l e ：r e s e a r c h o i l m i c r o a r r a y n l 劬o d s f o r d e t e c t i o n o f d n a m e t h y l a t i o n g r a d u a t es t u d e n tn a m e ：q i a 0w a n q i o n g s u p e r v i s o rn a m e ：l uz u h o n g ( p r o f e s s o o u n i ，e 鹦i t yn a m e ：s o u t h e a s tu n i v e r s i t y a b e r r a n td n am e t h y l a t i o no fc p gs i t e so r i e l 3a p p e a r si nt h ep r o m o t e ra n dt h ef i r s te x o n r e g i o n so fg e n e s 1 1 l i sa b e l t a l rm e t h y l a t i o ni s 锄i m p o r t a n tc a u s et oa c t i v a t eo ri n a c t i v a t eg e n e s t h ee x p r e s s i o no ft h o s eg e n e si sg r a d i l a l l yr e g , w d e da so n eo fm a i nr e a s o n sl e a d i n gt oh u m a n c a r c i n o m a s 。t h i st h e s i ss u m m a r i z e st h ee x i s t e n t m e t h y l a t i 0 1 1d e t e c t i o nm e t h o d sb a s e do n m i c r o n r r a y , m a k e sf u r t h e rr e s e a r c ho nt h eh i g h - t h r o u g h p u td e t e c t i o na b i l i t yo fm i c r o a r r a ya n d d e v e l o p st h r e ek i n d so f m e t h o d sf o rd a t e c t i n no f d n am c t h y l a t i o n d n am e t h y l a t i o nd e t e c t i m e t h o d sb a s e do i lf l u o r e s c e n c eh y b r i d i z a t i o n a nm i c r o a r r a y m e t h o df o rm e t h y l a t i o np a t t e r nq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fi g f b p 7g e n ew a sd e v e l o p e d s i xg r o u p s o f p r o b e sw e r ed e s i g n e dt oc o v e r1 8c p gs i t e si nt h ep r o m o t e ro fi g f b p 7g e n e ，a n d1 5p a i r so f b r e a s tt u m o rt i 嚣u e sw e r ed e t e c t e d i tw a sf o u n dt h a tt h em e t h y l a t i o nl e v e lf o ra l lt h ec p gs i t e so f a l is a m p l w e r em o r et h a n8 5 t h ef e s u i t sw c r ef u r t h e rv a l l a s t e db yb i s u f i t en u c l e o t i d e s e q u e n c i n 晷a l s o ，am i c m a r r a y - b a s e dm c t h y l a t i o nd e t e c t i o nm e t h o du s i n gd u a lc o l o rf l u o r e s c e n c e h y b r i d i z a t i o nw a sd e v e l o p e d 2 7s a m p l e sw e r es u c c e s s f u l l ye v a l u a t e da n df u r t h e rv a l i d a t e db y b i n t en u c l e o t i d e s e q u e n c i n g r a s u l t s s h o w e dt h a tt h i sm e t h o dh a v e p o t e n t i a l s f o r h i g h - t h r o u g h p u td e t e c t i o no f m e t h y l m i o ns t a t u s d n a m e t h y l a t i o n d e t e c t i o nm e t h o d sb a s e do nm e m b r a n e h y b r i d i z a t i o n a n d c h e m i l u m i n e s c e n td e t e c t i o n t h i sr e s e a r c ha c h i e v e dh i g h s e n s i t i v i t ym e t h y l a t i o nd e t e c t i o no f b r e a s tt u m o rt i s s u e s ，c o m b i n i n gt h ea d v a n t a g e so fb o t hm e m b r a n ea n dd i g o x i g e n i n d e t e c t i o n s e n s i t i v i t yw a sa n a l y z e db ym i ) 【i n gp o s i t i v ea n dn e g a t i v ep c rp r o d u c t s r e s u l t ss h o w e dt h a tt h i s m e t h o dw a sr e l i a b l ea n ds e n s i t i v e d n am e t h y l a t i o nd e t e c t i o nm e t h o d sb a s e do nr o l l i n gc i r c l ea m p l i f i c a t i o n0 t o a l r c ai sa r e c e n t l yd e v e l o p e di s o t h e r m a ln u c l e i ca c i d sa m p l i f i c a t i o nm e t h o d w h i c hi sm o r es i t e - s p e c i f i c s e n s i t i v e e 历c i e n ta n de a s i l yo p e r a t e dt h a no t h e rd n aa m p l i f i c a t i o nm e t h o d s 1 1 t i sp a p e r e v a l u a t e dt h ep o s s i b i l i t yo fr c aa p p l i e di nm u l t i - g e n em e t h y l a t i o n d e t e c t i o n , s u c c e s s f u l l y d e t e c t e dp o s i t i v ea n dn e g a t i v ec l o n e so f l g f b p 7g e n e ，a n dp r o s p e c t e da ne a s ym i c r o a r r a y m e t h o d t oa n a l y z em e t h y l a t i o ns t a t u s r e s u l t ss h o w e dt h a tr c ac o u l db es u c c e s s f u l l yu s e di nm e t h y l a t i o n d e t e c t i o n , a n dh a v ep o t e n t i a l sf o rh i g h - t h r o u g h p u ta n a l y s i so f m u l t i - g e n e k e y w o r d s ：m e t h y l a t i o n ，m i c r o a r r a y , r c a , f l u o r e s c e n c eh y b r i d i z a t i o n , c h e m i l u m i n e s c e n td e t e c t i o n , m e m b r a n e h y b r i d i z a t i o n 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研触躲牲日期：埠，阳 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位 论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人 电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论 文被查阅和借阅，可以公布( 包括以电子信息形式刊登) 论文的全部或中、英文 摘要等部分内容。论文的公布( 包括以电子信息形式刊登) 授权东南大学研究生 院办理。 第一章绪论 第一章绪论 1 1 哺乳动物d n a 甲基化 d n a 甲基化是一种遗传外修饰，在基因突变、基因表达调控、细胞增殖、分化，发育、 基因印记等方面都起着重要作用，与肿瘤发生和演进有密切联系i l 】。人类基因组中约4 5 0 0 0 个c p o 岛，其中很多c p o 位点的异常甲基化与癌症的发生发展密切相关。因此。d n a 甲 基化已成为目前的研究热点。 1 1 1d n a 甲基化的概述 d n a 甲基化是哺乳动物基因组的显著特征。它是在d n a 甲基转移酶的作用下埘，以s - 腺 苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到胞嘧啶的5 位置上( 图l - 1 ) 。启动子区域的甲基化对基 因的表达有明显的抑制作用，在哺乳动物d n a 甲基化的修饰对胚胎发育、x 染色体失活和基 因印记等起了重要的调节作用，同时甲基化的异常可导致一些疾病和肿瘤的发生。d n a 甲 基化与组蛋白去乙酰化之间协同关系的发现为研究d n a 甲基化抑制基因表达的机制提供了 重要的线索。 n o h c y t o s i n e b j tn e t h y l t r a s f e r e s e n 争 $ - e a e n o s y l n e t k io n i n eo h 5 一n e t h y l c l r t i s i n e 图l - l 甲基化原理图 哺乳动物细胞中5 - 甲基胞嘧啶( s m c ) 主要存在于5 - c p g 这样的二核苷酸回纹结构中 ( 约为9 0 ) 。c p o 二核苷酸在人类基因组中占1 0 ，其中7 0 8 0 呈甲基化状态可称 为甲基化的c p 6 位点。非甲基化c p g 二核苷酸区域仅占基因组的l 2 ，这些c p g 二 核苷酸以较大的密度分布于基因的5 端，称为c p o 岛。c p o 岛一般为几百至一千碱基长， 通常位于基因的5 端启动区，也可延伸至基因的外显子区。现今已知在所有管家基因和一 些组织特异基因的5 端调控区均有c p g 岛，估计哺乳动物的一半基因中含有c p o 岛，人类 基因组中约有4 5 0 0 0 个c p o 岛1 3 】。除了雌性动物的非活性x 染色体基因，a u j 和l 顺序 及印记基因的5 c p g 岛以外，其他所有常染色体基因的5 c p o 岛都是非甲基化的，非甲基 化基因处于转录活动状态，而甲基化基因处于失转录状态。5 c p o 岛甲基化导致相应的基因 失转录的机制主要有直接机制和间接机制。直接机制是指c p o 岛甲基化干扰t f ( 转录因子) 0 n 东南大学硕士学位论文 与调控区d n a 的结合。间接机制包括甲基化d n a 结合蛋白与甲基化d n a 特异结合而抑制 基因转录及d n a 甲基化改变染色质结构，阻碍t f 与d n a 结合从而抑制转录。虽然d n a 甲基化主要影响基因表达，但5 甲基胞嘧啶引起高频率突变及其有关基因的改变，也是致 癌机制的一个重要方面。d n a5 c p g 岛的甲基化通过直接间接机制导致基因表达异常，而 胞嘧啶的高甲基化又可引起基因组的不稳定，这些都表明d n a 5 c p o 岛甲基化在基因表达、 肿瘤发生过程中起着相当重要的作用。 1 1 2d n a 甲基化的机制 d n a 甲基化包括重新甲基化( d o v o ) 和维持甲基化( m a i n t e 咖c e ，”，重新甲基化是在原 来没有甲基化的d n a 双链上进行甲基化的过程，它是在d n a 甲基转移酶d n m t 3 a 和d n m t 3 b 的协同作用下完成的p 】。该过程主要发生在胚胎完全去甲基化后的植入期。维持甲基化是指甲 基化d n a 复制后形成的半甲基化的d n a , 在d n m t l 的作用下根据亲链上的甲基化位点进行 相应的甲基化修饰的过程，重新甲基化完成后就由维持甲基化来维持其稳定的甲基化状态 d n m t i 是由b 鳓f 等于1 9 8 8 年首先克隆的，在体外能够催化转甲基反应，直到1 9 9 6 年l e i 等 人第一次提出d n m t l 自身不能解释体内的重新甲基化，因为缺乏d n m t l 这种酶的鼠胚胎干细 胞仍然具有使逆转录病毒甲基化的能力。1 9 9 8 年。o k a n o 等人通过对e s t 进行同源序列比较 发现了两个新的蛋白。d n m t 3 a 和d n - m t 3 b 6 1 , 这两个基因都突变的胚胎干细胞不能使逆转录病 毒重新甲基化，虽然单个基因的突变仍然表现出一定的甲基化活性，但这足以表明d n m t 3 a 和 d m m 3 b 具有协同重新甲基化的作用1 7 j ，而细胞内没有突变的d r a n t l 却没能表现重新甲基化的 作用。 去甲基化包括非特异性去甲基化和特异性去甲基化。w e i s s 等i s 在研究体外d n a 去甲 基化的实验中发现。该过程是在去甲基化酶的作用下利用核苷酸切除和连接步骤而进行的核 酸替代过程，并受r n a 分子的调节。非特异性去甲基化发生在胚胎早期的植入期前，在这个 时期。整个基因组发生了普遍的非特异的去甲基化过程。特异性的去甲基化具有组织和阶段 的特异性，最早发生在植入期，大部分基因经历了重新甲基化过程，只有c p g 岛未被甲基化大 概是通过这种特异性去甲基化实现的，这一阶段的去甲基化酶活性的激活受锚定在c p c 岛特 异位点的蛋白的影响，由反式作用因子识别基因附近的顺式调节元件来调控，已经证实在几乎 所有c p g 岛内都有s p l 序列，这个顺式作用元件可能对防止c p o 岛的重新甲基化起着必要 的作用。 1 1 3d n a 甲基化的功能意义 原核生物d n a 的甲基化可保护其不被噬菌体# 噬1 9 1 ，对于真核生物，虽然在果蝇、线虫和 酵母中没有检测到甲基化的d n a ，但在高等真核生物中发现d n a 甲基化具有重要的转录调 节作用。主要表现在以下几个方面： 1 甲基化在胚胎发育过程中的作用1 1 0 1胚胎在发育和分化过程中，d n a 序列并没有改 - 2 第一章绪论 变 但在特异性组织和器官中基因表达有特定的模式，研究表明这种遗传外改变与d n a 甲基 化有关。d n a 甲基化对脊椎动物发展过程中基因表达的协同性有着重要意义湘同类型同一 种类的细胞个体之间存在高度保守的甲基化模式，而在同一器官不同类型的细胞中甲基化模 式是不同的。甲基化模式建立于配予形成期，并在发展过程中发生变化，任何特定细胞d n a 甲基化模式的建立都是甲基化、去甲基化动态变化的过程。来自双亲的配予受精后不久，配 子d n a 中的甲基几乎完全消失。这种全部去甲基化状态维持到整个囊胚期阶段。大约在植入 期，发生重新甲基化 大多数的c p o 被重新修饰，但一些c p g 岛仍保持非甲基化状态，可能是在 这些岛的部位发生了特异性去甲基化反应1 1 1 。在组织特异性分化过程中。个别基因还发生了 局部的去甲基化，使细胞特异性表达的基因在相应组织中处于非甲基化状态。 2 甲基化在遗传印记中的作用i t 2 , 1 3 】遗传印记是一种违反了盂德尔遗传规则的遗传基 因，在母源的染色体中只表达h 1 9 ，在父源的染色体中只表达i g f 2 。l g f 2 位于h 1 9 的上游，它 们共同使用下游的一个增强子。在父源的染色体上，由于h 1 9 的启动子处于甲基化状态。所以 h 1 9 不表达，但母源的染色体上i g r 2 的启动子并未发生甲基化，t h o r v a l d s e n 等人通过对鼠 h 1 9 上游碱基缺失实验的研究发现，在h 1 9 上游存在一个几千个碱基的印记控制区0 c r ) 该 区域能与一种c t c f ( 鸡c - m y c 基因、溶菌酶基因转录抑制因子) 蛋白结合，在母源的染色体 上，c t c f 蛋白与i c r 结合，从而抑制了下游的增强子对l g f 2 的调控作用，使i g f 2 不表达，但在 父源的染色体，i c r 处于甲基化状态，不与c t c f 结合，所以i g r 2 的表达不受影响。遗传印记 中d n a 甲基化在启动子区起了直接抑制基因转录的作用，而在印记控制区起到了间接的调 控作用。来自双亲的同源染色体或等位基因存在着功能上的差异，所以正常的胚胎发育需要 分别来自雌性和雄性双亲的一套染色体。 3 甲基化与x 染色体失活 1 4 , 1 在雌性哺乳动物，剂量补偿是通过一条x 染色体的失活 来实现的，由x 染色体失活中心o ( i c ) 控制。x i c 位于x q l 3 ，在该区域发现两个与x 染色体失活 有关的基因x i s t 和t s i x 。x i s t 是失活中心上最早发现的一个候选基因，无开放的阅读框架 ( o r d ，其转录产物d n a 长1 5 k b ，能将整个x 染色体覆盖，使其失活。t s 政则是一个反译d n a , 也无o r f , 起始于x i s t 反意义链下游的1 5 k b ，长4 0 地跨越整个x i s t 。x i s t 与t s i x 的动态表达 在x 染色体失活中起着重要作用，x 染色体失活前) ( 缸和t s i x 是共同表达的 ) ( 染色体失活开 始后，t s i t 停止表达，x i s t r a n a 水平上调。失活的x 染色体一旦建立，t s i x 的表达将永远受到抑 制，t s i x r n a 只有在将来活化的染色体上有表达。在哺乳动物，这种反义调节可能代表着较为 普遍的长距离转录调控机制，但是什么机制调节着x i s t 和t s i x 的表达，以及x i s t 是如何抑制x 染色体表达的详细机制仍不清楚。通过对失活和有活性的x 染色体d n a 甲基化状态的研究 发现，在失活的染色体上，大部分基因的c p g 是甲基化的，在活化的染色体是非甲基化的, x i s t 基因的5 末端，在活化的染色体上是过甲基化的。活化染色体与非活化染色体甲基化状态的 不同只代表着甲基化在x 染色体失活中的一种晚发现象，它对失活状态的维持具有重要作用， 但没有始动作用 - 3 东南大学硕士学位论文 4 甲基化与肿瘤肿瘤组织中存在着基因组普遍的低甲基化和局部区域的过甲基化现 象，导致这种现象的原因还不清楚，但已经发现肿瘤相关基因的异常甲基化在肿瘤形成上起着 重要的作用( 表1 1 ) 。 装闲 i l 键凌棼5 一a z a ( 1 r 濑活 钟燧韵潮璃闱 n 1 5 h “ p 1 6 “4 p 7 3l p 5 3 舆 l ； 鹱曝 i t ： r i ， w n 孵雅拘糊肇溺 1 , t 1 1 1 镬v mh i p l ”, ii i m t m l | 乏璃中存雩受i 蹲教褒受体 瓣强索麓体 m 弧i m n m t m 即l e r i w ! 卵m 哆i n h d , i t m r ) h i c1 i l l y p t m , - f l l y | a h l li nc a m r r l i k li 野馥缎、苏锯鞠激l i 孥l 造瓤壤鼠匙矬辨辔 鬻绝袭绻，皱撩黪鞫喜i 宅谗够辨霏 辫也嘧 终粒矗蕊缱 税f q 臌母绷魄罐 羲噤癌 舞透蠼缨昭魃 虢瓣癌、结蓊辔，如血锈和葵它黪蝣 蘸鲥晚缝 巍峨镛 结肠嶷肠瓣 p e t t l ? - j e g l _ l t , r 练禽撬 r a l t ir e l i n o i l w - h lr p v e | g t + - a r f i n k 4 l 弼转p 5 3 求警i 浸溯转移拘制鹱因 e 干：i 妊”r i ni 懿鼢毋fj襞辍蛩嚣癌、中捩瓣痊。镡驻秘熟宅转壤 4 h m p - 3 f k 料i r i k ha w l a l h l m l d m e - 3 ) 结肠、褥榉麟神罐 m b i l ：l x 4 4 d 、t 盼堑游翰热瘟物终瑗蓼冈 h m i j t i 镪翳矗鹈整、臀痉和f 裔内髓l n i 癌 l ；胡。p ii ( 湘i t l 汹py i - i n m + i k + n t 虢媲熙辔嚣瓣键鞠行键 b r c a ii d n a 搦魏修复襞躲癌l 特别楚俄渡镶翱髓弹辔i 耀攀辔 0 6 【，、1 。rl i ) 、 搦伤修艇i 赫，络精、潍神缓和潍院瘤 照它罄| 霹 d a i ，k i ( 赍镑1 饩秦涛野的捌r h 细胞湃巴箍和肺癌 t s i 一ll f i h n , m 1 m l m r m i n 1 m 、( ；e 1 表1 i 肿瘤中启动子c i g 岛发生过甲基化而失活的肿瘤相关基因 肿瘤抑制基因( p 1 6 i n k 4 a ) 、肿瘤转移抑制基因( 阢a d l l e r i n ) 、激素受体基因( 雌激素受体 基因、视黄酸受体基因) 、d n a 修复基因( 错配修复基因h m l h i 、谷胱甘肽s 转移酶基因g s t 3 ) - 4 - 第一章绪论 和血管生成抑制基因( 血小板反应蛋白基因) 等启动子区的过甲基化都可使相应基因表达降 低或不表达，进而促进肿瘤的形成。p 1 6 i n k 4 a 1 1 编码一种依赖于细胞周期蛋白的蛋白激酶抑 制剂。在控制细胞周期中具有重要作用，在肺癌、乳腺癌和结肠癌【1 6 】都发现了p 1 6 启动子的过 甲基化和p 1 6 蛋白表达异常。肿瘤转移抑制基因e - c a d h e r i n 是一种细胞粘附分子，可以抑制 肿瘤细胞的浸润和转移，在乳腺癌、前列腺癌和胃癌的细胞系以及肝癌和胃癌的组织中都发 现e - c a d h e r i n 启动子区过甲基化现象, y o s h i u r a 等用甲基化抑制剂处理e - c a d 表达阴性的细胞 系，使e - c a d 恢复了表达。在肿瘤形成过程中，这些遗传外改变与遗传性改变( d n a 序列改变) 相互作用，最终形成肿瘤。例如，h m l h l 【l q 、p 1 6 i n k 4 a 、g s t 3 的过甲基化引起的表达异常可 分别通过微卫星不稳定性增加、细胞绕过m 0 期和0 2 对d n a 的损伤增加等导致遗传不稳 定性增加，最终通过遗传性改变导致肿瘤的发生。一些在家族性癌中由于基因突变导致功能 异常的基因。在散发性肿瘤中常表现为甲基化的异常。 甲基化的胞嘧啶容易自发脱掉氨基变成胸腺嘧啶。因而导致基因突变率增加。单核苷酸 多态和基因突变中常见到c p g t p g 的转变 例如，皮肤癌中常见到c t 或c c - - , t t 突变， 日光暴露的细胞甲基化的c 形成嘧啶二聚体的机率比非甲基化的高5 1 5 倍。另外，随着年 龄的增长，c p g 岛的甲基化不断增加，使得年龄成为一些肿瘤发病的危险因素。 1 2 基因芯片 基因芯片，也叫d n a 芯片或者叫d n a 微阵列1 1 9 】。基因芯片技术是上个世纪9 0 年代创 建并发展起来的一项分子生物学技术，虽然只有短短的数十年时间，基因芯片技术已经已经 得到了突飞猛进的发展。它集分子生物学，微电子、微加工技术于一身，把生命科学中不连 续的分析过程集成在硅片或者玻片的为载体的微型生物化学分析系统里以达到完成对细胞、 蛋白质、基因及生物组分的准确、快速和大信息量检测。 1 a 1 基因芯片的原理 基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法是一致的，都是应用已知核酸序列作为 探针与互补的靶核苷酸序列杂交。通过随后的信号检测进行定性与定量分析。基因芯片利用 光导化学合成、照相平板印刷以及固相表面化学合成等技术。在固相表面合成成千上万个寡 核苷酸探针，或将液相合成的探针由微阵列器或机器人点样于尼龙膜或硅片上，再与经放射 性同位素或荧光物质标记的d n a 或c d n a 杂交，通过放射自显影或激光共聚焦显微镜扫描 后。对杂交结果进行检测和分析，以此反映目的材料中有关基因的各种情况。其显著特点在 于高度的并行性、多样性、微型化和自动化。 1 2 2 基因芯片的分类 芯片种类较多，制备方法也不尽相同，但基本上可分为两大类：一类是原位合成；一种 是直接点样。原位合成适用于寡核苷酸；直接点样多用于大片段d n a ，有时也用于寡核苷 - 5 一 东南大学硕士学位论文 酸，甚至m r n a 。原位合成有三种途径，一是光刻法；二是压电打印法；三是分子印章法。 与原位合成法比较点样法较简单，只需将预先制备好的寡核苷酸或e d n a 等样品通过自动 点样装置点于经特殊处理的玻离片或其它材料上即可。 1 光引导原位合成法( l i g h t - d i r e c t e di ns i t us y n t h e s i s ) 寡聚核苷酸原位光刻合成技术 是由a f f y m e t r i x 公司开发的，采用的技术原理是在合成碱基单体的5 。羟基末端连上一个光敏 保护基。合成的第一步是利用光照射使羟基端脱保护，然后一个5 端保护的核苷酸单体连接 上去，这个过程反复进行直至合成完毕。使用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出高密度 的阵列，在合成循环中探针数目呈指数增长。某一含n 个核苷酸的寡聚核苷酸，通过4 x n 个化学步骤能合成出4 n 个可能结构。例如：一个完整的十核苷酸通过3 2 个化学步骤，8 个 小时可能合成6 5 。5 3 6 个探针。 2 原位喷印合成( i n k - j e tp r i m i n g ) 该法主要是美国加州l c y e p h a r m a c e u t i c a l s 公司和 p r o t o g e n 公司所采用，其原理类似于目前的喷墨打印机，合成原理与传统的寡聚核苷酸固相 合成原理一致，合成过程为：合成前以与光引导原位合成类似的方式对基片进行预处理，使 其带有反应活性基团。同时，将某种碱基的试剂放入打印墨盒内，由计算机根据预定的程序 在x y z 方向自动控制打印喷头在芯片基片上移动，并根据芯片不同位点探针序列需要，将特 定的碱基合成前体试剂喷印到特定位点，喷印上去的试剂原位发生偶联反应得以固定。在洗 脱和去保护后，另一轮寡聚核苷酸的延伸就可继续进行，依据同样的方式将需要连接的分子 喷印到预定的位点进行后续的偶联反应。由于脱保护方式为酸去保护，所以每步延伸的合成 产率超过常规的多孔玻璃( c o n t r o l l e dp o r eg l a s s ，c p g ) 合成法，高达9 9 0 , 6 ，合成的探针长度 可以达到4 0 - 5 0 个碱基。类似地重复此操作可以在特定位点按照每个位点预定的序列合成 出大量的寡聚核苷酸探针。该法由于不需要与载体直接接触，故有很高的效率，但制造工艺 还不太成熟。 3 分子印章原位合成( m o l e c u l a r s t a m p si ns t i u s y n t h e s i s ) 该技术是由东南大学吴健雄 实验室开发研制的，分子印章技术与上述两种方法在合成原理上相同，区别仅在于该技术利 用预先制作的印章将特定的合成试剂以印章印刷的方式分配到支持物的特定区域。后续反应 步骤类似与压电打印原位合成技术。分子印章类似于传统的印章，其表面依照阵列合成的要 求制作成凹凸不平的平面，依此将不同的核酸或多肽合成试剂按印到芯片片基特定位点进而 进行合成反应。选择适当的合成顺序、设计凹凸位点不同的印章即可在支持物上原位合成出 位置和序列预定的寡核苷酸或寡肽阵列。从这一点上讲，分子印章原位合成技术与压电打印 原位合成技术更为相似。分子印章除了可用于原位合成外还可以点样方式制作微点阵芯片 例如已有入将分子印章技术用于蛋白微点阵芯片的制作。 4 点样法点样法是将合成好的探针、c d n a 或基因组d n a 通过特定的高速点样机 器手直接点在芯片上。采用的机器人有一套计算机控制三维移动装置；多个打印愤印针的 打印喷印头；一个减震底座，上面可放内盛探针的多孔板和多个芯片。根据需要还可以有 温度和湿度控制装置；针洗涤装置。打印，喷印针将探针从多孔板取出宣接打印或喷印于芯 片上。直接打印时针头与芯片接触，而在喷印时针头与芯片保持一定距离。打印法的优点是 探针密度高，通常1 平方厘米可打印2 , 5 0 0 个探针。缺点是定量准确性及重现性不好。打印 针易堵塞且使用寿命有限。喷印法的优点是定量准确，重现性好，使用寿命长。缺点是喷印 - 6 - 第一章绪论 的斑点大，因此探针密度低，通常只有l 平方厘米4 0 0 点。国外有多家实验室和公司研究开 发打印或喷印设备，目前有一些已经商品化。 5 电子芯片 电子芯片是由美国n a n o g e n 公司开发的。这种芯片为带有阳电荷的硅芯 片、芯片经熟氧化，制成l m m ( 1 m m 的阵列，每个阵列含多个微电极，在每个电极上通过氮 化硅沉积和蚀刻制各出样品池。将连接亲和素的琼脂糖覆盖在电极上，在电场作用下生物素 标记的探针即可结合在特定电极上。电子芯片的最大特点是杂交速度快，可大大缩短分析时 间。制备复杂、成本高是其不足 6 三维芯片 三维芯片是由美国的p a c k a r d 、摩托罗拉、a r g o n n e 国家实验室三家机构 与俄罗斯e n g e l h a r d t 分子生物学研究所合作开发的一种芯片技术。三维生物芯片的实质上是 一块显微镜载玻片，其上有1 0 ，0 0 0 个微小聚乙烯酰胺凝胶条，每个凝胶条可用于靶d n a ， r n a 和蛋白质的分析。先把已知化合物加在凝胶条上，用3 c m 长的微型玻璃毛细管将待测 样品加到凝胶条上。每个毛细管能把小到0 2 n l 的体积打到凝胶上。以上几家机构构合作研 究的生物芯片系统具有其它生物芯片系统不具有的几个优点。一是凝胶条的三维化能加进更 多的已知物质，增加了敏感性。二是可以在芯片上同时进行扩增与检测。一般情况下，必须 在微量多孔板上先进行p c r 扩增，再把样品加到芯片上，因此需要进行许多额外操作。本 芯片所用凝胶体积很小，使p c r 扩增体系的体积减小1 , 0 0 0 倍( 总体积约纳升级) ，从而节约 了每个反应所用的p c r 酶( 约减少1 0 0 倍k 三是以三维构象形式存在的蛋白和基因材料可 以其天然状态在凝胶条上分析，可以进行免疫测定，受体一配体研究和蛋白组分析。 7 流过式芯片( f l o w - t h r uc h i p ) g e n el o g i c 正在开发一种在芯片片基上剖成格栅状微 通道，g e n el o g i c 设计及合成特定的寡核苷酸探针，结合于微通道内芯片的特定区域。从待 测样品中分离d n a 或r n a 并对其进行荧光标记，然后，该样品流过芯片。固定的寡核苷 酸探针捕获与之相互补的核酸，采用g e n el o g i c s 信号检测系统分析结果。流通式芯片用于 高通量分析已知基因的变化，其特点在于( 1 ) 敏感性高：由于寡核苷酸吸咐表面的增大，流 过式芯片可监测稀有基因表达的变化；( 2 ) 速度快：微通道加速了杂交反应，减少了每次检 测所需时间；( 3 ) 价格降低：由于采用了特殊的共价化学技术将寡核苷酸吸咐于微通道内， 使每一种流过式芯片可反复使用多次，从而使其成本降低。 1 2 3 基因芯片的应用 1 基因表达水平研究将不同条件下从某生物体中转录出来的所有m r n a 标记成探 针后，再与代表它所有基因而制成的寡核苷酸阵列杂交，通过分析杂交信号，就可知道不同 情况下每个基因是否己表达及表达水平如何。据估计，一个由l o 万个不同c d n a 构成的微 阵列可通过一次杂交对整个人类基因组的表达情况进行检测。l a s h k a r i 和d e r i s i 等曾用包含 所有酿酒酵母基因在内的d n a 微阵列，观察了整个酵母基因组在发酵到呼吸反应过程中各 基因表达的动态变化刚。 2 核酸检测利用基因芯片技术可以使核酸检测实现高通量、自动化。目前，常见的 利用基因芯片技术的几种核酸检测单核苷酸多态性( s n p ) 和点突变的检颡4 和甲基化的检测。 l e e 等用含有1 3 5 万个探针的d n a 微阵列分析了人线粒体基因组d n a 多态性变化。该组探 - 东南大学硕士学位论文 针互补于人线粒体基因组全长1 6 6 k b ，将之与不同个体来源的基因组d n a 杂交，发现人线 粒体基因组存在1 6 4 9 3 位t c 突变、1 6 2 2 3 位c t 等多位点突变的d n a 多态性特征。 3 基因诊断和新药开发将从正常人的基因组中分离出d n a 并与基因芯片杂交得到 的标准图谱与从病人基因组中分离的d n a 并与基因芯片杂交得到的病变图谱进行比较、分 析，就能得出病变的基因信息并进行基因治疗。目前基因芯片在疾病诊断方面已有产品面市。 美国a m j m e u i x 公司生产的检测逆转录酶基因的h i v 芯片，可以判断被检者是否携带艾滋 病毒；还有检测p 5 3 基因是否突变来判断癌症的芯片，以及诊断有无药物代谢缺乏症的细胞 色素p 4 5 0 芯片等。 4 基因测序 s a n g e r 、g i l b e r t 、m a x a n 等一些传统的d n a 测序方法对人类基因组测 序这样浩大的工程已显得捉襟见肘，而d n a 芯片快速测定d n a 序列却有着非常大的潜力。 h a c i a 等用含有4 8 万个寡核苷酸的高密度微阵列分析了黑猩猩和人b r c a i 基因序列差异， 结果发现在外显子1 1 约3 4 k b 长度范围内的核酸序列同源性在8 3 5 - - 9 8 2 之问，高度证 明了两者在进化上的相似性1 2 ”。 5 遗传病相关基因的定位随着人类基因组计划的完成，许多遗传病的相关基因被相 继定位，如肥胖病、老年疾呆症、精神分裂症、孤独症等。基因定位蕴含着巨大的商业价值。 通过制作基因定位型基因芯片，使生物学家可通过遗传病家谱进行研究，从而将某一遗传病 和基因和一种或多种多态性联系在一起，从而在染色体上的合适位点定位出遗传病相关基 因。近几年，诸如a f f y m e t r i x 等公司己研制出可检测大量遗传病基因相关点突变及s n p 的 基因芯片，从而对亲代与子代的遗传重组有重要的价值，有望创造更精确的第三代遗传图谱。 6 基因文库图谱绘制通过确定重复基因的程度，基因芯片已用来以基因组文库进行图 谱绘制。基因文库中的每个克隆的所用化学反应均一个反应管，可以快速平行地对多克隆进 行图谱绘制，每人每天可对几百个克隆进行基因图谱绘制。 7 寻找新基因 定量检测大量基因表达水平在阐述基因功能、探索疾病原因及机理、 发现可能的诊断及治疗等方面是很有价值的。基因芯片技术在发现新基因及分析各个基因在 不同时空表达方面是一项十分有用的技术，它具有样品用量少，自动化程度高等优点，便于 大量筛选新基因。目前，大量人类e s t s 给c d n a 微阵列提供了丰富的资源，数据库中4 0 0 0 0 0 个e s t s 代表了所有人类基因，成千上万的e s t s 微阵列将为人类基因表达研究提供强有力 的分析工具这将大大地加速人类基因组的功能分析 微阵列芯片技术的出现为d n a 甲基化的高通量检测提供了技术平台。但是，与基因表 达、s n p 等生物芯片的研究进展相比，d n a 甲基化检测芯片的研究和开发是近几年刚刚开 始。为实现甲基化的高通量分析，全世界多个实验室做出了大量的研究工作，多数研究是基 于生物芯片杂交技术。t h h u a n g 等( 1 9 9 9 ) 2 2 1 发展了差异甲基化杂交法( d i f f e r e n t i a l m e t h y l a t i o nh y b r i d i z a t i o n , d m h ) ，该方法包括三部分，c p g 岛微阵列( c g im i c r o a r r a y ) 的 8 第一章绪论 构建、靶序列的制备及微阵列杂交。c p g 岛微阵列( c g im i c r o a r r a y ) 的构建是采用c p g 岛 甲基化结合蛋白亲合柱获取基因组c p a 岛片断，然后将其克隆到载体挑取克隆，建立c p g 岛文库，然后进一步做成芯片。2 0 0 2 年，g i t a n 等人报导了用于甲基化特异的寡核苷酸芯 片( m e t h y l a t i o ns p e c i f i co l i g o n u c l e o t i d e ，m s o ) ，该芯片由多对寡核苷酸探针构成，然后与 测序引物扩增出来的靶序列杂交。近年来，h o u 等利用寡核苷酸基因芯片技术来检测多个甲 基化位点，在构建芯片时首先设计组合式探针，这种组合式探针包含基因某一区段所有的甲 基化模式因此不需要测序就可以判断该基因的甲基化模式。 1 3 滚环扩增 滚环扩增( r o l l i n g c i r c l e a m p l i f i c a t i o n , r c a ) 是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法。 这种方法不仅可以直接扩增d n a 和r n a ，还可以实现对靶核酸的信号放大，灵敏度达到一 个拷贝的核酸分子，因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力剀。 1 3 1 滚环扩增的原理、 滚环扩增技术是借鉴病原生物体的滚环复制d n a 的方式而提出的，许多病毒d n a 的 复制以及f 因子在接合( c o n u f g a t i o n ) 转移时其d n a 的复制都采用这种方式o ”。在以这种机 制进行的复制中，亲代双链d n a 的一条链在d n a 复制起点处被切开，其5 端游离出来， 这样，d n a 聚合酶就可以将脱氧核糖核苷酸聚合在y - o h 端。当复制向前进行时，亲代 d n a 上被切断的5 端继续游离下来，并且很快被单链结合蛋白所结合由于5 端从环上向 下解链的同时伴有环状双链d n a 环绕其轴不断的旋转，而且以3 - o h 端为引物的d n a 生 长链不断地以另一条环状d n a 链为模板向前延伸，因此称为滚环复制。简单的说，滚环扩 增就是一种在特殊聚合酶作用下以短的单链环状d n a 为模板的等温滚环复制过程。 1 3 2 滚环扩增的分类和特性 滚环扩增过程起始于一条线性d n a 单链引物和环形模板单链的杂交，之后引物在d n a 聚合酶的作用下被延伸，形成一条具有大量重复序列且与环状模板链完全互补的线状单链。 d n a 的延伸可以一直进行下去，因此产生的d n a 链是亲代d n a 单位长度的许多倍1 2 6 j ( 图 i - 2 a ) 。这一过程具有线性动力学特征，在很短的时间( 1 h ) 内很容易形成长度数千倍于原 环状模板链的互补线状单链，文献通常称其为线性滚环扩增( 1 i n e a r r c a ) 。线性r c a 的产 物序列在长度上连续分布，覆盖范围较广，从凝胶电泳图上看呈一条广泛的弥散带( 图 i - 3 a ) 。由于其单链扩增特性，扩增产物一端可以始终连接在固相支持物的引物上，因此， 线性r c a 非常适台固相形式的微阵列局部特异信号的检测，即使同时分析检测许多目标分 子也不会互相干扰。 。 9 东南大学硕士学