DNA甲基化与个体年龄的相关性研究进展

DNA 甲基化与个体年龄的相关性研究进展 DNA 甲基化与个体年龄的相关性研究进展 【摘 要】年龄推断在法医实践中占有重要的地位。分子生物学的巨大进展使得人们借助于生物学标记推断个体年龄成为可能。作为表观遗传学重要组成部分的 dna 甲基化，在机体生长、发育、衰老的过程中存在着动态变化过程通过检测 dna 甲基化改变，有望构建与之相关的年龄变化模式，用以推断个体年龄。本文着重介绍 dna 甲基化水平的改变与个体年龄的相关性及其在判断个体年龄方面的前景。【关键词】法医物证； dna 甲基化；年龄推断；生物体衰老【中图分类号】d9l9 2【文献标识码】 a【文章编号】 1007 9297(2006)04 0284 05当前在法医学实践中，对个体年龄的推断主要是依据人类学方法测量骨骼、牙齿等一些具有年龄相关性的检材并根据相关模型进行计算。分子生物学的飞速发展，开拓了人们的视野。借助于分子生物学理论和方法在细胞水平、分子水平发现一些可能与年龄相关的遗传学改变，如 dna 损伤修复能力、端粒的长度、线粒体片段的缺失、 dna 甲基化水平、 b 一半乳糖苷酶活性以及基因表达谱等。 lll dna 甲基化是表观遗传学 (epigenetics)的重要组成部分 ，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用在衰老的过程中某些细胞会发生年龄相关的变化， 121 例如某个 cpg 岛的从头甲基化会关闭一个基因，使这个基因相关的生理功能丧失：同样。甲基化的丢失也会激活正常情况下沉默的基因造成不恰当的异位表达(ectopic expression)。必须指出，表观遗传研究丝毫没有降低遗传学或基因组学的重要性，恰恰相反，表观遗传学是在以孟德尔式遗传为理论基石的经典遗传学和分子遗传学母体中孕育的专门研究基因功能实现的一种特殊机制的遗传学分支学科。认识到表观 基因组在发育、生长和衰老过程中存在着一个动态变化的过程，以及体细胞的表观基因组有重新编程的可能性，有助于我们以新的观点来探索衰老的机制，构建年龄变化的模式。本文就 dna 甲基化与个体年龄的相关性及其在判断个体年龄方面的前景进行探讨。一、概述 (一 )表观遗传学和 dna 甲基化遗传学是与表观遗传学 (genetic)相对应的概念。遗传学是指基于基因序列改变所致基因表达水平变化，如基因突变、基因杂合丢失和微卫星不稳定等；而表观遗传学则是指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化，如 dna 甲基化和染色质构象变化等：表观基因组 学 (epigenomics)0是在基因组水平上对表观遗传学改变的研究。甲基化是最重要的表观遗传修饰形式。 dna 甲基化是生物体在 dna甲基化转移酶 (dnmts)的作用下，以 s 一腺苷酰一 l 一甲硫氨酸 (sam)为甲基供体，将甲基转移到特定碱基上去的过程， dna 甲基化多发生在胞嘧啶，大多在一 cpg 一序列上。胞嘧啶由此被修饰为 5 甲基胞嘧啶 (5-methylcytosine 5-mc)。这种 dna 修饰方式并没有改变基因序列。但它调控了基因的表达。哺乳动物中 cpg 序列在基因组中出现的频率仅有 l，远低于基因组中的其他 核苷酸序列。但在基因组的某些区域中， cpg 序列密度很高，可以达均值的 5 倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区形成所谓 cpg 岛。通常 cpg 岛大约含有 500 多个碱基。在哺乳动物基因组中约有 4 万个 cpg 岛，而且只有 cpg 岛的胞嘧啶能够被甲基化， cpg 岛通常位于基因的启动子区或是第一个外显子区 。人类基因组中大小为 100 l 000 bp 左右且富含 cpg 二核苷酸的 cpg 岛总是处于未甲基化状态并且与 56的人类基因组编码基因相关。人类基因组序列草图分析结果表明，人类基因组 cpg 岛约为 45 000 个大部分染色体每 1 mb 就有 5 15 个 cpg 岛。平均值为每 mb 含 lo 5 个 cpg 岛， cpg 岛的数目与基因密度有良好的对应关系。健康人基因组中 cpg 岛中的 cpg 位点通常是处于非甲基化状态，而在 cpg 岛外的 cpg 位点则通常足甲基化的。这种甲基化的形式在细胞分裂的过程中能够稳定的保留。阁基因调控元件 (如启动子 )所含 cpg 岛中的 5-mc 会阻碍 作者简介 李鑫 (1974 一 )，男，山东淄博人，主检法医师，硕士研究生，主要从事法医遗传学研究。法律与医学杂志 2006 年第 l3 卷 (第 4 期 )转 录因子复合体与 dna 的结合，所以 dna 甲基 化一般与基因沉默(gene silence)相关联；而去甲基化 (demethylation)往往与一个沉默基因的重新激活 (re activation)相关联。当机体衰老或呈病理状态，特别是肿瘤发生时，抑癌基因 cpg 岛以外的 cpg 序列非甲基化程度增加，而 cpg 岛中的 cpg 则呈高度甲基化，以至于染色体螺旋程度增加及抑癌基因表达的丢失。一般说来， dna 的甲基化对维持染色体的结构、 x 染色体的失活、基因印记和肿瘤的发生发展都起重要的作用。【 6】 (二 )dna 甲基化的生物作用及特点 1 dna 甲基化与基因表达 dna 甲基化在 维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育过程以及衰老过程中起着极其重要的作用。研究表明胚胎的正常发育得益于基因组 dna 适当的甲基化。例如：缺少任何一种甲基转移酶对小鼠胚胎的发育都是致死性的。 31 此外，等位基因的抑制被印记控制区 (icrs)所调控，该区域在双亲中的一个等位基因是甲基化的。 17印记基因的异常表达可以引发伴有突变和表型缺陷的多种人类疾病。甲基化抑制基因转录主要通过以下机制来实现。 (1)直接抑制。 cpg 岛甲基化真接干扰 tf 与调控区 dna 的结合 例如 camp 反应元件结合蛋白(creb)， ap 一 2， e2f， nfkb 等 tf 不能与相应的 dna 位点相结合。但有些 tf 如 sp1， ctf 与甲基化和非甲基化位点都能结合，这表明甲基化单独不足以阻止体内 tf 与 dna 相结合。 (2)间接机制。近年来发现一些甲基化 dna 结合蛋白如 mdbp1， mdb2 以及甲基化 cpg 结合蛋白如 mecp1， mecp2 与甲基化 dna 特异结合，抑制基因转录。其介导转录抑制的程度取决于甲基化密度和启动子的强度。如低密度甲基化可完全抑制一些弱的启动子，但对强的启动子则收效甚微。 (3)dna 甲基化还可通过影响染色体结构来抑制转录。不仅甲基化启动子区形成的 核小体抑制体外起始转录，而且 mecp1 与甲基化启动子 cpg 位点结合后，可引起染色质聚缩成非活性高级结构，以至于转录因子不能与其相结合，从而抑制转录。 dna 甲基化状态并非固定不变在许多哺乳动物组织内，基因组甲基脱氧胞嘧啶水平随老化而下降，在鲑鱼、小鼠、大鼠、牛与人类的脑、肝脏、大肠粘膜、心脏和脾脏内发现dna 脱甲基化作用。相反，大鼠肺则不发生脱甲基化，大鼠。肾内甲基脱氧胞苷总含量增加。这说明甲基化状态随老化而变化，即发生甲基化 285 和脱甲基化，但总的说来，最常见的变化似乎是进行性的脱甲基化。这些变化 均可导致随老化而发生的基因表达变化。2 dna 甲基化与肿瘤的关系研究表明， dna 甲基化在肿瘤的发生、发展中起重要作用。甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素，这种变化包括 dna 甲基化总体水平降低和启动子等基因表达调控元件附近的 cpg 岛局部甲基化水平的异常升高，从而导致基因组的不稳定(如染色体的不稳定、可移动遗传因子的激活、原癌基因的表达 )和抑癌基因的不表达。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，则发生癌症的几率提高，例如：胰岛素样生长因子一 2(igf 一 2)基因印记丢失导致多种肿瘤，如 wilms 瘤。【 8j3 dna 甲基化与基因印记基因组印记是性细胞系的一种表观遗传修饰，这种修饰有一整套分布于染色体不同部位的印记中心来协调。印记中心直接介导了印记标记的建立及其在发育全过程中的维持和传递，并导致以亲本来源特异性方式优先表达两个亲本等位基因中的一个而使另一个沉默。基因组印记是可遗传的， dna的甲基化在基因组印记的分子机理中充当重要角色。dna 高甲基化是一个基因印记抑制信号， dna 甲基化对控制印记基因中父子和母子等位基因的不同表达具有重要作用。 914人类基因组dna 甲基化的特点 dna 甲基化的基本特征有： 1)数量 多、信息容量大；2)可遗传性：有丝分裂时分化细胞可以稳定地将甲基化模式传递给子代细胞： 3)相对稳定性，即在体内内外环境短时间变化不会引起细胞基因组甲基化谱的改变； 4)与 snp 标记毗邻，提供不同层次信息，相互补充。人类基因组 dna 甲基化还有自身特点。 (1)时空特异性。dna 甲基化是记录细胞分化历史、维持组织特异性基因表达的主要机制之一。有学者认为， dna 甲基化可能使分化细胞基因组重新编程，通过 dna 甲基化来控制基因的时空表达，调节发育过程和各种生理反应。在不同组织或同一类型细胞的不同发育阶段，基因组 dna 上各cpg位点甲基化状态的差异构成基因组 dna甲基化谱。组织特异的 dna甲基化谱是哺乳动物基因组的一个显著特征。细胞之间 dna 甲基化模式的差异是在个体发育的过程中逐步形成的，并在以后的有丝分裂中保持不变。在胚胎发育过程中，细胞的甲基化模式按一定方向发生有规律地变化。成年个体，组织特异性基因形成组 286 织特异性的甲基化模式。随着年龄增长，基因组 dna 甲基化总体水平不断下降特定 dna 片断的甲基化程度可以增高或降低。取决于组织细胞和基因种类。 (2)亲缘特异性。在某些基因座，所有组织体细胞都选择性地将亲代 一方的等位基因甲基化呈现亲缘依赖的等位基因甲基化模式。 (3)病理特异性。在病理状态下，组织细胞的 dna 甲基化谱发生特异性的改变。 dna 甲基化改变在许多肿瘤的发生发展过程中发挥重要的作用。目前证实，启动子高甲基化是肿瘤抑制基因第三种常见的失活途径。二、 dna 甲基化与年龄相关性分化细胞的稳定性是高等生物的基本特征之一。然而，在衰老过程中某些细胞会发生年龄相关的变化。例如，某种 cpg 岛的从头甲基化会关闭一个基因，丧失与这个基因相关的生理功能；同样甲基化的丧失也会激活正常情况下沉默的基因，造成不恰当的异位表达。 2o 世纪 8o 年代初， wilson 等测定了体外培养的人、田鼠及小鼠成纤维细胞 dna 的 5 甲基胞嘧啶含量，发现均随细胞分裂次数的增加而降低且下降速度以人、田鼠、小鼠的次序递减而永生化细胞系的 5 甲基胞嘧啶含量则保持相对稳定。以 dna 甲基化酶抑制剂 5 氮杂胞苷或 5 氮脱氧胞苷处理人二倍体成纤维细胞或某些肿瘤细胞，可使其增殖能力下降，体外培养寿限缩短。因此， dna 甲基化水平也可以作为细胞分裂的 “ 计时器 ” 。体内实验同样发现基因组整体甲基化水平有随龄降低的趋势。在基因组整体甲基化水平降低的同时，衰老过程中也伴有个别 基因甲基化水平增高的现象。最早证明与年龄相关启动子 cpg 岛的甲基化是人结肠组织雌激素受体 (estrogen receptor， er)基因，年轻个体中，几乎检测不到 er 基因的甲基化，以后，随龄逐渐升高。另外。胰岛索样生长因子 2(insulinlike growth facror， igf2)、肌原调节蛋白myod1、体觉诱发电位组分 n33 基因启动子 cpg 岛的甲基化水平在正常的结肠组织中同样随龄升高。 tra 等用限制性界标基因组扫描技术对 t 淋巴细胞 2000 个基因座的甲基化年龄变化情况进行了调查，发现 29 个基因座有变 化，其中 23 个增加， 6 个降低。也许这些特定基因的甲基化是更好的衰老生物学标志。陈培利等 _10利用人胚肺二倍体成纤维细胞 (human fetal lung diploid fibroblasts。 2bs)进行体外培养。发现其 p16 基因启动子区及外显子 i 处的 dna 甲基化水平随个体细胞代龄的增加而降低。他们首先将 2bs 细胞在体外作常规传代培养 (规定 3o 代龄以内为法律与医学杂志 2006 年第 l3 卷 (第 4期 )年轻细胞， 55 代龄以上为衰老细胞，在 31 至 54 代龄之问位中年细胞 )。然后用有机法提取细胞 dna，取各组 dna 各 llxg 加入 sinai约 40u， 25c 酶切过夜 (smai 不具备甲基化修饰作用 )。然后对 p16基因外显子 i 及 13-actin 进行 pcr 扩增。 ll 二 | 。 _ llll | _ _⋯；一 _l l _ _l _li _l il 、 l i、 4 _ li 0_ _l年轻细胞中年 j 田胞老年细胞围 1 不同代龄 2bs 细胞 p16 外显于 pcr扩增条带的吸光度扫描值【 。寰 1 不同代龄 2bs 细胞 pl6 外丑于 l殛 i-actinpcr 扩增条带的吸光度扫描值组别 n 沣： #以 b actin的值校正后结果； t 检 验，与年轻细胞相比， p<；o 05 实验结果 (参见表 1)表明，不同代龄 2bs 细胞 p16 基因外显子 i 上的扩增产物均低于相对的未酶切的 b actin 对照组，且其 dna 甲基化水平随代龄的增加而趋于降低，在年轻细胞中甲基化水平约为 64而在衰老细胞中仅为 24，降低约 40。在之后的研究中，陈培利等在以 2bs为模型的衰老研究中发现，细胞分裂一次端区 (即端粒 )缩短 50bp，抑制 dna 甲基化则可导致细胞早衰。 ⋯；】他们测定了去甲基化处理后的 2bs 细胞的端区长度研究表明老年 2bs 细胞衰老表型更加明显，端区长度较对照细胞缩短，而年轻细胞则变化不 显著。从而推断甲基化的改变可以影响染色质的构象，从而可能改变端区结合蛋白与 dna 的作用 l1 1，后者可以进一步引起端区长度改变。三、 dna 甲基化检测方法随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。 dna 甲基化可以从甲基化含量、甲基化水平、甲基化模式和甲基化图谱分析等多种途径进行分析。甲基化含量分析 5mc 在基因组中所占的总体比例：甲基化水 2 1 8 6 4 2 0l n n 璎辍 越法律与医学杂志 2006 年第 13 卷 (第 4 期 )平分析单个 cpg 胞嘧啶甲基化的发生率，若同时 分析多个 cpg 位点，则可以制作甲基化水平图谱；甲基化模式分析一段单链 dna 上一组 cpg的甲基化状态组合。根据研究目的，甲基化检测方法分为：基因组整体水平的甲基化检测，特异位点甲基化的检测和寻找新甲基化位点。从研究所用的处理方法不同分为：基于 pcr 的甲基化分析方法；基于限制性内切酶的甲基化分析方法；基于重亚硫酸盐的分析方法和层析法等。 31以下归纳总结了主要的甲基化分析方法以及相关特性。 (一 )基因组整体水平甲基化分析高效液相色谱柱 (hplc)及相关方法。 hplc是一种比较传统的方法，能够定量测定基因组整体水平 dna 甲基化水平。它由 kuo 等 1980 年 131 首次报道。过程是将 dna 样品先经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，结果与标准品比较，用紫外光测定吸收峰值及其量，计算 5mc (5mc+5c)的积分面积就得到基因组整体的甲基化水平。 oefner 等 1992 年提出变性高效液相色谱法 (dhplc)用于分析单核苷酸和 dna 分子。邓大君等 2001 年 i141 将其改进与 pcr 联用建：立了一种检测甲基化程度的 dhplc 分析方法。将重亚硫酸盐处理后的产物进行差异性扩增。由于原甲基化的在重亚硫酸盐处理时仍被保留为胞嘧啶， 因此原甲基化的在 pcr 扩增时，其变性温度也相应上升。使 pcr 产物在色谱柱中保留的时间明显延长这样就可以测定出 pcr 产物中甲基化的情况。这种方法的最明显优点是：可用于高通量混合样本检测能够明确显示目的片段中所有cpg 位点甲基化的情况但不能对甲基化的 cpg 位点进行定位。其他基因组水平甲基化分析还有 sssi 甲基转移酶法，免疫化学法，氯乙醛法等。各具优缺点。 (二 )特异性位点的 dna 甲基化的检测 1甲基化敏感性限制性内切酶 (ms re pcr southern)法这种方法利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区 的不切割的特性将 dna 消化为不同大小的片段后再进行分析。 这是一种经典的甲基化研究方法，其优点是：相对简单，成本低廉，甲基化位点明确，实验结果易解释；2甲基化特异性的 pcr(ms pcr)herman 等 161 1996 年在使用重亚硫酸盐处理的基础上新建的一种方法。它将 dna 先用重亚硫酸盐处理。这样未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的不变。随后行引物特异性的 pcr。检测 msp 扩增产物如果用针对处理后甲基化 dna链的引物能扩增 287 出片段，则说明该被检测的位点存在甲基化；若用针对处理后的非甲 基化 dna 链的引物扩增出片段则说明被检测的位点不存在甲基化 (见图 2)。 1517 5 衄 _{；2 盈_ 平 盈 3 5-啪 _曩墨 |_唧 h _霉叠 _甲 3 _ p1 m ri 一 一图 2 甲基特异性的 pcr 扩增 (ms pcr)示意 i 莩 i。 dna 经重亚硫酸盐处理后。以处理后的产物作为模板加入甲基化特异性的引物(primer 1)或非甲基化的引物 (primer) 进行特异性的扩增 (如图所示 )，只有结合完全的甲基化或非甲基化特异性引物的片段才能扩增出产物。 1s,1(三 )寻找新甲基化 位点 1限制性标记基因组扫描(rlgs)costello 等 2000 年报道的 rlgs 81 能对整个基因组的甲基化状态进行分析发现新甲基化基因的方法。这种方法联合使用了限制性内切酶及二维电泳。其过程是：先用甲基化敏感的稀频限制性内切酶 noti 消化基因组 dna，甲基化位点保留，标记末端、切割、行一维电泳，随后再用更高频的甲基化不敏感的内切酶切割。行二维电泳，这样甲基化的部分被切割开并在电泳时显带，得到 rlgs 图谱与正常对照得出缺失条带即为甲基化的可能部位。 2联合甲基化敏感性限制性内切酶的 mb(com pare ms)srinivasan yegnasubramaniant 91 2006 年报道了一种新方法 compare ms该法将 mbd 柱层析法与 ms re 联用。互补了各自单用的弊处，能够快速、敏感的检测 dna 甲基化情况 (见图 3)。 19j 四、甲基化型分析的优势以及存在的问题 (一 )甲基化作为检测对象的优势 1甲基化型既能反映有关基因功能状态及与此相连的多种疾病相关的丰富信息。叉具有简单的 “ 二元化 ” 性质，即令甲基化为 “0” ，非甲基化为 “1” ，就可以进行数字化处理，便于开展大规模和自动化监测分析。 2 dna分子十 分稳定。有可能将它和 dna的 snp分析等置于同一个技术平台。同时它又比 rna 和蛋白质更便于保存和运输。并可对已经石蜡、甲醛或乙醇预 288 _f 簟 图 3 联台甲基化敏豫性限制性内切酶的 mbd (compare-ms)示意围。用甲基化以外的位点的内切酶 ia 酶 )与甲基化敏雅的内切酶 (b 酶 )联用则甲基化的 dna 链不被切开。非甲基化的切开再行 mbd 捕获存在甲基化位点的 dna 片段。最后行实时 pcr 扩增并分析。 f 删处理的样本进行分析，可以开发历史上储备的病理学资料。 (二 )存在的问题目前还未找到 dna 甲基化 改变与年龄之间的精确的量化关系式。虽然人们对个体细胞的衰老及其基因甲基化水平的改变有了初步的了解但还在研究探索二者之问的精确的量化关系。 201 对使用 dna 甲基化改变来推断个体年龄的大小，仍需要进行大量的研究和调查。 (三 )付诸于实践之前还必须解决的问题1确定表观遗传修饰与特定生理指标的相关性： 2 证实将这些指标作为鉴别诊断的潜在可能性和技术可行性： 3通过一定规模的流行病学调查来验证实验室内的表观遗传生理及病理发现在人群中的真实性。五、 dna 甲基化在法医学中判定个体年龄上的展望目前，研究dna 甲基化水平改 变与个体年龄的相关性尚处于试验阶段，但已引起许多学者的关注。人类表观基因组协会 (human epigenome con sortium， hec)于 2003 年 1o 月正式宣布开始投资和实施人类表观基因组计划 (human epigenome project， hep)。 dna 甲基化已经成为表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容， hep 的最终目标是就要确认这些 dna 甲基化位点在人类基因组的分布与频率，以指导和系统研究 dna 甲基化在人类表观遗传、胚胎发育、基因印记等发挥的作用。 借助于该计划的实施和分子生物学技术的发展 ，在法医实践中可以通过调查各年龄段人群基因组 dna 甲基化分布以及相关频率，建立相关统计学模型，将来有望成为法医个体年龄判定的一项重要的生物学指标。 (感谢西安交通大学医学院第一附法律与医学杂志 2006 年第 l3 卷 (第 4 期 )属医院妇产科、环境与疾病相关教育部重点实验室郑鹏生教授和顾婷婷同学的支持和帮助。 )参考文献【 1 j 马宏，张宗玉，童坦君衰老的生物学标志 j】生理科学进展， 2002， 33：65 692】陈朝飞，房静远衰老的表观遗传修饰研究 j】上海医学， 2006， 29(1)： 58 60【 3】 dahlc，guldbergp dnamethylationanalysistechniquesj】 biogerontology， 2003， 4(4)： 233250【 4 bird a p cpg rich islands and the function ofdna methylationj nature， 1986， 321： 209231【 5 j depamphilis ml， zorbas h identifying 5 一 methyic 08ine and relatedmodifications in dna genomesj】 nucleic acids res 1998， 26(10)： 2255 22646】 黄庆，郭颖，府伟灵人类表观基因组计划 jj生命的化学， 2004， 24(2)： 1011027】董玉玮，侯进慧，朱必才，等表观遗传学的相关概念和研究进展叨生命的化学， 2005， 22(1)： 138】 feinberg a p， tycko b the history of cancer epigenetic nat revcancer， 2004， 4(2)： l43-1539】李素婷 真核生物 dna 甲基化状态 河北医学， 1999， 5： 85-881o】 陈培利，童坦君，张宗玉 dna 甲基化埘基因表达的影响及其在衰老过程中的表现 同外医学分子生物学分册， 2000， 22： 155168il】毛泽斌，张宗 ，童坦军 dna 去甲基化对细胞衰老的影响【 j1l 生物化学杂志， l997， l3(3)： 318 32l12】 lustig aj， kurtz s， shore d involvement of the silencer and 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