染色体显微操作技术

第5章 染色体显微切割,引言： 在大部分人类肿瘤和某些特定人类遗传病中存在染色体重排。肿瘤特定的染色体异常会导致原癌基因产物的激活、肿瘤特异融合蛋白的产生或肿瘤抑制基因的失活。,一个癌细胞的染色体共104条，包括许多异常的染色体,Ph染色体示9；22易位（9q34;22q11）;fi 22q-;示9+,Burkitt淋巴瘤的14q+染色体8q24;14q32易位,一些肿瘤常见的染色体异常,染色体显带技术的建立，肿瘤非随机性染色体异常的细胞遗传学分析已成为许多人类肿瘤诊断和预后不可或缺的指标，但常规显带染色体分析不能确定所有的细胞遗传学染色体重排。,该技术的局限性阻碍了许多人类肿瘤，尤其是实体瘤核型的确定，但这种情况已被染色体显微切割和FISH技术所弥补。染色体显微切割已经成为由细胞遗传学分析快速过渡到分子检测的有力工具。,细胞核移植技术：就是将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即无性繁殖即可被激活、分裂并发育成新个体，使得核供体的基因得到完全复制。以供体核的来源不同可分为胚细胞核移植与体细胞核移植两种。,1 切开卵母细胞透明带2 挤出卵母细胞细胞核3 注入供体细胞核4 电融合仪融合培养,1,2,3,4,5,显微操作仪,嵌合体技术,嵌合体 (chimera)一词源于古希腊神话，其意是指狮头、羊身、龙尾等部分拼凑起来的怪兽。嵌合在生物学上是指同一个体中，基因型相异的细胞或组织混合存在的状态。,现代的胚胎工程技术中，也有一种叫胚胎嵌合的技术。它是将个胚胎细胞（同种或异种动物胚胎）合并，共同发育成个胚胎，即“嵌合胚胎”，然后将这个胚胎移植给受体，让其妊娠产仔。如果产下来的幼仔具有以上种动物胚胎的细胞，则称其为“嵌合体动物”。例如，用同一种类的黑鼠和白鼠胚胎嵌合，可生下黑白相间的花小鼠；不同种类的绵羊和山羊胚胎细胞嵌合，可生下绵山羊，它既有绵羊的特征，又有山羊的特征。,1 囊胚显微注射法：用显微操作技术将供胚的全部内细胞团注入除去部分内细胞团的受胚囊胚腔中，或将供胚的部分内细胞团注入受胚的囊胚腔中，也可以向受胚囊胚腔中（或卵周间隙）注入16细胞至桑甚胚的卵裂球、胚胎干细胞或已分化的细胞，使其发育为嵌合胚胎的方法即为囊胚注入法。,2. 聚合法,是指将去除透明带的两枚8细胞至桑葚期胚胎，或来自两个不同胚胎的卵裂球，或卵裂球与胚胎聚合在一起的方法。,胚胎移植,1.概念:将雌性动物的早期胚胎,或者通过其他方式得到的胚胎,移植到同种的.生理状态相同的其他雌性动物的体内,使之发育为新个体的技术.供体：提供胚胎的个体。受体：接受胚胎的个体。,染色体显微切割分手工切割和激光切割法，倒置显微镜上装配切割臂，安上硅化玻璃针，找到分散良好的分裂相来切割所需染色体片段。,显微切割图例,1.染色体显微切割技术的发展,染色体显微切割最早起源于从一个特定的染色体区域分离出DNA标记，并首先成功地应用于果蝇多线染色体和小鼠染色体的研究。,1981年，德国的欧洲分子生物学实验室（EMBL）Scalenghe等切割了果蝇唾液腺多线期X染色体第3段的几个片段，通过蛋白酶消化、酚抽提、EcoR I酶切进行重组克隆。,多线染色体：,1984年染色体显微切割应用小鼠； 1986年Bates等切割了人的2号染色体短臂。但当时由于所切割的染色体DNA量少，通常要切割上百条染色体，且其文库也只含几百个微克隆。,由于无法直接扩增染色体DNA，所以必须在显微镜下反复切割若干拷贝的染色体，才能满足实验的要求这不仅费力耗时，而且要求实验操作人员必须具备熟练的染色体分带和鉴定经验，才保证实验的准确性。,显微切割技术的突破在于它与PCR的结合，1989年Ludecke等切割了人类G显带染色体，结合PCR技术进行体外扩增，使其工作量大大减小。,对于同一条染色体，只要切割和收集5 10个拷贝，通过PCR扩增，即可满足实验要求。从而极大地提高了实验技术的可行性和准确性。,在1989年，Ludecke等建立了一个显著提高克隆效率的方法。 该方法首先用Rsa I酶切显微切割的DNA，连接到一个用Sma I酶切的pUC载体，然后用PCR扩增插入位点两侧的载体序列。,PCR扩增,随后的研究对该方法进行完善，显微切割DNA经酶切后连接到一个由24碱基或20碱基的寡核苷酸组成的5，端突出连接头。用20个碱基连接头作为引物进行PCR扩增显微切割的DNA，限制酶切扩增产物并克隆到质粒载体中去。,替代方法： 该方法用简并寡核苷酸引物直接用PCR扩增显微切割DNA。该方法在显微切割的DNA进行PCR扩增前增加了拓扑异构酶I处理，大大简化了显微切割的程序。优点： 通过减少显微切割DNA的拷贝数降低显微切割的操作时间和难度，同时也降低了外源性DNA污染的风险。,2.染色体显微切割的应用,2.1 感兴趣区域DNA克隆的构建,2.2 FISH探针的制备2.3 染色体重排的检测2.4 区域特异性cDNA的选择,2.染色体显微切割的应用,2.1 感兴趣区域DNA克隆的构建 显微切割在人类基因组计划启动之前主要是分离填补物理作图缺口的染色体区域特有的DNA标记。定位克隆计划已经建立了几个区域的特异文库。,2.2 FISH探针的制备2.3 染色体重排的检测2.4 区域特异性cDNA的选择,物理作图,要完成真核生物基因组测序的巨大工程，通常首先需要把基因组分解成为许多较小的DNA片段，然后分别测序，再综合组装。 物理作图就是要把基因组分解成为许多较小的DNA片段，然后再把这些DNA片段连接起来，构建一个由DNA片段重叠群组成的物理图（physical map）。,物理图谱：描绘DNA上可以识别的标记的位置和相互之间的距离（以碱基对的数目为衡量单位，即物理距离），这些可以识别的标记包括限制性内切酶的酶切位点，分子标记及功能基因等。构建作图文库建立克隆重叠群重叠群长度确定作图片段锚定整合图谱,物理作图的主要环节,2.染色体显微切割的应用,2.1 感兴趣区域DNA克隆的构建2.2 FISH探针的制备 为了检测以前不可辨认的肿瘤和遗传病的染色体异常，已普遍采用全染色体探针的荧光原位杂交技术。为满足日益增多的高质量染色体涂染探针的需求，染色体显微切割已用于许多FISH探针的制备，包括所有人类的染色体涂染探针、染色体臂涂染探针和区带特异性涂染探针。,2.3 染色体重排的检测2.4 区域特异性cDNA的选择,染色体涂染技术,染色体涂染技术即将整条染色体、某条染色体臂（长臂或短臂）或者染色体某个片断的DNA制备成探针，然后用荧光原位杂交的方法，将探针杂交到中期分裂相染色体上，在荧光显微镜下观察荧光素在染色体上标记的颜色，从而分析和研究染色体的重组、畸变以及同源基因等的一种新技术。,染色体涂染,染色体涂染技术,1.染色体DNA探针的制备,2.荧光原位杂交,流式细胞分类法；克隆基因库或体细胞杂交株；染色体显微切割和PCR扩增等途径。,1.染色体DNA探针的制备,流式细胞分类法（flow cytometry） 该法用一种或多种荧光染料将悬浮液中的中期分裂相染色体染色。由于染色体大小、形态、组成和结构的不同，所染色的特征有其特异性，从而可以通过流式细胞术将特定的染色体收集起来。,局限性：如果受试物的染色体形态单一、数目较多,仅根据染色体的形态和大小很难将所有的染色体准确地区分开来。,局限性：如果受试物的染色体形态单一、数目较多，如牛 (2n=60) 和狗(2n=78)的所有常染色体及绵羊(2n=54)和马(2n= 64)的大部分常染色体都是端位着丝点，因此，仅根据染色体的形态和大小很难将所有的染色体准确地区分开来。,1.染色体DNA探针的制备,克隆基因库或体细胞杂交株 通过特定的克隆基因文库或者特异性的体细胞杂交细胞系制备某条染色体整个或部分DNA探针。该法特异性强，准确性高，且可与功能遗传学的研究结合起来，但对实验室要求较高，取材来源和研究范围有所限制 。,染色体显微切割和PCR扩增,通过该方法制备的染色体DNA探针，相对而言，具有直接、准确、 简便和应用范围广等优点。,2.荧光原位杂交（ fluorescent in situ hybridazation,FISH）,原位杂交是基于DNA分子复制原理而发展起来的一种技术。用带有标记（放射性同位素、荧光染料等）的DNA或RNA片段作为核酸探针,与组织切片或细胞内待测核酸 (RNA或DNA）片段进行杂交，然后用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在及定位。,2.荧光原位杂交,荧光原位杂交是在20世纪80年代末在放射性原为杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。探针首先与某种介导分子结合，杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料。,基本原理： 如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。,实验流程： FISH样本的制备探针的制备探针标记杂交（染色体显带）荧光显微镜检测结果分析。,优点: 荧光试剂和探针经济、安全； 探针稳定，一次标记后可在两年内使用； 实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确； 可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当； 多色FISH在同一个核中显示不同颜色可同时检测多种序列； 既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。,缺点： 不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。,染色体涂染技术的应用,染色体涂染技术主要应用于动物分子细胞遗传学、人类疾病、性染色体以及染色体进化等研究。1995年以来，剑桥大学应用这项技术进行哺乳动物的染色体比对，他们运用了YAC等细胞的多种染色体作探针，以研究重组染色体的断裂点。澳大利亚Latrobe大学以染色体涂染技术探讨人的XY染色体的亲缘关系。美国Ambady等人用显微切割术和PCR扩增建立了猪第6号染色体DNA文库，寻找微星体，用于猪基因图的研究。国外实验室主要研究不同种属的动物(包括人) 或植物染色体(尤其是性染色体) 的比较与进化，研究过的动物有鸡、狗、狐、猴、 猫、猿、鼠、兔、牛、羊、山羊以及其它鸟类、有袋类和哺乳类等。,2.染色体显微切割的应用,2.1 感兴趣区域DNA克隆的构建2.2 FISH探针的制备2.3 染色体重排的检测,该方法最引人注目的特点之一是它可直接检测任何细胞遗传学上可见到的染色体重排的染色体结构。该方法已用于分析不同的染色体重排，包括缺失、易位、小的环状染色体和扩增。常规显带记为简单末端缺失的畸变，通过用显微切割方法重新分析，结果可清楚地显示该缺失为中间缺失或易位。应用显微切割对包括同源染色区域和双微小体的基因扩增产物进行分析显示：这些区域通常是由多个染色体区段组成。,2.4 区域特异性cDNA的选择,FISH检测（chromosome painting)染色体易位,图 染色体倒位图（SISH显示和电镜下观察）,相互易位,2.染色体显微切割的应用,2.1 感兴趣区域DNA克隆的构建2.2 FISH探针的制备2.3 染色体重排的检测2.4 区域特异性cDNA的选择,从同源染色区域（HSR）显微切割DNA技术的应用，使得从显微切割区域内分离转录序列的方法得以建立。显微切割结合选择性杂交已用于鉴别骨肉瘤细胞系中12q11-q13.2HSR有关的基因。简单地说，显微切割DNA的PCR产物被固定在尼龙膜上，然后将从癌细胞系中用随机引物法制备的cDNA与靶HSR进行杂交。经杂交和严格洗脱后，特异性杂交的cDNA克隆被洗脱并用PCR方法回收。,3.染色体显微切割策略,染色体显微切割,用拓扑异构酶I处理切割的DNA,显微切割DNA的扩增,荧光原位杂交（FISH）,染色体显微切割,用于显微切割的中期染色体是用植物血球凝集素（PHA）刺激正常外周血淋巴细胞制备的，中期分裂相滴在干净的盖玻片上并进行G显带，通常35个拷贝的靶染色体区域足以获得高质量探针。 染色体显微切割是用安装在倒置显微镜上的显微操作装置控制一个玻璃针来完成的。显微切割的染色体片段转移到5微升含拓扑异构酶I的收集液中。,用拓扑异构酶I处理切割的DNA,在PCR扩增前，切割的DNA用拓扑异构酶I处理，使得结构非常紧密的DNA螺旋解旋。这种处理可以显著提高被切割DNA序列的回收。 收集到期望数量的被切割染色体区段后，显微切割的DNA在37度条件下用拓扑异构酶I处理1小时。,显微切割DNA的扩增,扩增被切割DNA最困难的问题是PCR反应的有效启动。Taq聚合酶对启动PCR不是高效的，因为它的延伸温度是72度，而对部分简并引物的最佳退火温度大约是30度。为了解决这个问题，在PCR第58个循环加入T7 DNA聚合酶（测序酶），并且酶是在每个循环的退火温度（30度）时加入。完成此种预扩增后，接着用Taq聚合酶催化的常规PCR反应完成。,T7 DNA聚合酶最初具有53聚合酶活性以及单链和双链35外切酶活性。 当T7 DNA聚合酶用适当方法处理后,可使35外切酶活力明显下降。改造后的T7 DNA聚合酶又称T7测序酶。 使用T7测序酶得到的测序数据具有在每个碱基位置都有相对均匀的配对参入。因此，放射自显影所得到的结果较为清晰易辩，对于许多模板来说，使用含有dGTP的混合物即可得到理想的测序结果。然而，如果出现了带压缩的问题，则用含 dITP的混合物来取代常规的dGTP。dITP的掺入，使在富含GC的模板中也能有效地消除带压缩现象。,T7测序酶具有很高的聚合速度，并有高度的延续性，正因如此，该酶在使用中不同于Kleno