代谢工程会议

基于动态代谢组学分析与合成途径动力学模型的代谢途径诊断方法的构建与应用,2015年微生物代谢工程与发酵工程学术研讨会无锡,报告人：刘龙江南大学生物工程学院2015-11-11,报告提纲,一、研究背景二、系统代谢调控Bacillus subtilis合成N-乙酰氨糖(GlcNAc)三、稳态代谢组学定量解析B. subtilis工程菌代谢特性四、基于GlcNAc合成途径动力学模型的代谢瓶颈诊断与解除五、研究结论,1. 发酵工程与代谢工程,发酵工程与代谢工程的重要意义:发酵工程利用可再生资源生产燃料、工业化合物及功能营养品，实现绿色经济与低碳经济，微生物菌种选育和构建是发酵工程的基础和核心； 代谢工程已成为微生物菌种选育和构建的重要手段，是发酵工程领域的一个重要分支和研究热点。,1.1 代谢工程研究的一般思路与方法,微生物代谢工程研究的一般思路:1、基于文献/数据库分析的目标产物合成途径理性设计； 2、代谢产物(目标产物、副产物)合成途径的局部调控；3、工程菌生产特性及代谢网络的系统优化与全局调控；4、动力学/组学分析确定代谢瓶颈，进行新一轮代谢改造。,1.2 代谢途径理性设计的一般思路,代谢途径理性设计的一般思路:1、文献/数据库/化合物库分析寻找合适的目标产物合成途径(酶) 2、在微生物宿主高效表达目标基因(微生物、动物、植物)3、若文献/数据库无合适的基因(酶)，需首先利用高通量筛选技术筛选获 得目标微生物4、利用比较基因组学和转录组学确定目标产物合成基因(簇)5、根据酶反应特点利用计算机软件模拟并合成人工途径酶,1.3 代谢途径优化与调控一般思路与方法,代谢途径优化与调控一般思路:表达方式优化(游离、整合)启动子工程终止子工程转录因子调控核糖体工程代谢途径(酶)定向进化空间支架构建体外重构反应体系底物转运/产物输出强化,表达方式优化,启动子工程,终止子工程,转录因子调控,核糖体工程,代谢途径(酶)进化,空间支架构建,体外重构反应体系,底物转运/产物输出途径强化,代谢网络系统优化与整体调控常用方法:全局转录机器工程模块途径工程全基因组规模代谢网络模型构建与调控代谢通路定位工程,1.4 代谢网络系统优化与整体调控一般思路与方法,1.5 代谢网络系统分析的一般方法及不足,代谢网络系统分析方法：基于稳态组学数据分析和预测靶点基于稳态流量平衡分析的基因组规模代谢网络模型预测限速步骤胞外重构代谢途径分析合成动力学、鉴定限速步骤目前合成途径起始阶段动力学以及反应动力学模型的研究方法未建立。,胞内代谢物动力学是细胞代谢状态最直接的体现，利用稳态代谢网络分析可发现代谢瓶颈/代谢异常，但不能解释代谢瓶颈/代谢异常产生的原因。在稳态代谢组学分析的基础上，将动态代谢组学和合成途径动力学模拟相结合能鉴定代谢瓶颈/异常及其产生原因，提高对限速步骤的调控能力。,Analyzing transcriptome, proteome and metabolome in steady state for identifying engineering target,2. 代谢调控B. subtilis 生产N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc),医药领域，治疗关节炎营养保健，延缓衰老化妆品，促进胶原蛋白生成,N-乙酰氨基葡萄糖应用领域,B. subtilis 作为生产菌株的优势,可用来生产食品安全级产品遗传背景清晰代谢改造技术成熟不易受噬菌体污染，适于工业化生产,2.1 氨糖合成途径设计与构建glmS和GNA1基因克隆表达,过量表达氨糖合成酶(GlmS)和6-磷酸氨糖乙酰化酶(GNA1)实现了氨基葡萄糖GlcN和N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc的初步积累(240 mg/L)。,枯草芽孢杆菌中GlcNAc合成与代谢途径,nagP基因敲除流程图,敲除nagP基因阻断了GlcNAc由胞外向胞内转运敲除nagA、nagB和gamA三个基因进一步阻断胞内GlcNAc降解途径促进GlcNAc胞外积累，产量提高了17倍,2.1 氨糖合成途径设计与构建GlcNAc转运及分解代谢阻断,验证nagA、nagB和gamA基因敲除成功,2.2 氨糖合成途径优化与调控GlcNAc合成途径(酶)定向进化,氨基葡萄糖合成酶GlmS结构模型,氨基葡萄糖N-乙酰化酶GNA1结构模型,突变体对细胞生长和GlcNAc合成的影响,2.2 氨糖合成途径优化与调控GlcNAc合成关键酶表达调控,GlmS和GNA1的启动子系统优化 (游离/整合表达、表达强度适配),构建基于DNA与锌指蛋白质之间的特异性相互作用的支架系统对GlmS 和Gna1的表达进行区域化调控,GlcNAc在3-L发酵罐上GlcNAc产量达20.6 g/L,2.2 氨糖合成途径优化与调控葡萄糖转运、代谢途径调控,分别敲除glcP基因和EIIA(yyzE、ypqE)基因阻断NPTS和PTS葡萄糖转运系统利用PTS转运系统更有利于GlcNAc合成，但丙酮酸积累，细胞生长慢敲除丙酮酸激酶(pyk)和PEP羧化酶(pckA)降低丙酮酸合成，GlcNAc产量提高60%,2.2 氨糖合成途径优化与调控中心代谢途径调控,分别敲除ldh基因和eutD基因阻断乳酸和乙酸的合成敲除alsS、alsD和bdhA阻断乙偶姻的合成为保持氧化还原平衡，整合表达NADH氧化酶，在3-L发酵罐上GlcNAc产量达37g/L,表达anti-pfk sRNA，控制糖酵解模块活性在中等水平(60%)表达anti-glmM sRNA，限制肽聚糖合成糖酵解模块活性在中等水平(60%)共表达anti-pfk sRNA以及anti-glmM sRNA及Hfq蛋白，限制肽聚糖、糖酵解模块活性在低水平(30%),sRNA能够有效限制GlcNAc合成竞争模块（糖酵解及肽聚糖模块）,2.3 氨糖代谢网络系统优化与调控-构建sRNA调控工具,通过将不同活性模块进行优化组装，GlcNAc摇瓶产量达到8.30 g/L，在3-L发酵罐上产量达到42 g/L。,2.3 氨糖代谢网络系统优化与调控-基于sRNA的模块调控,3. 基于代谢组学与合成途径动力学模型的诊断方法的构建,稳态代谢组学系统分析高产菌株与出发菌株的胞内代谢差异，鉴定代谢瓶颈和代谢异常动态代谢组学及合成途径动力学模拟分析产物合成瓶颈产生原因13C同位素分析进一步验证合成瓶颈，并进一步通过代谢调控解除代谢瓶颈,3.1 稳态代谢组学解析细胞代谢特性,工程菌代谢物水平发生何种变化? F6P和Gln过量消耗是否影响菌体生长?,F6P和Gln,GlcNAc 合成,中心碳代谢及氮代谢,GlcNAc合成途径及野生菌株与GlcNAc过量合成菌株BSGN细胞生长比较,3.1 中心代谢产物谱定量解析,浓度显著变化代谢物,3.1 中心代谢产物谱定量解析,工程菌BSGN与野生菌B. subtilis 168胞内代谢物变化,糖酵解途径、氨基酸合成以及TCA循环代谢物水平显著降低，F6P和Gln降低2倍以上 ；胞内GlcNAcP 升高570倍。,何种过量消耗前体(F6P或Gln)对工程菌BSGN代谢影响更为关键 ?,GlcNAc 合成及糖酵解途径,TCA循环,氨基酸合成,3.1 中心代谢产物谱定量解析,减少中心碳代谢F6P对代谢变化的影响,在F6P代谢节点处减少底物对中心代谢途径供给，对胞内糖酵解途径、氨基酸合成以及TCA循环的代谢物浓度无明显影响。F6P供给非引起细胞生长和代谢变化的关键因素。,F6P,GlcNAc合成,在基因组Pfk引入突变(R252A)，降低其活性,中心代谢,Kinetics of PFK,Kinetics of PFK R252A mutant,如果F6P为关键因素，进一步减少F6P中心碳代谢水平应进一步降低。,GlcNAc 合成及糖酵解途径,TCA循环,氨基酸合成,3.1 中心代谢产物谱定量解析,增加Gln供给对代谢变化的影响,代谢水平几乎全部得到恢复，但细胞生长仍然较慢,Pfk突变和GS过量表达对工程菌能荷水平是否有影响?,过量表达Gln合成酶，增加Gln供给,Gln,Glu,Ac-CoA,CoA,Glucose,Glc-6-P,Fru-6-P,GlcN-6-P,GlcNAc-6-P,GlcNAc,Glycolysis,GS,GlcNAc 合成及糖酵解途径,TCA循环,氨基酸合成,3.1 中心代谢产物谱定量解析,Pfk 突变对细胞能荷无明显影响；GlcNAc过量合成对中心碳、氮代谢的影响不是限制细胞生长的关键因素。,细胞能荷、比生长速率、比产物合成速率比较,3.1 中心代谢产物谱定量解析,胞内GlcNAc6P升高570倍,Glucose,Glc-6-P,Fru-6-P,PTS uptake pathway,过量磷酸糖对细胞有毒害作用:抑制葡萄糖吸收避免过量磷酸糖积累可解除抑制作用。,Glucose,GlcNAc合成过程中，GlcNAc途径代谢物如何动态变化?,GlcNAc6P为工程菌产物合成及细胞生长的潜在瓶颈?,4.1 GlcNAc合成途径动力学分析,将动力学模型与系统生物学数据相结合是分析代谢调控机理的重要手段建立GlcNAc合成途径动力学模型结合动态代谢组学鉴定合成途径中的瓶颈验证并且去除合成途径中瓶颈进一步促进GlcNAc合成,4.2 GlcNAc合成途径动力学分析动力学模拟,GlcNAc合成途径化学计量数的微分方程组,4.2 GlcNAc合成途径动力学分析动力学模拟,无限速步骤,反馈抑制,某一反应速率低于其他反应速率,反应途径中存在无效循环,产物输出能力不足,反应途径末端存在无效循环,4.2 GlcNAc合成途径动力学分析动力学模拟,不同限速步骤及其代谢途径动力学特征：反馈抑制：代谢物浓度低于Km值，且无法达到稳态；代谢途径中存在限速反应及无效循环：上游代谢物积累；代谢途径末端存在无效循环：胞内、胞外产物总浓度降低；产物输出效率不足：胞内产物积累。,(2)=(2) (1) 2+(1), 1 =0 for time 1,(3)=(3) (2) 3+(3) .,4.3 GlcNAc合成途径动力学分析动态代谢组学,动态代谢组学测定：1) 通过底物添加，开启产物合成途径；2) GlcNAc比合成速率保持恒定，达到7.7 mg/g DCW/h。该GlcNAc比合成速率与重组菌BSGN在使用基本培养基进行摇瓶发酵时的GlcNAc比合成速率相近；3) 基于代谢组学采用快速取样及高效淬灭的方法对GlcNAc合成途径开启后2 min之内的动力学进行分析。,4.4 GlcNAc合成途径动力学分析限速步骤预测,氨糖途径动力学变化符合GlcNAc-6-P与GlcNAc无效循环模型模拟特征F6P、AcCoA和Gln浓度大于途径酶Km值，底物供给充足非限制性因素未知激酶催化胞内GlcNAc的磷酸化生成6-P-GlcNAc,4.5 GlcNAc合成途径动力学分析预测结果验证,若存在将胞内GlcNAc磷酸化为GlcNAc-6-P的代谢流时，添加U-13C葡萄糖开启GlcNAc合成途径，GlcNAc-6-P来源于胞内GlcNAc而不是U-13C葡萄糖。当添加U-13C葡萄糖开启GlcNAc合成途径后，未被13C标记的GlcNAc-6-P质量同模子M+0的分数始终保持在100%，而被13C标记的GlcNAc-6-P质量同模子M+6和M+8的分数没有增加。,4.6 GlcNAc合成途径动力学分析限速步骤去除,B. subtilis已注释基因中尚无GlcNAc激酶的注释。将E. coli中GlcNAc激酶的氨基酸序列与B. subtilis中106个激酶的氨基酸序列进行比对，发现葡萄糖激酶GlcK与E. coli中GlcNAc激酶的氨基酸序列相似度最高(26%)。敲除葡萄糖激酶编码基因glcK，在基本培养基中细胞比生长速率(0.15 h-1)及氨糖生产强度(9.33 mg/L/h)为敲除前的2.1和2.3倍。,5、研究结论,建立GlcNAc合成途径动力学模型，模拟不同限速步骤存在时GlcNAc合成途径由关闭到开启状态时动力学，并且鉴定了不同限速步骤存在时的动力学特征。通过控制底物葡萄糖添加，实现GlcNAc合成途径由关闭到开启。采用快速取样、高效淬灭以及靶向代谢组学，实现对GlcNAc合成途径开启后2 min之内的动态代谢组学测定。将实验测定GlcNAc合成途径动力学与动力学模拟结果比较，发现GlcNAc-6-P与胞内GlcNAc之间存在无效循环为GlcNAc合成途径潜在限速步骤。进一步使用U-13C葡萄糖动态标记实验证实了无效循环存在。通过敲除重组菌BSGN中葡萄糖激酶编码基因glcK，胞内GlcNAc转化为GlcNAc-6-P的无效循环得以阻断，细胞比生长速率和GlcNAc生产强度分别提高了2.1倍和2.3倍。,相关发表论文,Liu et al., Biotechnology and Bioengineering. 2015. In revisionLiu et al., Critical Reviews in Biotechnology. 2015. Accepted/In press. Yin et al., Biotechnology Advances. 2015. 33: 830-841.Liu et al., Applied Environmental Microbiology. 2015.