血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定

实验三,血清球蛋白的分离纯化与鉴定,层析技术（Chromatography),层析法也称色谱法，是1903年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。将植物色素溶液通过装有CaCO3 吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。 用色彩（chroma）和 图谱（graphs）组成 色谱一词 （Chromatography),层析技术（Chromatography),依据：混合物中各组分的理化性质差异吸附力、分子形状、大小、酸碱性或分子极性、分子亲和力以及分配系数。,基本原理,固定相固定不动流动相对固定相作单向相对运动，推动样品中各组分通过固定相向前移动。各组分理化性质不同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不断地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各组分在固定相中的迁移距离不等，达到分离。,分类,流动相的物理状态：气相和液相 气固/液，液固/液操作方式：纸、薄层、柱分离原理：吸附、分配、凝胶、离子交换、亲和、金属螯合、疏水、反相,凝胶层析(凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析),定义：指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。基本原理： 固定相：凝胶，惰性三维空间多孔网状结构，故称分子筛，包括琼脂糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖-葡聚糖复合凝胶。流动相：洗脱液,凝胶层析的基本原理,交联葡聚糖凝胶,其商品名为Sephadex G系列G交联度：G后面的阿拉伯数字表示不同的规格型号，有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200八种，具体含义为凝胶得水值的10倍或吸水量（g）/10g干胶。 交联度与孔径大小成反比：交联度越大，孔径越小，吸水性小；交联度越小，孔径越大，吸水性大。,影响因素,*层析柱的选择及装填：柱大小分离样品量凝胶型号分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。凝胶分离范围之外的分子，难以分离。如大小不同的两种全排阻分子/完全渗透分子*洗脱液：溶解待分离物质，不变性*加样量：1%5%*凝胶的再生,蛋白质的分离依据,生命高分子：透析、超滤、超离心、凝胶层析蛋白质的胶体性质：稳定因素为水化膜和电荷盐析/有机溶剂沉淀两性电解质和等电点：pH pI，蛋白质带负电；反之带正电电泳、离子交换层析有一定的功能：抗原性 免疫沉淀、亲和层析,血清球蛋白的分离纯化与鉴定,血清,实验思路,鉴定：醋酸纤维素薄膜电泳,COO- COO- COOH + H+ + H+ Pr Pr Pr + OH- + OH- NH2 NH3+ NH3+ pHpI pH=pI pHpI,蛋白质电泳的原理：,阳离子,兼性离子,阴离子,鉴定：醋酸纤维素薄膜电泳,介质：醋酸纤维素薄膜，纤维素的羟基经乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。溶于有机溶剂后涂成薄膜，具均一的泡沫状结构，有强渗透性。 电泳缓冲液：pH8.6的巴比妥缓冲液,鉴定：醋酸纤维素薄膜电泳,加样线,加样线,纯化蛋白,对照,样品,鉴定：醋酸纤维素薄膜电泳,【操作步骤】1点样：取经巴比妥缓冲液浸透的28cm薄膜，滤纸吸去表面多余水分，在无光泽面距一端2cm处用铅笔划一加样线，写上编号。小滤纸片蘸取血清/样品，垂直压在加样线上，待样品渗入薄膜，无光泽面向下平贴在电泳槽支架的盐桥上，静置510分钟平衡。点样端置阴极，盖上盖子。2通电：接通电源，调节电压为4050V，通电2 2.5h，关闭电源，停止电泳。3染色：薄膜浸入氨基黑B染色液25分钟。4漂洗：取出薄膜在漂洗液中漂洗45次，至无蛋白区完全脱色为止。取出，用滤纸吸干液体。观察。,+,铅笔标记 ，垂直点样,保持膜不下垂,半干燥态,交联葡聚糖凝胶层析介质的有关技术参数,长链状葡聚糖分子间以环氧丙烷连接,分段盐析,分段盐析：各种蛋白大小、亲水程度、pI不同，所需的盐浓度、pH也不一样。如清蛋白分子小，亲水性强，需高盐浓度才沉淀，球蛋白分子大，亲水性弱，较低盐浓度即可沉淀。因此调节盐浓度及pH可使各种蛋白质分段沉淀。常用中性盐：硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。,温度：温度与溶解度成正比。一般室温即可,少数温度敏感型蛋白质需4度操作，而血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在25度比0度时溶解度低，更易盐析。pH值：大多数蛋白质在pI时溶解度最低。pH=pI效果更好。蛋白质浓度：浓度高时产生共沉。盐析前血清加等量生理盐水稀释，控制蛋白质含量在2.5-3.0%。,影响因素,分段盐析,固定相：sephadex G-25流动相：pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲液（0.9%NaCl）,凝胶层析脱盐,sephadex G-25吸水，利用高分子性质。,浓缩,操作注意事项1硫酸铵的滴加，边摇边逐滴加入2流洗柱子