中药毒理与临床前评价2

中药毒性与临床前评价,中药药理学专论,临床不良反应,含马兜铃酸中药,马兜铃属木防己属木通属细辛属千金藤属青藤属蝙蝠葛属 (共计七十多种),毒性表现,胃肠道反应肝毒性肾毒性:BUN增高、肾小球滤过率减少 肾变性,严重ADR-近年国家SDA通报,清开灵注射液：过敏性休克，注意适应证双黄连注射剂：过敏及输液反应、注意单独、滴速、适应证葛根素注射液：过敏、皮疹，注意疗程、剂量、适应证鱼腥草注射液*：过敏性休克，已暂停莪术油注射液：过敏、皮疹，注意单独、滴速、适应证,4、清开灵注射液,温病条辨中安宫牛黄丸的前半部分改良剂型含板蓝根、金银花、栀子、水牛角、珍珠母、黄芩苷、胆酸、猪去氧胆酸清热解毒、化痰通络、醒神开窍，治疗高热、炎性疾病及脑血管病主要ADR：过敏性休克 ，1-30分钟建议配伍后的PH值在6.8-7.5 ，4小时内,4、清开灵注射液不可配伍制剂,维生复方电解质MG3注射液（高糖维持液）、复方乳酸钠维生素C、维生素B6青霉素、乳糖酸红霉素、盐酸林可霉素丁胺卡那霉素、卡那霉素 、庆大霉素肾上腺素、重酒石酸间羟胺、多巴胺、盐酸洛贝林,5、双黄连注射剂,金银花、黄芩、连翘，上呼吸道感染、支气管炎等过敏性休克：过敏反应增多，本身含绿原酸、黄芩苷等易过敏成分不超过说明书用量，控制滴速,5、双黄连注射剂 -不可配伍制剂,青霉素G含钾的复方葡萄糖输液-pH、成分下降地塞米松、氢化可的松-影响疗效，病程延长 氨基糖苷类和大环内酯类抗生素：庆大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素（阿米卡星）、链霉素、红霉素混浊或沉淀诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、维生素C 、白霉素、氯霉素,6、葛根素注射液,4,7-二羟基-8-D葡萄糖异黄酮扩张外周血管，改善微循环，活血化瘀用于心肌梗塞，冠心病，心绞痛，视网膜动、静脉阻塞，突发性耳聋等不可配伍制剂：5%碳酸氢钠注射液 pH,6、葛根素注射液严重ADR,过敏性休克溶血性贫血，肝脏、肾脏损伤：药物免疫原性抗原抗体反应，特异性抗体与药物形成免疫复合物吸附于红细胞上，激活补体，红细胞破坏，溶血。溶血产物（血红蛋白）肾小管，急性肾功能衰竭，死亡国家SDA修改药品说明书：增加“偶见急性血管内溶血”,7、鱼腥草注射液,癸酰乙醛，挥发油提取 抗病毒、广谱抗菌，对流感病毒、腺病毒有灭活作用，对肺炎球菌、流感杆菌有明显抑制作用，提高肌体免疫力抗炎作用,7、鱼腥草注射液,不可配伍制剂：普鲁卡因 醛基与伯氨基药品质量：全国40家生产，5个产品质量含量-高低差别410倍，不溶性微粒（1/5）质量标准水平参差不齐,8、莪术油注射液,呼吸道感染国家SDA药品不良反应通报：10岁以下儿童，221例（88-04年）过敏样反应21，皮疹15、呼吸困难6、过敏性休克4、死亡1例患者过敏史、过敏体质慎用,8、莪术油注射液不可配伍制剂,头孢曲松、头孢拉定、头孢哌酮庆大霉素速尿,毒理学研究,第一章 概述,基本概念 毒理学: 从生物医学角度研究外源性化合物对 生物体的损害作用及其机制的学科。 分支学科: 药物毒理学、食品毒理学、临床毒理学、 分析毒理学、工业毒理学、环境毒理学、 生态毒理学、管理毒理学。,一、毒理试验,以观察、测定、了解药物对机体引起的损害、机制为目的而设计的试验。 整体 器官 细胞 分子,1.整体试验（In vivo）,哺乳动物 急性毒性试验 (LD50) 多次给药急性毒性试验 LD50(n) 长期毒性试验,2.体外试验（In vitro）,离体器官：心、肝、肾、肺、脑 条件:利用器官灌流技术将特定的液体通过血管流经离体的脏器 . 目的: 保持生理状态 指标:异常作用、代谢情况,In vitro,培养的细胞或细胞器 原代细胞 传代细胞 细胞株 细胞器：线粒体、微粒体、核等,3. 一般毒性试验,急性毒性试验、长毒毒性试验特点： 毒性指标具有广泛性和不确定性。 综合指标：包括生理学、血液学、血液生化学、病理形态学。,4.特殊毒性,某些特定毒性反应 毒性指标具有明确性。 包括：生殖毒性、遗传毒性、依赖 性试验、过敏性试验、局部 刺激试验、光敏试验、免疫 毒性试验,5.毒理病理学,形态学试验 器官、组织、细胞及亚细胞形态结构变化： 确定损伤的靶器官 靶部位形态变化的性质、程度 靶部位变化过程和归转,二、毒性作用种类,按毒性反应分类 过敏（变态）反应、特异质反应、 光敏感反应、局部毒性、全身毒性、 可逆和（或）不可逆毒性损伤、即 刻和（或）滞后毒性按作用靶器官分类： 肝毒性、肾毒性、神经系统、心血管系统-等。,（一）按毒性反应分类,1.过敏（变态）反应,概念：药物或其代谢物（作为抗原或半抗原） 刺激机体产生抗体或（和）致敏淋巴细 胞，当再次用药时，药物与相应的抗体 或（和）致敏淋巴细胞发生特异性结合 导致。特点：与已知药物的药理特性无关，效应与剂 量无线性关系。,2.特异质反应,概念：机体对外源化合物的一种遗传性 异常反应。 如：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷 血清胆碱脂酶缺乏,3.光敏感反应,类型：光毒性、光变应性概念： 光敏感性药物反应：注射或内服光敏性药物 引发的皮肤炎症。 光接触性皮炎：外用药引发。特点： 光毒性皮炎：与免疫机制无关。 光变应性皮炎：与其他类型的迟发性变态反应相同，第一次发生有一定的潜伏期。,贯叶连翘提取物光毒试验结果(豚鼠背部皮肤),A :对照组B :补骨脂素160mg/kg组C路优泰1.2g/kg组D贯叶连翘提取物1.2g/kg组E :贯叶连翘提取物0.6g/kg组1： UVA照射后一小时2 : UVA照射后二十四小时3： UVA照射后七十二小时,贯叶连翘提取物光毒试验结果(豚鼠耳朵),A:对照组UVA照射后六天;B:补骨脂素160mg/kg组UVA照射后六天;C:路优泰1.2g/kg组UVA照射后六天;D:贯叶连翘提取物1.2g/kg组UVA照射后六天;E:贯叶连翘提取物0.6g/kg组UVA照射后六天,4.局部毒性,概念：药物（外源性化合物）在与机体 第一接触部位产生的毒性（损害）作用。,5.全身毒性,概念：药物（外源性化合物）进入机体 经吸收和分布到达靶器官或全 身，产生的毒性作用。特点：对机体各器官损伤的程度不同。,6.可逆和（或）不可逆毒性损伤,特点：药物（外源性化合物）进入机体产生毒性作 用的可逆与否，主要取决于受损病理组织修 复和再生的能力及程度。 可逆性损伤：如肝脏细胞、肠上皮细胞 不可逆损伤：中枢神经系统细胞、致癌、致突变、马兜 铃引起的肾损害,7.即刻和滞后毒性,概念： 即刻毒性：一次给药后在短时间内 （5%) 症状：轻度不易观察。肝重增加、体积增大、变硬、表面和切片 滑腻、光镜可见细胞内大量脂滴、苏丹染色阳性。 原因：酒精中毒、营养过剩或不足、中毒 机制：脂蛋白的蛋白质部分合成受阻（高剂量四环素、乙硫酸） 极低密度脂蛋白的磷脂部分合成受阻 细胞内丢钾，脂肪的运输受阻,胆汁淤积 有肝外淤积、肝内淤积 氯丙嗪、红霉素、雌激素、五色梅 机制： 干扰或阻断胆红素正常代谢过程 胆汁分泌减少 胆汁流动障碍 例：a 萘基异氢基酸脂（工具药） 大鼠小鼠均可看到与剂量相关的淤胆改变。24-48小时有相应改变。,血管损伤（小静脉闭塞综合症） 微小静脉内膜受损、炎症-静脉壁水肿坏死，血管壁纤维化、管腔堵塞。 药物：砷、喹啉类生物碱、菊三七,肝硬化 细胞变性坏死、纤维组织增生、颗粒状硬结 三种病理改变交错进行，肝小叶结构和血循环途径改建，肝变形变硬。 四氯化碳（工具药）,诱发肿瘤 黄曲霉素、黄樟醚、千里光碱、苏铁苷、生物碱与亚硝胺结合物 机制：使体细胞核DNA螺旋紊乱 活泼双键、环氧结构具烷化作用,（二）药物性肝损害的机制和易感性,药物性肝损害的机制 直接作用（与剂量有关） 宿主对药物的特异敏感性（与剂量无关）肝毒性发展的两个主要因素： 1. 混合功能氧化酶活性（将乙酰物水解，水解物以共价键与肝脏大分子结合） 2.肝内谷胱甘肽含量 肝脏对药物损伤的易感性1.肝脏对药物损伤的易感性：药物代谢、聚集2.机体对肝损伤的易感性,四、中药肝脏毒性的评价,（一）能引起肝毒性的中药 1. 引起肝毒性的中药 姜半夏、桑寄生、蒲黄、光慈姑、天花粉或其注射制剂可引起肝功能异常； 千里光可造成肝内血管闭塞； 野百合提取物野百合碱等会引起急性肝炎。,川楝子、苍耳子、草乌、黄药子、蓖麻子、雷公藤煎剂可致中毒性肝炎； 复方青黛丸、壮骨关节丸、华佗再造丸、大活络丹、小柴胡汤等导致肝损害。 大黄、泽泻或静脉注射或滴注四季青注射液，会引起胆红素代谢障碍导致黄疸。 引起肝毒性的中草药还有：昆明山海棠、千里光、艾叶等 。,2. 生物碱引起的肝毒性（1）吡咯双烷类生物碱 千里光属、豆科野百合属 表现为肝细胞坏死、轻度脂肪聚集和肝静脉小分支的阻塞性损伤。 损伤机制可能是由于吡咯衍生物与DNA和其他细胞成分反应损伤肝实质细胞和肝血管。,原因：所有吡咯双烷生物碱含有吡咯双烷类的核心结构，由两个带4位氮原子的五环分子融合组成，其肝毒性衍生物是1-羟甲基-1,2-脱氢-7-羟基吡咯双烷酯。毒性在于其1、2位不饱和性和与分支链酸的酯化作用。（2）其他生物碱：八角枫、北豆根、喜树,3. 黄樟醚的肝毒性 黄樟醚是肝微粒体酶的强抑制剂，在体内它能羟基化成致癌作用强于母体的1-羟基黄樟醚。4. 黄药子的肝毒性 它对肝脏的损害属于对肝细胞的直接毒性作用，是药物及其代谢产物在肝脏达到一定浓度时，干扰细胞代谢的结果。,5. 蛋白毒素引起的肝毒性（1）苍耳子 含有毒蛋白、毒苷等，是一种细胞质毒。（2）蓖麻子 含蓖麻毒蛋白及蓖麻毒碱 ，蓖麻毒蛋白是一种免疫毒素,是与植物毒素或细胞毒素共价结合的细胞结合性抗原或抗体。能抑制真核细胞的蛋白质合成。LD50为6-12mg/kg,6. 鞣质的肝毒性 鞣质及其他聚酚类的植物成分在体内催化亚硝酸盐和二级胺发生反应，形成有致癌作用的N-亚硝胺。7. 其他类的肝毒性:大黄、苦楝皮,（二）肝毒性的安全评价方法 整体动物实验 体外试验方法,1. 整体动物实验常用的方法（1）大体解剖检查与称重重量计算脏器指数（2）血液生化学检查 ALT、AST、ALP、LDH（3）肝脏生物化学成分和代谢过程检查 三酰甘油、肝蛋白、肝糖原 脂质、GSH、丙二醛（4）胆汁排泄功能试验：BSP（磺溴钛）排泄（5）形态学检查,2. 体外试验方法,（1）肝匀浆:测定线粒体中Ca-Mg-ATP酶、微粒体中P450 3型前胶原等细胞外基质（2）肝脏灌流：4小时为宜，测灌流液中酶、离子（3）游离肝细胞法：用胶原酶将肝细胞分离，成悬浮肝细胞。检查细胞大分子变化，如：抑制蛋白质和RNA的合成、增加DNA的合成、肝细胞的活性和生长。,（4）原代培养肝细胞方法：可进行多种指标的观察（5）肝细胞细胞器方法：探讨作用靶点 微粒体、线粒体 细胞核、核膜、溶酶体（6）肝脏切片,（三）方法学评价 定性、定量评价：显微镜 体积、表面积、密度 生化指标,肾脏毒性及安全性评价,一、组织学及生理学基础,（一）肾脏的组织学特点（二）肾脏的生理功能 1. 生成尿液，排出代谢废物、毒物和药物 2. 调节体内的水分和渗透压 3. 调节电解质的浓度 4. 肾脏的内分泌功能 分泌肾素、红细胞生成素（EPO）、1，25-二羟胆骨化醇、缓激肽与前列腺素,二、肾毒性反应及机制 （一）药物导致肾损害的原因和毒性作用机制,1. 肾毒性与肾脏组织学和生理特点有关 * 肾脏血流量接受循环血流最多，通过药物量较多 * 具有丰富的毛细血管，易发生抗原抗体复合物沉积 * 近端小管的分泌和重吸收作用 * 肾髓质的逆流倍增机制使乳头部药物浓度增高 * 肾小管pH改变，导致药物在肾内沉积 * 肾脏浓缩尿液，肾小管内药物浓度增加 * 药物排泄时，肾脏多种酶活性被抑制或灭活,2. 药物引起肾毒性的作用机制 * 药物对细胞的直接作用（汞、氨基糖苷类） * 与谷胱甘肽的结合作用 * 共价结合（四氯化碳）. * 免疫性因素 * 金属硫蛋白的保护作用减弱（镉）,（二）肾毒性类型及特点,1. 肾脏的病理反应 急性肾衰竭、慢性肾衰竭、位点选择性损害（肾小球损害、近曲肾小管损害、肾病综合征、慢性间质性肾炎）2. 肾脏对药物毒性损伤的易感性3. 肾毒性损伤后的适应,三、中药对肾脏的毒性及评价,(一）常见引起肾脏毒性的中药 关木通、草乌、雷公藤、斑蝥、土牛膝、巴豆、蜈蚣、蜂毒、朱砂、益母草、苦楝皮、防已、厚朴、花粉等 1. 含马兜铃酸类中药引起的肾毒性 马兜铃酸（硝基菲类）的毒性机制，有细胞毒假说、肾缺血假说、免疫反应假说、AA-DNA加合物致病假说。,一般认为，马兜铃酸可能通过以下途径导致各种肾损害：（1）短期内大剂量AA作用于肾小管上皮细胞，可致该细胞坏死及凋亡。（2）小剂量AA作用于肾小管上皮细胞，可使该细胞变性及萎缩，出现肾小管功能障碍。（3）小剂量AA反复作用于肾小管上皮细胞，也可激活该细胞甚至使其活化，活化的肾小管上皮细胞可释放TGF-等因子，通过细胞间“串话”作用于肾间质成纤维细胞，使其激活分泌细胞外基质，导致肾间质纤维化，转分化成纤维细胞，还能直接分泌细胞外基质，加重肾间质纤维化。,（4）AA还能通过肾小管进入肾间质，直接刺激及激活间质成纤维细胞，分泌细胞外基质，导致肾间质成纤维化。2. 常见的引起肾毒性的中药 光慈姑(秋水仙碱）、雷公藤（甲、乙素）、苍耳子（苍耳苷、毒蛋白）、羊齿（莽草酸）、斑蝥（斑蝥素）、白降丹（氯化汞）,（二）肾毒性评价方法,1. 形态学检查：大体解剖与称重、镜检、电子显微镜2. 肾功能试验：尿液收集、密度（或渗透压）、蛋白尿、 尿糖、尿沉渣镜检 3. 血液生化分析：BUN、Cr4. 尿酶活性分析（LDH、ALP、LAP、NAG等）5. 肾脏清除功能试验：GFR（肾小球滤过率） RPF（肾血流量）6. 肾小球-肾小管损伤标志物的组合分析7. 体外试验：肾片、肾灌流技术、游离肾细胞,（三）方法学评价 1. 方法学评价：整体实验为主 2. 毒性评价；系列实验,神经系统毒性及安全性评价,一、组织学及生理学基础血-脑脊液屏障及脑的能量代谢特点耗氧量1/5，能量需求高二、神经系统的毒性反应及机制 （一）神经系统的毒性反应：神经原、轴束、髓鞘（二）神经毒性的作用机制,（二）神经毒性的作用机制,1.神经递质:递质摄取和降解障碍,干扰储存和释放.2.受体:影响细胞内信号传导.(钙、CAMP/CGMP)3.胶质细胞:,三、中药的神经毒性及安全性评价,(一）生物毒素的神经毒性作用中药本身所含的生物碱、酸或其他有机成分具有神经毒性，如阿托品碱、天仙子胺、藏红花碱。马钱子，能引起惊厥、脊髓反射增强，以至失去对正常运动细胞刺激的抑制作用。,鬼臼毒素10-15mg/kg出现神经毒性作用，表现为脊髓前角运动神经元水肿，较严重的、长期性的损伤可出现在脊髓背角神经元、中枢神经轴突以及周围神经系统，脊髓后根神经元表现为尼氏体消失。,(二）重金属毒性（1）中药本身含重金属药，如朱砂（2）中药重金属残留 铅中毒的神经病变包括血管损害、脑水肿，且铅对运动神经的毒性比感觉神经大。,（三）中药中的农药残留 （四）中药神经毒性的评价 临床评价:脑损害、颅损害、脊髓损害、神经肌肉损害、 精神障碍。 动物研究：结构和神经病理学终点 神经生理学终点 神经毒的化学终点,1.结构或神经病理学终点（1）大体形态变化，包括脑重量改变。（2）神经元或神经胶质的组织学改变（神经元病变、轴突病变、髓鞘病变）。 在细胞水平神经毒性作用表现为神经元的染色质溶解、空泡变、细胞死亡；轴突损伤表现为轴突肿胀、变性和萎缩；而髓鞘改变可表现为折叠、水肿造成的撕裂、脱髓鞘。,2.神经毒性的神经生理终点（1）神经传导研究（2）感觉、运动及其他激发潜能研究（3）疾病发作和惊厥（4）脑电图3.神经毒性物质的化学终点 影响神经元内的离子平衡；封闭神经递质和其前体的回收；过度刺激受体；封闭神经递质释放；抑制递质的合成和代谢酶。,造血系统毒性及安全性评价,一、组织学及生理学基础(一）造血器官：胚胎期、出生后 (二）血细胞的发育：造血干细胞阶段、造血祖细胞阶段、原始细胞及幼稚细胞阶段 （三）造血调节：造血微环境、造血调节因子,二、造血系统毒性反应及机制(一）粒细胞减少症和粒细胞缺乏症 (二）再生障碍性贫血 （三）纯红细胞性再生障碍性贫血 （四）缺铁性贫血 （五）溶血性贫血：免疫性、非免疫性 （六）血小板减少性紫癜 （七）过敏性紫癜 （八）弥散性血管内凝血 （九）药物相关性白血病,三、中药对造血系统的毒性及评价(一）中药对造血系统的毒性 粒细胞减少症、粒细胞缺乏症、再生障碍性贫血、纯红细胞性再生障碍性贫血、缺铁性贫血、溶血性贫血、血小板减少症,1.对粒系细胞的毒性（1）雷公藤急性粒细胞减少、血小板减少、红细胞减少、再生障碍性贫血和弥散性血管内凝血等。雷公藤的毒性化学成分一般认为是生物碱及有细胞毒的二萜类环氧化合物。（2）青风藤引起粒细胞减少或粒细胞缺乏症（3）八角莲主要毒性成分为鬼臼毒素，可致血小板减少、白细胞减少。（4）光慈姑含秋水仙碱等多种生物碱，抑制骨髓而导致粒细胞缺乏症和再生障碍性贫血。,2.对红系细胞的毒性（1）雄黄 可使红细胞形态改变，并抑制白细胞的产生。机制可能与硫化砷（As2S2）进入体内和组织中的巯基结合干扰组织代谢，引起血细胞再生不良有关。（2）大黄 可引起缺铁性贫血，主要是大黄所含鞣酸与铁结合成不溶性复合物，妨碍了铁的吸收以及大黄的导泻作用干扰了铁的吸收所致。,（3）铅丹 可引起溶血性贫血。铅的溶血作用与铅抑制细胞膜ATP酶活性，妨碍水钠调节，以及铅与红细胞的结合引起机械脆性增加等原因有关。（4）蜈蚣 含两种类似蜂毒的有毒成分，即组胺样物质和溶血性蛋白质，后者可引起溶血性贫血。,3.对巨核系细胞的毒性（1）麝香、蟾酥对过敏性体质者可导致免疫反应，通过免疫机制破坏血小板（2）蝮蛇抗栓酶水解完整的血小板膜的磷脂。,(二）造血系统毒性评价方法 一般血液学检测及评价 骨髓造血功能检测及评价 （三）实验动物的选择 （四）中药造血系统毒性的评价 粒系细胞、红系细胞、巨核系细胞,心血管毒性及安全评价,一、病理生理基础(一）心功能不全 影响因素：收缩性能、前负荷、后负荷、心率 (二）心律失常 电生理机制：冲动形成障碍、冲动传导障碍 （三）脂质代谢失常,二、心血管毒性反应及机制(一）心脏毒作用机制 干扰心肌细胞代谢 心肌受体和递质改变 缺氧的间接影响 (二）血管毒性的一般生化机制 引起血管栓塞的机制：对血管内皮的损害、对血小 板、对凝血因子的影响 （三）血管细胞毒性损伤机制,三、中药对心血管的毒性及评价(一）蟾酥：慢纤维作用、心律失常、房室传导阻滞 （二）藜芦：神经毒、心脏毒性 能抑制心肌的兴奋传导，并具有反射性舒张血管的特征。,（三）黄花夹竹桃：强心苷类物质的心脏毒性。 （四）乌头碱：心血管系统损害（1）兴奋迷走神经引起窦房结抑制，房室传导阻滞，从而导致心率减慢；（2）直接作用于心肌，引起心肌兴奋性增多，引起早搏、室速、室颤；（3）抑制血管运动中枢，引起血压下降。,（五）自然存在的物质：类固醇激素、细胞因子、动植物毒素（六）溶剂：异丙醇的CNS抑制（七）重金属：镉、铅、钴,免疫毒性及安全性评价,一、免疫系统组织学及生理学基础(一）免疫系统的组成：免疫器官 免疫细胞 免疫分子 (二）免疫应答：B细胞介导 T细胞介导 （三）免疫调节 （四）主要组织相容性复合体 （五）免疫系统与神经系统、内分泌系统的关系,二、免疫毒性反应及机制(一）免疫系统的敏感性 (二）免疫系统损伤的结果和机制 超敏反应：型、型、型、型 免疫抑制和宿主抵抗力降低 自身免疫性疾病 （三）中药对免疫系统作用的特点 反应的灵敏性 反应的差异性 反应的复杂性,三、免疫毒性及评价方法(一）体内评价方法 动物实验 人类免疫毒理学 动物模型的应用 (二）体外研究方法 细胞培养：盐溶液、血清 中药的体外免疫毒性研究 转基因细胞,(三）常用的试验技术 1.病理学常规检查 2.免疫细胞的检测：淋巴细胞增殖试验 细胞毒试验 酶联免疫斑点法 流式细胞术 磁珠分离术 3.抗体的检测 4.宿主抵抗力试验：肿瘤细胞攻击试验 对病原体的抵抗试验 5.细胞因子的检测技术：生物活性检测 免疫学检测 核酸分子杂交 PCR,(四）免疫毒性的评价方案和判断 1.评价方案 2.免疫毒性的综合判断 各检测指标之间的关系 单味中药或有效成分的毒性与复方的关系 体内、体外试验的关系 动物毒性与人毒性的关系,(五）中药的免疫毒性 1.免疫器官毒性 2.巨噬细胞毒性 3.体液免疫毒性 4.细胞免疫毒性 5.超敏反应,生殖毒理及安全性评价,一、组织学及生理学基础(一）生殖系统的组成：雄性、雌性生殖系统(二）生殖生理 二、生殖系统毒性反应及机制(一）生殖毒性的表现(二）生殖毒性作用机制：亲性腺作用、亲胚体作用、 亲胎盘作用、胎期毒性、 哺乳期毒性特点：损害的多样性；生殖过程较其它系统损害的更敏感性； 损害不仅影响本身，亦影响后代,三、中药生殖毒性的评价 (一）整体动物 (二）动物选择和剂量分组 （三）性激素水平检测及性功能,（四）雄性生殖毒性实验 1. 睾丸功能检测：精子生成分析 精子穿透试验 睾丸标志酶活性的测定 2. 系列交配试验 3. 扩展交配试验 4. 显性致死试验,（五）雌性生殖毒性实验 1. 卵巢功能检测：阴道上片细胞涂片 压片法 形态检测 2. 生殖试验 3. 胚胎毒性试验 4. 胚胎毒性试验基本方法：交配时间 胎仔检查 结果评定 5. 胚胎畸形程度 6. 致畸的发育毒性作用物危险度评定,（六）体外生殖毒性试验 1. 体外培养：胚胎培养 组织培养 细胞培养 其他培养 2. 动力学分析：运动特征 精子运动的测量方法 计算机辅助的精子活动力分析系统 3. 组织病理学研究 4. 睾丸 5. 卵巢 6. 畸胎,（七）生殖细胞遗传毒性评价 1. 显性致死试验 2. 可遗传易位试验 3. 形态特殊位点试验 4. 生化特殊位点试验 5. 隐性致死试验 6. 白内障诱发试验 7. 细胞遗传分析 8. 非整倍体性 9. 生殖腺暴露,（八）中药生殖毒性 1. 雷公藤 2. 棉酚 3. 昆明山海棠 4. 苦瓜 5. 川楝子 6. 天花粉 7. 其他,中药内分泌毒性及其评价,(一）甲状腺 1.干扰甲状腺激素的合成或甲状腺的分泌功能 （1）甲状腺激素合成抑制 （2）甲状腺激素分泌的抑制 2.肝微粒体酶的作用 3.脱碘酶的抑制作用(二）甲状旁腺(三）睾丸(四）卵巢,三、内分泌毒性的评价(一）体内试验 1.病理组织学检查 2.内分泌功能检测 3.转基因动物的应用 (二）体外检测方法 (三）中药对内分泌系统的毒性作用,呼吸系统毒性及安全评价,一、呼吸系统组织学及生理学基础(一）呼吸道：鼻咽喉、气管和支气管、肺 (二）呼吸的过程(三）呼吸的调节 1.呼吸中枢的调节 2.外围化学感受器的调节 肺牵张反射的调节 血液中CO2、缺氧和氢离子浓度的影响,二、呼吸系统毒性反应及机制(一）呼吸抑制 (二）间质性肺炎(三）过敏性肺炎(四）肺水肿(五）过敏性哮喘(六）喉头水肿,三、中药的呼吸系统毒性及安全性评价(一）中药的呼吸系统毒性及评价 呼吸抑制作用 肺毒性反应 气道毒性反应,(二）呼吸系统毒性评价方法 呼吸一般情况的观察 肺通气功能测定 病理学检查 生化学及免疫学检测 体外培养检测评价呼吸系统细胞毒性的指标：LDH 黏性糖蛋白 纤毛摆动频率 细胞的贴附性 测定细胞电阻 细胞因子,(三）实验动物的选择(四）中药的呼吸系统毒性评价 呼吸抑制作用评价 肺毒性的评价 气道毒性的评价,农药残留及重金属的毒性,一、环境污染与中药的毒性(一）目前我国生产和使用的农药及中毒症状 第一类：有机磷农药 第二类：氨基甲酸酯类农药 第三类：杀虫脒 第四类：溴氰菊酯 第五类：百草枯,(二）重金属 镉常与铅、锌矿共生 大气中铅污染的主要来源 含汞矿物有几十种，主要矿物是硫化汞 砷在自然界分布很广,(三）中药重金属污染(四）中药制剂中可能存在及随同用药进入体内的有毒物质 1.动植矿物药材中本身会有的毒性成分，如蟾酥、巴豆2.药材保存不当发生霉变，产生的微生物及霉菌、毒素，如黄曲霉毒素3.药材种植、栽培过程中使用的农用化学品、杀虫剂，如有机磷4.工业污染物造成土地、水质污染，药材生长过程中吸收、富集这些污染物，如重金属离子Hg、As等。,二、残留农药的毒性三、重金属的毒性 铝、铅、汞、镉、砷，等四、含有重金属的中成药 六神丸、牛黄解毒片、七厘散、安宫牛黄丸，等五、黄曲霉毒素,第三章 体外试验在毒理研究中的应用,细胞及细胞生物学实验基础,一、体外培养细胞生物学基础(一）体外培养的种类 细胞培养、组织培养、器官培养(二）体外培养细胞的种类 原代细胞、传代细胞(三）体外培养细胞的形态结构 1.细胞形态分类 贴附型（上皮型、成纤维型、悬浮型） 悬浮型 2.细胞结构,(四）培养细胞的生长过程1.培养细胞的整个生存过程 原代培养期、传代期、衰退期2.单个细胞的生长过程：细胞周期3.细胞系的生长过程4.一代细胞的生长过程5.细胞增殖能力检测指标,(五）染色体1.染色体形态2.染色体类型3.染色体特征4.染色体的损伤(六）细胞的寿命与衰老、死亡1.细胞的寿命2.细胞衰老的一般特征3.细胞凋亡,二、细胞生物学基本实验技术(一）细胞化学实验基本技术1.细胞化学基本内容：核酸、糖类、脂类、蛋白质、 酶类、胺类、特异性抗原、 无机盐 2.制作标本的基本要求3.标本片的主要制备过程,(二）体外培养的基本条件1.体外培养细胞的生存条件：营养、环境、温度、 气体、pH值、渗透压、附着底物 废物排出 2.培养用液：水、BSS、pH调整液、抗生素液和抗霉素液、消化 液、指标剂和染色液3.培养基：天然培养基、合成培养基(三）细胞培养的基本设备和器械,(四）细胞培养的基本技术1.取材2.组织分离3.原代培养4.传代培养5.细胞冻苏和复苏6.细胞运输(五）器官培养,(六）培养细胞性状生物学检测1.细胞形态的观察：活细胞直接观察、细胞固定染色 观察2.细胞生长状态的观察：细胞计数、细胞贴壁率、 细胞分裂指数、 细胞接种存活率3.免疫细胞化学技术观察4.细胞毒性的生化实验：细胞中蛋白质含量测定 DNA合成测定 DNA损伤测定,(七）细胞遗传毒性的检测 1.基因突变检测 2.染色体畸变实验 3.微核技术 4.染色体荧光原位杂交方法(八）细胞短期转化实验,(九）培养细胞免疫功能常用检测方法 1.巨噬细胞吞噬功能测定 2.NK细胞检测法（MTT法） 3.抗体生成细胞检测 4.淋巴细胞转化的检测（MTT法） 5.吞噬细胞化学发光测定,(十）体外培养技术在毒理学研究中的应用 1.研究有害因子对细胞的一般毒性 2.研究有害因子对细胞或器官的特异毒性作用 3.研究有害因子在细胞或器官中的代谢 4.研究有害因子的毒性作用机制 (十一）流式细胞术,(十二）细胞凋亡的检测概念：细胞在一定生理或病理条件下，遵守自身程序的 主动性自杀过程，是有别于细胞坏死的细胞死亡 过程。应用：研究细胞分化 细胞激活与死亡的研究 肿瘤、AIDS的研究,(十三）细胞通讯研究技术方法：电偶联法 代谢协同实验 示踪技术概念：机体细胞与细胞之间维持代谢平衡和活动的协同性， 保持体内