秦艽总苷对人肝癌细胞smmc

1 / 9秦艽总苷对人肝癌细胞 SMMC【摘要】 目的观察秦艽总苷对肝癌细胞增殖及凋亡的影响。方法 MTT 法检测秦艽总苷对人肝癌 SMMC-7721 细胞生长的影响，流式细胞仪分析细胞凋亡率，瑞-姬氏染色观察细胞形态变化。结果秦艽总苷浓度为 125，250， 500，1 000 g/ml 时，SMMC-7721 细胞的生长受到不同程度的抑制，且有时间和浓度依赖性;流式细胞术检测显示一定浓度的秦艽总苷可诱导 SMMC-7721 细胞凋亡；倒置显微镜下 SMMC-7721 细胞出现细胞凋亡的形态学改变。结论一定浓度的秦艽总苷对人肝癌细胞 SMMC-7721 有抑制增殖和诱导凋亡的作用。 【关键词】 秦艽总苷；SMMC-7721 细胞；凋亡中药秦艽味苦、辛，性平,具有清热、除湿、止痛的功效。关于秦艽药理学方面的研究证明,秦艽具有抗炎、抗菌、抗病毒、解热、镇痛、免疫调节、保肝利胆等作用19 。本研究以人肝癌细胞 SMMC-7721 为研究对象，观察秦艽总苷对 SMMC-7721 细胞的生长、细胞凋亡以及形态方面的影响，并以龙胆苦苷作对照，比较相同浓度下对细胞作用的强弱。现报道如下。1 材料与仪器样品2 / 9秦艽总苷(艽龙胶囊)购自西安正大制药有限公司，龙胆苦苷标准品购自上海华美工程公司。秦艽总苷用 PBS溶解，20 l 过滤除菌，获 1 g/ml 储备液备用；龙胆苦苷用 PBS 溶解，20 l 过滤除菌，获 104 mol/L 备用。细胞系SMMC-7721 细胞由南京中医药大学药理实验室提供。试剂胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司，DMEM 培养液购自 Gibco 公司，AnnexinV-FITC 凋亡试剂盒购自凯基生物科技发展有限公司，瑞-姬氏染液购自南京建成生物工程研究所。仪器细胞培养箱购自上海力申科技有限公司，酶联免疫检测仪购自瑞士 TECAN 公司，BD FACSCalibur 流式细胞仪购自北京希尔诚兴业科技有限责任公司。2 方法SMMC-7721 细胞培养SMMC-7721 细胞用含 10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 mg/ml 链霉素的 DMEM 培养液，在 37、5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱中培养。待细胞达 80%90%融合状态时用%胰蛋白酶消化后传代。实验期间不断冻存细胞，实验时取指数生长期细胞。3 / 9细胞生长情况测定细胞用%胰蛋白酶消化后，用 DMEM 培养液调细胞浓度为 104 个/L，每孔 90 l 接种于 96 孔培养板内，分别加入 10 l ， ，125， 250， 500，1 000 g/ml 的秦艽总苷，设 6 个复孔。并设立加 104 mol/L 的龙胆苦苷对照组，加 PBS 的阴性对照组。培养 24， 48， 72 h 后加入 5 mg/ml 的 MTT 20 l 继续培养 4h，吸弃孔内培养液后每孔加入 DMSO 100 l,使结晶充分溶解，酶标仪测其吸光度，波长 550 nm。细胞生长抑制率=100%。流式细胞仪测定SMMC-7721 细胞凋亡情况用上述方法将细胞浓度调为105/L，每孔 2 700 l 接种于 6 孔培养板内，分别加入300 l 的 1， 5，10 mg/ml 的秦艽总苷，设立 3 个复孔，并设立加 104 mol/L 的龙胆苦苷为阳性对照组，加 PBS为阴性对照组。继续培养 48 h 后，吸弃孔内培养液，收集细胞，离心，用 PBS 洗 2 次，加入 500 l 的 Binding Buffer 悬浮细胞，加入 5 l Annexin V-FITC 混匀后，加入 5 l Propidium Iodide, 混匀,室温、避光、反应 15 min 后在上机检测细胞凋亡。瑞-姬氏染色观察细胞形态将盖玻片置于六孔板内，分别 2 700 l 106 个/L 的细胞悬液，加入 1 000 g/ml 的秦艽总苷 300 4 / 9l, 并设立阴性对照组，继续培养 48 h，吸弃孔内培养液，取出盖玻片平置于染色架上，滴加复合染液 34 滴，使其迅速盖满盖玻片，染色 1 min 后滴加缓冲液 610 滴，轻摇玻片，使其充分混合，57 min 后自来水冲去染液，待干后于光学显微镜检查。 统计学处理采用 SPSS 进行数据处理。3 结果秦艽总苷对 SMMC-7721 细胞增殖的影响结果见表 1。由表 1 可见，秦艽总苷浓度为， g/ml 时无抑制作用，而在 125， 250， 500，1 000 g/ml 时有一定的抑制作用，其抑制率随浓度和时间而呈上升趋势，与同浓度的龙胆苦苷相比秦艽总苷抑制率较大。表 1 秦艽总苷对 SMMC-7721 细胞增殖的影响不同浓度秦艽总苷对细胞凋亡的影响结果见表 2 及图 12。随着秦艽总苷浓度的增加，早期凋亡期细胞比率增加。表 2 不同浓度秦艽总苷对细胞凋亡的影响细胞形态学观察瑞-姬氏染色显示，阴性对照组 SMMC-7721 细胞增殖5 / 9活跃，分裂期细胞多见，细胞核呈类圆形，边界清，染色质均匀分布呈浅蓝色，核仁明显个，细胞有伪足使细胞形态不规则，细胞密度高。秦艽总苷作用后 48h 后，SMMC-7721 细胞形态发生明显变化，细胞密度降低并出现凋亡细胞，细胞体积变小，细胞核固缩，核仁消失，核染色呈紫蓝色。见图 4。4 讨论肿瘤是严重威胁人类健康的一类常见疾病，多发病。临床治疗肿瘤西医一般采用手术、放疗、化疗三大疗法，疗效快捷，确有根治效果，但往往有明显的损伤和毒副作用。因此，寻找有效且无损伤和毒副作用的抗癌药物与方法，彻底攻克癌症，是世界医学界重要的研究课题。通过长期的研究和探索，中医药治疗肿瘤已取得了很大进展，而且中药材自然资源丰富、品种繁多、毒副作用低、价格低廉、为抗肿瘤较为理想的药物。许多国内外学者从天然药物筛选到有效单体提取做了大量研究，显示了中医药治疗肿瘤的独特优势。中医学认为,热毒是肿瘤发生、发展的一个重要因素。实验研究提示清热解毒中药通过抑制细胞增殖、诱导凋亡、分化及逆转、调节机体免疫水平、调控细胞信号通路及传导、抗突变、抑制血管生成和抗多药耐6 / 9药等多种途径发挥抗肿瘤作用10 。细胞增殖过盛和凋亡抑制被认为是肿瘤发生发展的关键，多种化疗药物均可引起细胞的凋亡11 。本实验流式细胞仪检测显示，一定浓度的秦艽总苷和龙胆苦苷作用后，凋亡前期细胞率都明显增高，并显示出在同浓度下秦艽总苷处理组抑制率大于龙胆苦苷处理组；发现秦艽总苷作用于 SMMC-7721 细胞后光镜下可观察到凋亡细胞形态学变化，证明秦艽总苷对人肝癌 SMMC-7721 细胞抑制作用的机理与诱导癌细胞凋亡有关。本研究观察秦艽总苷在体外对人肝癌 SMMC-7721 细胞增殖的影响，结果显示当秦艽总苷浓度为 125 g/ml 时即有抑制作用,随着秦艽总苷浓度的增加和时间的延长其抑制作用更加明显，表明秦艽总苷对 SMMC-7721 细胞生长的作用与药物浓度和时间有密切关系；与同浓度的龙胆苦苷相比较，秦艽总苷抑制率较大，表明秦艽总苷对 SMMC-7721细胞的抑制作用比单体龙胆苦苷更强。现代药理学研究证明，秦艽的主要成分龙胆苦苷能抑制多种炎症介质包括组胺、5-HT、LTB4、IL-1、TNF-7 / 9、PG、血栓素血小板活性因子、氧自由基等的释放，对人肝癌细胞具有杀伤效应12 。然而，氧自由基在细胞增殖、分化、逆转过程中起着重要作用。因此，GPS 及秦艽总苷抑制肝癌细胞的机理有待进一步深入研究。4李福安,李永平,童 丽,等.秦艽抗甲型流感病毒的药效学实脸研究J.世界科学技术中医药现代化,XX,9(4):41.5李艳秋，赵德化，潘伯荣,等.龙胆苦苷抗鼠肝损伤的作用J.第四军医大学学报，2001，22：1645.6Editorrial boad of China Herbal State Administration of Traditional China (中华本草)M.Shanghai:Shanghai Science and technology Publishers,1998.8 / 97李庆.秦艽醇提液的抗炎作用研究M.中国实验方法学杂志，XX，12：63.8陈长勋，刘占文，孙峥嵘，等.龙胆苦苷抗炎药理作用研究J.中草药,XX，34：814.9崔景荣，赵喜元，张建生，等.四种秦艽的抗炎和镇痛作用比较J.北京医科大学学报，1994，24225.10潘磊,陈培丰.清热解毒中药抗肿瘤作用机理研究进展J.中华中医药学刊,XX,25(3):569.11Khor TO,GuI YA,Ithnin H,et al Psitive correlation between overexpression of phopho-B