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文档简介

密级 : 论文编号 : 中国农业科学院 硕士学位论文 辐照对虾过敏原生化 性 质 及抗原性的影响 i 摘 要 食物过敏作 为食源性疾病的一种已引起了人们的普遍关注。根据流行病学调查,美国每年约有 2% 人发生食物过敏,儿童及婴幼儿的发病率约 5% 8%。澳洲每年有 600 例过敏性疾病 发生,并且在 2004 年 食品企业的召回产品中,过敏食品比例就达 47%。 据不完全统计,我国的发病率 也 较 高 。近年来,有关食源性虾过敏的报道屡见不鲜。在联合国粮农组织提出的八大类引起过敏的食物之中,虾与蟹等甲壳类动物及其制品是重要的一类 。 最近 韩 国 、德 国以及 加拿大等国报道,辐照 技术可促进 过敏原 蛋白质的降解、交联和分子构象的改变,破坏其抗原 决定簇 ,有可能成为降低食物过敏反应的技术手段。 为了探索过敏原辐照脱敏的机理 ,本 研究 以中国海 虾过敏原 为研究对象, 对不同存在 状态的 过敏原 ( 提取液、冻干粉和全虾 ) 做辐照处理 ,分析其辐照的生化效应;利用电泳技术纯化的微量过敏原免 疫动物制备高效价高特异性抗体,在此基础上分析 其 辐照 免疫学效应,探讨过敏原的辐照免疫学 分子 机理, 为我国 食品辐照 脱敏技术的研究提供 理论依据 。 虾是引起过敏反应的重要食物之一,研究发现原肌球蛋白 ( M) 是 虾中一种主要过敏原,这是一种分子量为 36热稳定性蛋白 。据 K 和 报道辐照可破坏其抗原表位,降低其致敏性 。本研究利用过敏原的热稳性及低盐离子溶液中可溶性, 成功地 对过敏原 作 了 常规提纯 。 在此基础上研究了 不同 剂量的辐照处理 对不同存在状态的 过敏 原 分子 结构、疏水性、浊度等生化性质的影响, 证实辐照改变了过敏原 溶 性、疏水性,过敏原分子发生了解聚、交联等反应,进而改变了其生物学特性。 为了进一步了解辐照对过敏原致敏 性 的影响, 在 比较 利用 不同 方法 提纯的 过敏原蛋白质 做免疫 原免疫动物制备抗体的优劣 前提下 , 设计 利用 化的虾过敏原 ( 成功地 制备出过敏原 高 效价高特异性多克隆抗体, 结合 人血清过敏原抗体 研究了不同剂量的辐照处理 对 不同 存在状态的 过敏原与患者特异性血清抗体 多 抗的 亲和性 的影响。结果发现:沸水处理后 过敏原溶液与患者特异性血 清抗体 具有很强的结合力,这证实了前人关于 道 ; 虾过敏原 ( 经辐照处理后, 患 者特异性血清抗体 鼠源多抗( 免 疫亲和力随着辐照剂量的增加而降低, 表明辐照改变了过敏原的生化特性及抗原性,致敏性降低, 并发现 溶液状态要比固体状态和 活体状态对辐照处理敏感。 研究证明辐照 改变了过敏原 空间构象,从而改变了过敏原的水溶性、疏水性等生物学特性,进而使过敏原分子发生解聚、交联、裂解等化学反应, 从而改变或者破坏过敏原抗原表位,降低了 致敏性 。 关键词: 虾过敏原 ,辐照,过敏原生化性质, 过敏原 抗原 性 a of is of in to % of % 8% of 00 of 7% in 004 to of in is by is is of of in AO of as is a 6 on be by so be a of of to by of in at 0, 3, 5, 7, 10 of on an to of to of by as of so of M to gE of to It gE of gE of to gG to M of be by to in in or in by of by 目 录 摘 要 . i . 录 . I 第一章 前 言 . 1 食物过敏的流行病学 . 1 食物过敏原 . 1 物过敏原的种类 . 2 过敏原 . 3 过敏的免疫学发生机制 . 4 辐照对食物过敏原的作用 . 5 照对食物过敏原蛋白质理化性质的影响 . 6 照对食物过敏原蛋白质免疫原性的影响 . 6 辐照技术在降低食物过敏原致敏性方面的研究概况 . 6 本研究的立题依据及意义 . 7 第二章 虾过敏原的提取、纯化及鉴定 . 9 材料与方法 . 9 剂与主要仪器 . 9 过敏原的提取与纯化 . 12 敏原的鉴定 . 13 结果与分析 . 13 敏原提取结果 . 13 敏原的鉴定结果 . 16 讨论 . 16 第三章 过敏原的辐照生化效应 . 17 材料与方法 . 17 剂与主要仪器 . 17 敏原的辐照处理 . 18 照后过敏原的浓度分析 . 19 照后过敏原的浊度分析 . 19 照后过敏原的疏水性分析 . 19 照后蛋白质分子量的测定 . 19 结果与分析 . 20 照后过敏原的浓度测定 . 20 照后过敏原的浊度测定 . 21 照后过敏原的疏水性测定 . 22 辐照后过敏原的 . 24 讨论 . 26 第四章 过敏原辐照免疫学效应 . 27 材料与方法 . 27 剂、材料及主要仪器 . 27 体的制备及其特性的鉴定 . 29 过敏原的辐照处理 . 31 过敏原的辐照免疫学效应分析 . 31 结果与分析 . 32 敏原的鉴定 . 32 体的鉴定 . 32 敏原的辐照免疫学效应 . 34 结果与讨论 . 37 第五章 结论与展望 . 38 结论 . 38 过敏原的提取 . 38 过敏原的辐照生化效应 . 38 过敏原的辐照免疫学效应 . 38 展望 . 39 参 考 文 献 . 40 致 谢 . 45 作 者 简 历 . 46 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 前言 1 第一章 前 言 食物过敏(或称超敏性 一种复发性较高的疾病, 其症状复杂、种类繁多, 且 根治困难, 影响人体健康和营养平衡 ,成为长期以来医学界的一大难题 ( 闻芝 梅等 ,1998;J,2003) 。 医学上对待过敏性疾病只是对症治疗,采用减敏疗法,但治疗时间长且效果不稳定,不能彻底根治 ( et 001) 。 严格控制食物过敏原是治疗食物过敏反应的 有效 方法,但由于食物种类繁多,特别是深加工和精加工食物没有标识过敏成分,使食物过敏者难以选择( W, et 997) 。 因此开展食物中过敏物质的降解及机理的研究 ,为研制和开发适合过敏患者食用的低敏和脱敏食品提供理论和技术 支撑,具有重要理论价值和现实的应用前景。 物过敏的 流行病学 目前,相关调查表明,全世界大约有 20以上的人,一生中患过变态反应性疾病( 995) 。 根据世界变态反应组织 2005 年 7 月的报道, 来自 30 个国家 12 亿人口中有 生过敏反应 ,发病率为 22%。 随着 科技进步和经济的发展,远源杂交、转基因技术的发展及食品添加剂的使用 , 食物过敏原已成为食品安全的隐患之一 。根据流行病学调查,近年来过敏症发病率呈逐年上升的趋势 ( 16 届妇幼营养会 ,2006; et 001;卢大用等 ,2000) 。 我国的发病率 近年来也 在 激增 ( 胡燕 等 ,2005) 。并 且随着现代食品生产、流通、消费方式的改变,传统的食物过敏的地域性打破,使得食物更具备了潜在的 致 敏 危险性 ( R, et 996) 。食品过敏在相当大的程度上危害着过敏人群的健康,保护消费者食品安全已经成为食品安全管理部门及食品生产企业所面临的重要问题。 近年来婴幼儿的过敏症发病几率激增,其中由食物引起的过敏最为突出。 在发达国家每年约有 2% 婴幼儿发生牛奶过敏 ( 叶世泰 等 ,1986) 。 引发过敏的原因很复杂,并且与生活习惯、饮食习惯以及环境的变化有着 一定的关系。研究表明,空气污染、废 弃 物的排放 等均可诱发过敏反应, 另外气候状况对花粉等空气悬浮物引发过敏性疾病 也 有重要的影响 ( 陈祝 ,1997) 。 过敏性疾病 的 发生具有很强的年龄特异性,其中 婴幼儿对过敏反应的敏感性较成年人高 ( et 989) 。 过敏反应 也具有 很强的个体差异性,这与家族的遗传基因有着直接的关系 ( ,et 980) 。 物过敏原 过敏反应是由过敏原入 侵人体 而致,引起过敏反应的变应原一般为具有酸性等电点( 蛋白质或糖朊。分子量 大多 小于 70000些蛋白质通常具备穿过粘膜表面而易被 肌体吸收的 特性,如:水溶性、小的分子量等 ( et 997) ,但 这 些特性并不是过敏原所特有的,因为非过敏原 蛋白质 同样可具有这些特性。 过敏性 食物之间之间可发生许多交叉反应, 这些 交叉反应常发生在相近的食物之间,以上交叉反应的确切性质还不清楚,可能由于具有相同的结构及功能特性。相关研究表明过敏原蛋白质对蛋白酶、酸、热的降解作用有耐受性,有的可抵抗肠道消化酶的作用,有的还可抗辐射, 例如, 芹菜中的 具抗辐射的特性,而桃中 虾中 a l、 花生中的 是热稳定性 过敏原。 过敏原在食品的加工处理中表现出极中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 前言 2 大的稳定性,通过一般加工手段如 加热、 超高压、烘烤、干燥 处理 后其致敏活性仍然存在,尚具备一定程度的致敏性, 使之成为 食品安全上的一个难题。 物过敏原的种类 在儿童和成人中, 90%以上的过敏反应是由八种或八类,共 170 种富含蛋白质的食物引起的,这些食物包括:蛋类、花生、乳类、黄豆、小麦 ( T et 003) 、树果仁、贝类(包括甲壳类和软体动物) 、 鱼等 ( et 989) , 这些食物中的 主要 过敏原的本质及结构也已确定。其中日常生 活中常见的 易引发 过敏反应的食物有:牛奶、海产品类、蛋类。牛奶是婴幼儿中常见的 致敏性 食物之一, 牛奶中 有大于 40 种蛋白质具 致敏潜力 ( ,et 990) ,其中的几种蛋白质(如表 1)是引发过敏的主要致敏原,这些蛋白质在婴幼儿食用时易发生过敏反应,主要是因为儿童的小肠渗透性高,容易被吸收,而成人中发病率相对较低 ( et 987;et 993) 。海产品则是又一常见的致敏性食物,它在各个年龄段的人群中都可发生,没有年龄的特异性。 在引发过敏的 海产品中虾类等甲壳类动物 是 较为常见的, 它的过敏原主要是存在于肌纤维中的一种原肌球蛋白( a l) ( et 990) ,分子量 34 36电点为 et 994) , 这是一种热稳定性蛋白, 在生物体中为二聚体双螺旋结构。 韩国原子能所在利用 辐照 破坏其致敏性的研究中 ,发现其对辐 照 敏感 ( W,et 999) 。 现已确定 表 1. 几种常见食物中的过敏原 ( ,1997) 物 来 源 过 敏 原 鸡 蛋 卵清蛋白 ( 溶菌酶( 类卵粘蛋白( 卵运铁蛋白( 卵粘蛋白( 牛 乳 酪蛋白( 乳球蛋白( 乳清蛋白( 牛血清白蛋白( 贝壳类 原肌球蛋白( 鲟 鱼 钙离子螯合蛋白 ( c l) 芥 菜 a I; j 豆 大豆球蛋白 ( 大豆植物凝血素 ( 花 生 植物凝血素 ( 999) 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 前言 3 几 种软体动物的过敏原均为原肌球蛋白,它们之间具有交叉反应特性,甲壳类动物的主要过敏原也是原肌球蛋白,但其中还有其它具致敏特性的蛋白小肽段, 这些小肽 通过酶处理可 丧失 致敏性。日本和欧美国家学者报道食用牡蛎 的过敏原为一种富含 缺少 原肌球蛋 白,分子量为 86同时 发现对虾、龙虾、蟹 等甲壳类动物的过敏原也是原肌球蛋白( 如表 2)。中 国学者赖荷等报道中国罗氏虾除 ,还含有分 几种过敏原, 推测可能是虾 品 种差异引起的 ( 赖荷等 ,2004) 。此外蛋类过敏在生活中也很常见, 现已确定 蛋 中共 有五种致敏性蛋白 ( W, et 002) ,其中 蛋白溶菌酶( 卵清蛋白( 卵粘蛋白( 类卵粘蛋白( 的致敏性强弱顺序为 人认为 主要 过敏原,而有人认 为 敏原( et 002) 。 另 据韩国学者报道类卵粘蛋白( 卵粘蛋白( 热和辐照 均很敏感。 近来随着转基因食品的发展,其中导入基因表达的蛋白质的致敏性成为 食品安全领域又一大重点 ( 贾士荣 等 ,1999) 。根据国际生命科学会( 表在食品科学与营养述评杂志上的报告 ( 996,36( s) ) ,针对于转基因食品已确定了 8 种常见的和 160 种较不常见的 致 敏性食物。除此之外,过敏原还 有非蛋白质类如医用药物:青霉素 、普鲁卡因和有机碘等,当其进入人体 可以与体内蛋白质结合 成为变应原引发机体的免疫反应 ( , et 002) 。动物血清制备的抗毒素作为异种蛋白进入人体 也可引起一级超敏反应。 研究食品加工过程中的 美拉德 反应 ( 时发现 反应后的食品具有致敏性,但是否为 应的产物所引起的还有待于进一步的研究证明 ( et 997) 。 过敏原 虾中过敏原有多种, 1981 年 et 先提取到一种被称为 的 过敏原,这是一种糖蛋白 ( ,et 995) ,分子量约 38电点 类含量约为 此 后人们又 在生虾中提取到分子量为了 21蛋白质 ,这是一种 具有两条多肽链 二聚体结构的蛋白质。 提取到了两种分别称做 过敏原,除这两种过敏原外,还发现一种 具有致敏性,但是否为 过敏原还有待于进一步的研究证明( 000) 。继此之后国外研究者从 4 种虾中分别纯化出相对分子量为 36原肌球蛋白。 在研究中人们 发现 、 原肌球蛋白有着很大的同源性( ,B. et 1994. et 003) , 人们通过大量的实验证实从虾中分离出的原肌球蛋白 ( M) 是虾中主要的过敏原( a 1),这种 36白质占煮过 的虾粗提液可溶性蛋白的 20%,含糖约 997;997)。根据国际免疫学学会过敏原专业术语的要求( 将这种过敏原定名为a 1。目前人们认为 a 1 是虾中普遍存在的一种主要过敏原。 中国 青岛海洋大学也从凡纳滨对虾、克氏螯虾、口虾蛄几种不同亚目的虾中提取出 36主要过敏原(李振兴等 ,2005)。 随着 过敏研究的进一步深入,国外和我国台湾有关报道发现 白虾 的主要 过敏原分子量 为29 36度对虾含有 34 种 致敏原;红虾 中的一种分中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 前言 4 子量为 39蛋白 质 为主要致敏原。 2004 年中国学者赖荷等在 中国罗氏虾的研究中发现其粗提液的电泳图上存在 12 条致敏条带,其主要的致敏组分在大分子区段,分子量分别为 四条带与过敏性疾病患者血清特异性 抗体 反应 呈阳性,反应率在 100%56%(赖荷等 , 2004)。 另外 , 虾中除 a 1 这一主要的过敏原外还存在 其它的过敏原 。 1990年 et 究证明虾中至少存在 13 种过敏原 ( Y,et 993) ,分子量范围在 16166过免疫学实验证明大于 82%的虾过敏个体对 a 1 有过敏性反应 ( et 9861990) , 而 与 其它过敏原的 反应 率 均低于 50%。 表 2. 海产品中主要的过敏原 ( ,2003) in W al s 1 on 敏的免疫学发生机制 食物过敏是指食物中的某些物质进入机 体后,体内的免疫系统将其视为入侵的病原,发生免疫应答,从而引发不良的机体反应,影响健康 ( P,et 995) 。 医学上将 过敏称为变态反应,是指机体受抗原(包括半抗原)刺激后,产生相应的抗体或致敏淋巴细胞,当再次接触同一种抗原后在体内引起体液或细胞免疫性反应, 在数分钟至数小时内 引起 急性炎症反应,并由此导致组织损伤或机体生理机能障碍。 食品过敏原的免疫效应机制是以 导的 I 型超敏反应为主要效应,包括致敏和发敏两个阶段。参加反应的成分涉及 到过敏原 体、肥大细胞( C)、嗜碱性粒细胞 ( 和 体( )。主要由 体介导,以肥大细胞( 嗜碱性 粒细胞 ( 为关键的效应细胞,它们释放的生物活性物质如组胺、激态原酶、趋化因子、细胞因子、白三烯等是引起各种临床病症的分子基础。当过敏原通过呼吸、消化道、注射等途径进入机体, 过敏原 选择性激活 胞,诱发其分泌细胞因子 在 来 源 过敏原 鱼 鲑 鱼 褐 虾 龙 虾 蟹 对 虾 鱿 鱼 鲍 鱼 c 1; s 1; et e 1; om a 1, ha f 1, en a 1; od p 1; al m 1 6 38 49 1975 et 1996, et 1994 et 1998 et 1998b et 1994 et 1996 et 1997 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 前言 5 及 胞产生 的 起拮抗作用 ) 协调作用下诱导 产生 体。 产生依赖于 T 细胞的复杂调节机制活化特定的 B 细胞克隆,诱导抗体的类型转换。研究认为 细胞可能也影响 生成。一定量的过敏原可诱导易感个体产生足够量的 过血液循环分布全身,并与 表面特定的受体结合,从而使机体处于致敏状态。 有很强的亲细胞性,结合有 为致敏靶细胞,当 细胞表面逐渐消失时,过敏性也随之 消退。由于 亲细胞性具有种属特异性,所以在接触过敏原时反应出群体的 差异性。 体有两类: 和 。 介导过敏反应 ; 而 在低水平 况下起正调节作用,高水平 况下则起负调节作用。当过敏原与致敏靶细胞上 合后,细胞表面两个以上 子结合导致受体交联,聚合受体通过 序 ( 免疫球蛋白受体酪氨酸活化基序 ) 传递细胞信号活化细胞内 蛋白酪氨酸激酶 ) , 通过信号传导等一系列生化反应释放颗粒内容物, 动一系列复杂的生化反应,肥大细胞与嗜碱细胞被活化后释放生物活性物质如组胺等引起小血管扩张 , 血管通透性增加 , 平滑肌收缩 , 粘膜体分泌增强 , 支气管收缩 ( 如表 3) , 从而引发过 敏反应。 表 3. 几种活性物质及其所引发的不良反应 ( 龚非力 ,2002) 活性物质 不良反应 组胺 小血管扩张,毛细血管通透性增加 , 平滑肌收缩,粘膜腺体分泌增强 激肽原酶 平滑肌缓慢收缩 ,强烈扩张血管, 增加局部毛细 血管通透性 , 吸引嗜酸粒细胞和中性粒细胞引起疼痛 嗜碱粒细胞趋化因子 趋化嗜酸粒细胞 前列腺素 血管扩张,支气管收缩 白三烯 ( 支气管平滑肌收缩,支气管痉挛,腺体分泌增强,毛细管通透性增强 血小板活化因子 支气管收缩,血小板聚集 细胞因子 诱导其它细胞释放多种细胞因子和其它炎症介质 照对 食物过敏原的作用 早在 1895 年,德国科学家伦琴发现射线,就开始了人类对高能射线认识和利用的研究,1921 年发现辐照可改变蛋白质结构与性质, 1898、 1899、 1961 年科学家相继证明高能射线对病中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 前言 6 源性细菌、原生虫及昆虫具 破坏致死作用 ( 夏臻日 等 ,1996;梁宏斌 ,2002) 。至今为止,食品辐照贮藏技术已有 60 多年的历史 ( 李承华 ,1988;M,et 989) ,已成为一种比较成熟、应用较广的技术。食品辐照技术在我国也 经过 历了 40 年 的 发展 ( 高美须等 ,2003;汪勋清等 2002) ,现已发展成为促进食物卫生和安全的重要技术之一。 照对食物过敏原蛋白质 理化性质的影响 电离辐照对蛋白质 生物学效应的原初过程研究认为,生物“环境”中存在着大量的水,水辐照产生的自由基是对生物分子造成伤害的主要因素之一 ( 哈益明 ,2000) 。 水电离产生的自由基可 使蛋白质分子发生诸如脱氨、脱羟、交联、降解、硫氢键氧化等一系 列复杂的化学反应 ( 高美须等 ,2003) 。这使蛋白质中的部分氨基酸发生分解或氧化 , 蛋白质 的生物化学性质发生改变,部分蛋白质大分子还会发生解聚、交联、裂解以及空间结构、构象的改 变,破坏蛋白质在生物体中的 结构,蛋白质的 生物学 功能结构遭到破坏 , 丧失 生物活性 ( et 998) 。 另外我国学者李淑荣等报道,辐照处理鲤鱼时其中蛋白酶的活性先增后减,这 可能影响 其中蛋白质化学及生物学性质 ( 李淑荣等 ,1997) ,综上所述我们可以认为辐照对蛋白质等生物大分子的影响是在自由基作用的基础上,各种物理化学因 素综合作用的结果 ( W,et 990) 。但是自由基、水合电子等 作用于 蛋白质 分子 的微观机理尚不完全清楚,特别是在分子水平上对蛋白质分子的损伤机理还不清楚 ( et 001) 。 照对食物过敏原蛋白质 免疫原性的影响 过敏原 蛋白质在被人体吸入时,在体内被消化分解为小的肽段,其中具致敏的肽段穿过人体粘膜屏障接触到免疫系统,引起免疫应答。过敏原激发免疫反应时,必须具备免疫原性;从微观角度上来看,过敏蛋白的分子中需具备 B 细胞和 T 细胞两种抗原表位也即抗原决定簇(大约是 16 18 个氨基酸残基),才可激发机体的免疫应答从而引发过敏反应。辐照可使蛋 白质等生物大分子发生解聚、交联、裂解以及空间结构、构象的 改变, 继而 抗原决定簇遭到破坏,过敏蛋白原有免疫原性丧失 , 机体的免疫细胞接收不到足够的生物信息或无法识别抗原分子 不 能引发机体的 免疫应答,从而免于发生过敏反应引起疾病 ( 龚非力 ,2002) 。 照技术在降低食物过敏原致敏性方面的研究 概况 当前,国际和国内辐照脱敏方面的研究刚刚开始,科学家们在辐照脱敏的生物化学效应及免疫学效应方面做了一些探索性的研究。 1999 年韩国原子能研究所利用光 谱学、单克隆抗体( 过敏患者阳性血清抗体 下简称 间接竞争酶联免疫实验( 泳对虾 蛋类卵粘蛋白( 牛奶 等过敏原做了辐照处理 ( et 001) , 发现辐照可以降 低 过敏原的致敏性。日、韩等国的研究还发现虾过敏原对酶解及辐照处理表现出 敏感性, 日本学者 ( et 005) 利用蛋白酶处理 虾过敏原, 发现虾过敏原对酶解较为敏感,经 三种蛋白酶处理的龙虾过敏原,部分或全部丧失了致敏性,但经酶处理后可产生苦肽,降低蛋白质的质量。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 前言 7 2002 美国有研究报道 电子束 辐照对 螨、链格孢菌等致敏原也有破坏作用,并进一步做了免疫机理研究(如表 4) ,发现电子束辐照对几种过敏原的抗原表位均有破坏作用,使其丧失了致敏活性 ( et 00) 。德、加拿大等国的研究小组也做了相关的研究,证明辐照对牛奶、蛋和虾等中的食物过敏原有破坏作用 ( ,et 994。 但 有关学者在 芹菜、杏仁和腰果的辐照研究中,发现辐照对此类植物源性 过敏原的稳定性和致敏性影响不大 ( et 997) ,这是否为植物源与动物源的差异 所致,还有待于进一步的研究证明。我国在 过敏原的研究上做过一些工作(李宏等 ,2001),对有关引起过敏的食物过敏原做了鉴定分析(赖荷等 ,2004):如罗氏虾及花生等的过敏原成分鉴定和分析,但 辐照脱敏方面的研究还未见报道。 表 4 几种过敏原的 辐照 生物学效应 on 敏原来源 辐照 处理 结 论 项目研究组 鸡蛋 照 可有效降低 敏性 韩国原子能研究 虾 照 可使 敏性降低 同上

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