【毕业学位论文】（Word原稿）黄瓜性型遗传规律及性别决定相关基因的分布和表达研究-蔬菜遗传资源与生物技术硕士论文

I 摘 要 黄瓜 (.)属葫芦科（ 、 甜瓜属（ 、 一年生草本蔬菜作物。黄瓜 是世界性的重要蔬菜。我国是世界上黄瓜栽培面积最广 、总产量最高的国家。 雌花节率的高低是影响黄瓜产量的重要因素。同时，利用黄瓜全雌性品系能极大地简化杂交种的制种工作。由于黄瓜性别表现和遗传机制的复杂性，利用传统的方法进行性别调控和雌性的育种效率不高。因此深入研究黄瓜性 型 的遗传规律，认识黄瓜性别决定相关基因在不同性型黄瓜种质资源中的分布及表达特征，对全面理解黄瓜性别分化 的机理，加快雌性品系的选育具有重要的意义， 同时 可为性别决定基因的分离克隆、体外重组与遗传转化奠定基础。本试验从三个方面进行了研究，得到如下研究结果 ： 强雌性系“ 1613别与普通性型株系“ 交、自交 和回交 ，获得了两个组合的 个群体。通过对各组合 世代植株性型的定性观测，并经 2 测验，发现全雌和强雌性状 分别 由一对不完全显性等位基因控制。以两个组合的 体的数据为基础，进一步对性型进行了数量遗传学的分析，表明全雌性性状 和 强雌性性状均是由一对主基因控制，而且存在微效多基因。在全雌性组合中，主基因的遗传率为 微效多基因的遗传率为 在强雌性组合中，主基因的遗传率为 微效多基因的遗传率为 法，检测了黄瓜性别决定相关基因 化酶基因 乙烯受体基因 78 份不同性型的黄瓜材料中的分布，发现这 5 个基因均存在于所有材料 的 基因组 中，不具有 性 型 特异性。还对 行了克隆， 序列分析证明 扩增 产物正是 酶基因 明多数学者认为的有雌性特异性的结论不具有广泛的适用性。 法研究了 酶基因 化酶基因 烯受体基因 全雌性材料“ 强雌性材料“ 1613“ 106普通性型材料“ 西双版纳黄瓜“ 或不经性别诱导处理后 8个时间段的 表达特征。结果发现，就每一个基因在不同性型材料中的表达来看， 酶基因所有样品中均未表达，说明该基因在苗期的自然表达与否，与后期植株的性型表现没有直接的关系，与前人的研究结果基本一致。 化酶基因大多表现瞬时或间歇性表达，且仅在 全雌性材料和普通性型材料中，表现了与雌性的一定程度的协同关系。 乙烯受体基因 强雌性材料“ 106瞬间表达，硝酸银明显抑制了其表达，而在普通性型材料中均未表达，表现了与雌性材料的特异协同关系；乙烯受体基因 所有样品中均有表达，且硝酸银能抑制其表达（除“ 1613），乙烯利促进其表达，其在 5 个材料中的表达与雌性的表现有 一定 的相关性。就所有基因在同一材料中的表达来看，在全雌性黄瓜材料中， 化酶基因 烯受体基因 个雌性相关基因得到了表达，并且均表现了与雌性的相关性。在强雌材料“ 1613， 表达， 但 两个 化酶基因的表达在硝酸银处理后反而被促进，乙烯受体基因在处理和对 照中的表达 无差异 。在强雌材料“ 106， 4 个基因均有表达，两个 化酶基因的表达与在“ 1613的表达有相似之处，两个乙烯受体基因的表达则表现出与雌性的协同关系。在普通性型材料“ ， 除 的 化酶基因和乙烯受体基因均有表达，且与雌性表现存在一定的协同关系。在西双版纳黄瓜中，仅有 个雌性相关基因表达，并表现出与雌性的协同关系。可见，每个性别决定基因在植株的 性别表现 中 并非具有同等效应和同样的协同关系；不同性型材料的性别表现可能受 不同性别决定基因的表达消长和调控。 关键词 ： 黄瓜 (.)， 性别决定相关基因， 遗传分析， 分布， 半定量 .) is is of in of in is a of As of of on of of to .) is to of In it in of on as 1. 2 , of 1613 2 of in it by of of of It in of of of of of of of 1613 of 2. of to 8 of by CR on of be in It to to 9%. in 3. of to CC on 1613106 a CC t in 0 at of to or in CC or in in of CC be in in 106 IV in 0 to 1613, to on in in of In 1613 In 106 CC in In of In a , It be of t on to in be of be by .), to V 目 录 第一章 文献综述 . 1 瓜性别分化及表现的研究进展 . 1 瓜性别分化和性别表型类别 . 1 瓜性别决定的机制 . 3 瓜性别决定的分子基础 . 5 异引物 测方法 . 7 异引物 . 7 测方法 . 7 研究的目的和意义 . 11 第二章 黄瓜性型遗传规律的研究 . 12 料与方法 . 12 料 . 12 法 . 13 果与分析 . 15 质量性状的 分析方法 分析 . 15 数量性状的 分析方法 分析 . 16 论 . 20 第三章 黄瓜性别决定相关基因在不同性型黄瓜种质基 因组中的分布 . 21 料和方法 . 21 验材料 . 21 验方法 . 22 果与分析 . 26 提取的 量检测结果 . 26 因在不同性型黄瓜种质基因组中的分布 . 27 因的克隆 . 28 化酶基因在不同性型黄瓜种质基因组中的分布 . 31 烯受体基因在不同性型黄瓜种质基因组中的分布 . 32 论 . 33 第四章 黄瓜性别决定相关基因的表达特征研究 . 35 料和方法 . 36 验材料 . 36 验方法 . 36 果与分析 . 38 处理的植株性型表现 . 38 增各基因的循环次数确定 . 39 表达特征 . 41 论 . 45 第五章 全文结论 . 47 瓜的性 型 遗传规律 . 47 瓜性别决定相关基因在不同性型黄瓜种质基因组中的分布 . 47 瓜性别决定相关基因的表达特征研究 . 48 参考文献 . 49 致谢 . 54 作者简历 . 55 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 瓜性别分化及表现的研究进展 瓜性别分化和性别表型类别 瓜的性别分化过程 黄瓜的性别分化过程比较复杂，无论是雌花还是雄花最初都是两性的，其后发生雌雄性器官中的一方停止发育即所谓的选择性败 育形成单性的雄花或雌花 （ 斋藤隆， 1982） 。雌雄单性同株类型的黄瓜其性器官的选择性败育发生在形态发生晚期 ;从分生组织形成花原基后，首先在其周边外缘隆起形成 萼片 ，继而在其内侧形成花瓣初生突起，花瓣发育时，在其内 侧形成雄蕊和雌蕊的原基。在花芽分化发育的早期均为两性花 ，即雌雄蕊原基并行发育，其后则发生雌雄蕊一方选择性败育而形成单性的雄花和雌花。 (1960)曾利用解剖镜对黄瓜雌、雄花形态发生的部分阶段进行过简单的形态学描述，并把它的发育过程分为 5 个阶段， 990)通过扫描电镜对黄瓜 花芽形态发生进行了详细的观察。 960) 、 任吉君等 (1994)的研究表明黄瓜单性花分化和发育过程中经历了无性期、两性期和单性期，最终只有一种性别的性器官原基发育成有功能的性器官，从而形成单性花，而对单性花中器官发生原理以及对未形成有功能器官的相反性别原基的研究报道甚少。 (2002)通过对黄瓜雌花中败育雄蕊进行形态学观察和生化分析发现雄蕊败育主要发生在雄蕊的花药原基阶段， 析表明，败育与 伤 (切相关，但 伤并没有导致细胞解体 ( 但是到目前为止还没有详细比较黄瓜雌雄花性别分化过程中形态学特征差异以及详细的器官形成过程的报道，也还不清楚黄瓜雌雄花发育的哪个阶段最初出现形态学上的差异以及具体的形态学差异。 瓜性别分化的影响因素 黄瓜性别分化主要受遗传因子、环境条件和激素的调控。 环境条件对黄瓜性别分化的影响 环境因子在黄瓜的性别分化中起着重要的作用， 影响 黄瓜性型分化的影响主要 因素有：温度、光照、水分和施肥等 。 大量生产实践和科学实验证明，高 温 和 长 日照 促进黄瓜雄花分化； 低 温 和 短 日照 则 促进花芽向雌型转变，有利于雌花形成。温度主要是夜间低温的影响 （ 李利敏， 1993） 。通常认为促进雌花分化的有利温度是白天 25 ， 夜温 12 15最有利于雌花分化 （ 黄伟波， 1996） 。 在 黄瓜 第 1叶到第 4 5叶，进行低温处理（ 14 15 ），便可增加雌花数目和降低雌花节位 。 黄瓜属于日中性植物，开花与日照关系不大，但短时强光照（ 8小时为最佳）条件有利于雌花的发生，尤其是在幼苗期，缩短日照条件能促进雌花形成 （ 李利敏， 1993） 。 5 6小时的日照虽有促进雌花发生的效果，但不利于黄瓜的生 产， 12小时以上的长日照有促进雄 花发生的作用。 环境条件中的湿度状况与黄瓜性别分化有密切关系（米宁娜， 1957）。土壤湿度越大越有利于雌 花分化 。 同样，在较高的空气湿度下，雌性器官的发育比雄性器官的发育更顺利，而且正在分化中的花原基对空气湿度的变化最敏感。在进行花芽分化时，保持空气湿度 80%比在 40%的情况中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 2 下，花的总数，特别是雌花数增加得多。 不同矿质营养条件对黄瓜性别反应是不同的，氮素营养有利于雌花的形成，在光合作用强而碳素营养良好的条件下，供给氮素有增加花数的作用，尤其是雌花增加多，但氮素供应过多，则不利于雌花的分化；钾素营养有利于雄花 的形成。 氮和磷分期施用有利于雌花的形成，但分期施用钾肥时，反而利于雄花的形成。 增加空气中二氧化碳的含量 可提高光合产量 ，从而 增加雌花的数量。 乙炔也有增加雌花的功能。 激素对性别分化的影响 不同的研究者对激素影响黄瓜性别分化的观点不 完全 相同，但一般认为，赤霉素（ 硝酸银（ 硫代硫酸银（ 乙烯生物合成抑制剂氨基氧乙酸 (氨基乙氧基乙烯甘氨酸（ 可 促进其多开雄花，而乙烯利生长素类物质及生长抑制剂等都可促进其多开雌花。不过，在不同的植物物种上有相反的报道，例如用赤霉素处理 丝瓜、板栗会减少其雄花数，增加雌花数（ 应 振 土 等， 1989）。 乙烯是黄瓜性别决定的一个重要调节因素 （ et 1997） 。黄瓜幼苗期用乙烯利处理，有提高第一雌花着生节位的作用，并能增加黄瓜的雌花数 （ et 1997） 。内源乙烯在纯雌系与雌雄同株系中的释放速度是不一致的，纯雌系中要慢些，但其含量以纯雌系植株中为最高，纯雄株中最少 （ et 1999） 。应振 土 等（ 1990）研究表明黄瓜雌性越强的品种，其茎尖组织乙烯释放量越多。在雌雄同株黄瓜植株中，乙烯诱导 雌花的形成；在雄全同株的黄瓜中则诱导两性花的形成。吴叶青（ 2000）研究表明乙烯会抑制雌性黄瓜中雄蕊的生长，但在雄全同株黄瓜中却不能。生长素虽然促进雌花的形成，但最强大的雌性作用是由乙烯产生的。乙烯生物合成或作用的抑制剂能抑制雌花的发育，并诱导雄花的发生（ 976， 979）。在雌性黄瓜中，用 会导致雌性向雄性的性别转变（ et 001， et 997），这是由于抵消了 而增强雄蕊的发育 （ et 1997） 。 1962）用萼片、花瓣和雄蕊原基发育良好的外植体，在改良的 现 表现为促进雌性表达。陈学好等 (2001)发现在黄瓜性别逆转的过程中，不同的激素会发生不同的变化。 在雌性转雄过程中，茎尖赤霉素 (腐胺 (可溶性蛋白质 (量升高，而生长素 (细胞分裂素 (亚精胺 (量则下降。与此相反，在 雄性转雌过程中，茎尖赤霉素、腐胺和可溶性蛋白质含量下降，而生长素、细胞分裂素和亚精胺含量升高。脱落酸、精胺和尸胺在黄瓜雌雄性别逆转过程中则表现为无规律的变化。 后来，陈学好等 (2002)又发现内源 通过诱导 而促进雌性表达。 1960年 决了雌性系选育和留种的难题。赤霉素促进雄花的形成，用赤霉素处理雌性植株可诱导雄花，这可能是导致了雌性花芽的败育和偶然的雄性花芽的形成（ et 999， et 001）。 970)、罗宗洛 (1973)等认为乙烯和赤霉素无对抗作用。于 凤 鸣等 (1997)也得出同样的结论，说明乙烯利和赤霉素在调控黄瓜性别分化方面存在着量的平衡问题，该结论与夏仁学 (1996)的观点是一致的，即性别分化是由植物体内源激素赤霉素、乙烯、生长素和细胞分裂素的平衡来调节的。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 3 黄瓜性别分化的主要影响因子是遗传因子，有关方面的研究进展将在下一节黄瓜性别决定的机制中一并阐述。 瓜性别的表现类别 由于黄瓜性别分化的过程复杂，影响 因素较多，性别表型类别也多样。根据单个植株上花的类型，可分为纯雌株、强雌株、雌全株、雌雄全株、雌雄株、完全株、雄全株、纯雄株八种类型（ 谭其猛， 1980） ，其含义见下表 1 表 1瓜性别分类及含义 of of 黄瓜性别决定的机制 瓜性别决定的生化机制 黄瓜是以果实为收获对象的瓜果类作物，在较多雌花基础上的高结成率是获得高产的基础。因此，研究黄瓜的性别分化或性别决定机理及其遗传标记，进行性别调控，尤其是在幼苗期进行植株性别的鉴定，具有重要的理论意义和实践价值。 遗传标记的研究是植物性别分化及调控研究的重要手段。研究应用较多的主要有形态标记、细胞标记、蛋白质标记、同工酶标记和分子标记等。由于分子生物学技术的发展，同工酶、蛋白质等生物大分子分析技术 的完善，以及分子标记技术的日趋成熟，使得遗传标记的研究在揭示植物性别分化机理中起着越来越重要的作用。 性别类型 义 雌株 在主蔓和子蔓上都是雌花。 强雌株 植株上除雌花外有少量雄花。 雌全株 在主蔓上先有一段完全花节，其后是雌花和完全花相间隔的段落。 雌雄全株 主蔓上先有一段雄花节，其后是一段雄花、完全花、雌花相间的段落， 再后是雌花为主的段落。 雌雄株 主蔓上先有一段雄花节，其后一段上雌花雄花相间着生，有时后期有 一段连续雌花。 完全株 主蔓最初几节是雄花或两性花，其后为连续两性花节，侧枝上只有两性 花，每一两性花节的第二朵以后的花也可能是雄花，有时还有雄花和两性花之间的过渡花型。 雄全株 最初几节是雄花，继以一段完全花（或雌花）和雄花相间的节，其后都 是完全 花。 纯雄株 植株上全是雄花。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 4 大多数植物的单性花发育早期阶段两种性器官原基均被启动，随后由于基因、环境及激素等因素复杂的相互作用导致一种性器官原基发育停滞或败育，另一种性型占优势而发育成该种单性花。因此，研究花器官发育过程中基因表达的特异大分子，分析并测定其结构，制作成探针（ 利用原位杂交技术定位性别分化特异基因或分离相关基因，是进行性别决定基因的研究并进行调控的重要途径。性别分化过程中大分子标记物主要有蛋白质如同工酶、特 异 中蛋白质是性别分化中最重要的大分子标记物（寿森炎等， 2000）。特异蛋白质分子标记的研究方法主要有聚丙烯酰胺凝胶双向电泳和聚丙烯酰胺凝胶印迹转移电泳，前者包括 林鸣等 (1996)在黄瓜器官特异蛋白的研究中，利用 现雄蕊的 及花柱中的 别为各自器 官中的器官特异蛋白质。 汪俏梅等(1998)在苦瓜 (.)研究中发现了一些与苦瓜性别分化相关的特异蛋白，并提出其中一个 11键蛋白”与雌性分化有关，另一个 30键蛋白”与雄性分化有关。 酶是基因表达的直接产物，同工酶谱的器官组织特异性也反映了基因表达的特异性。目前与性别分化有关的同工酶研究大多集中在过氧化物酶同工酶和酯酶同工酶在雌雄器官中的差异研究，其方法与特异蛋白质分子研究相似。艾辛等 (2000)研究黄瓜二叶期时子叶和真叶中的过氧化物酶、多 酚氧化酶和超氧化物歧化酶同工酶与黄瓜性别表现的关系发现，纯雌株比雌雄株酶活性强、酶带数量多，可作为黄瓜纯雌株早期鉴定的标记，尤其是真叶中多酚氧化酶同工酶 定成功率高。李曙轩等 (1979)也曾报道瓠瓜与黄瓜在雌性化或雌性越强的品种中过氧化物同工酶的活性就越强，且在黄瓜中过氧化物同工酶的活性与雌雄的比值呈正相关。 瓜性别决定的遗传机制 关于黄瓜的性别遗传，早在 1928年， 一对基因控制。 .(1961) 提出至 少三类基因控制黄瓜性别表现：第一类基因 二类为微效多基因，控制某种未知基质的累积或缺乏，它调节第一类基因的表现。第三类基因 （ 1961）提出有一群微效基因和两对主要基因控制性变： .（ 1974）发现了两个新的控制黄瓜性型的隐性基因，即 以及 一步的对黄瓜性别表现的遗传学分析证明，黄瓜植株的性别受多个位点控制， 并已鉴定出影响黄瓜性别表达的七个不连锁基因位点（表 1 991，略有改动），其中 m、 显性 F（ 控制雌花产生的主要基因位点， 雌性增强子 修饰， a（ 点则在 991；孟繁静， 2000）。 陈惠明等（ 1999） 采用经典遗传学方法，研究黄瓜纯雌株分别与雌雄同株、雄全株杂交及强雌株分别与雌雄同株、纯雌