【毕业学位论文】（Word原稿）葡萄糖氧化酶基因转化小麦的研究作物遗传育种硕士论文

中国农业科学院硕士学位论文 1 密级 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 葡萄糖氧化酶基因转化小麦的研究 o. F 中国农业科学院硕士学位论文 2 摘要 葡萄糖氧化酶（ 在植物抵抗真菌和细菌感染时起重要作用。 多成功的例子表明，转 将 本研究首次利用基因枪转化技术将 来自黑曲霉的 化至小麦，从而达到创造小麦抗病新种质的最终目标。 本实验对全国主要麦区 140个小麦品种进行了幼胚培养力筛选，并以模式 基因型 选到了扬麦 10号、新春 9号、兰考 86（ 79） 8、鲁麦 22号和鲁麦 23号等 8个培养力比较高的的基因型，为今后开展小麦遗传转化提供了依据。 将 因转化小麦之前，把质粒 的 动子替换成 的 ，构建了 因在小麦中的表达载体 扬麦 10 号、鲁麦 22 号和鲁麦 23 号作为转化的受体，采用基因枪共转化法用等摩尔数含目的基因 ( 筛选标记基因( 击小麦幼胚愈伤组织，并在含有 2 5 培养基上筛选和分化。从轰击的 3300 块幼胚 愈伤组织 中， 共 获得了 246 株抗 再生植株。经 定， 筛选到 31 株转 因的阳性植株，转化率为 扬麦 10 号等转基因植株经 析，证实 因已整合到小麦基因组中。对 和 植株 进行淀粉碘化钾染色分析，表明 因已在蛋白质水平得到表达。 34 个转 因株系的白粉病菌混合生理小种抗性鉴定结果表明，转基因株系的病情指数普遍略低于相应的非转基因株系。其 中编号为 86、 105 和 113 的株系无论是病情指数还是反应型均比对照株系低。 在 转基因植株中，通过 析筛选到 48 株只含有 因不含有 因的植株，为转基因后代剔除 因，选育无标记基因的转基因株系打下了基础。 关键词 小麦；葡萄糖氧化酶基因；基因枪共转化法。 中国农业科学院硕士学位论文 3 t is to by In a to of O) a in by no on O In of in by it be to O In to O 8 by 40 in 0, 2 3 13 14 on of by :1, in O on 5 At 246 in 300- CR CR it O s 1 of 2 3 O To O s in 2 of 6, 05 13 to be to At 48 O 1 of in 中国农业科学院硕士学位论文 4 目 录 摘要 . 2 . 3 第一章 绪论 . 6 究目的和意义 . 6 物抗细菌和真菌病害基因工程研究概况 . 8 外抗细菌、真菌病害基因工程进展 . 8 内抗真菌、细菌病害基因工程回顾 . 9 物抗病基因工程中存在的问题 . 9 萄糖氧化酶基因的抗病机制及其转化植物的研究进展 . 10 物自身的抗病机制 . 10 性氧的抗菌机制 . 10 萄糖氧化酶基因转化植物的研究 . 11 麦遗传转化 . 13 麦遗传转化研究现状 . 13 麦基因工的基本步骤 . 14 麦遗传转化的 主要方法 . 15 响小麦遗传转化的因素 . 18 过改进小麦转化体系避免外源基因沉默 . 18 基因安全性问题 . 18 研究技术路线 . 20 第二章 实验材料和方法 . 21 验材枓 . 21 麦受体基因型筛选 . 21 麦转化材料及分子检测所用试剂 . 21 验方法 . 22 中国农业科学院硕士学位论文 5 麦受体基因型筛选 . 22 裂解法小量提取质粒 . 22 切反应 . 22 段的回收与纯化 . 23 接反应 . 24 制备大肠杆菌感受态细胞 . 24 组质粒向大肠杆菌 的转化 . 24 组质粒的筛选与鉴定 . 25 因枪法转化小麦的操作 . 25 麦总 提取 . 26 测 . 27 析 . 27 淀粉碘化钾染色 . 29 白粉病抗性鉴定 . 29 第三章 结果与分析 . 30 良小麦受体基因型筛选 . 30 物表达载体构建和改造 . 35 再生植株获得 . 36 O 基因植株的检测 . 38 O 基因的检测 . 39 测 . 39 植株 析 . 40 植株 因表达活性鉴定 . 41 植株白粉病抗性鉴定 . 42 O 基因表达活性鉴定 . 44 转基因植株中 . 44 生植株叶片涂抺除草剂鉴定 . 44 植株 因的 测 . 45 第四章 讨论与结论 . 46 论 . 46 宜的受体基因型的重要性 . 46 基因的遗传分离 特性 . 47 2 代转基因植株白粉病抗性分析 . 47 中国农业科学院硕士学位论文 6 用共转化法解决转基因小麦带来的环境安全性问题 . 47 基因 小麦产业化的可行性 . 48 论 . 48 参考文献 . 49 附录 . 57 致谢 . 62 第一章 绪论 究目的和意义 小麦是我国最大的的粮食作物之一。随着人口的增长、工商业用地的增加和沙漠化的加重，人均耕地面积逐年减少，小麦种植面积也随之减少，不仅如此，小麦还因病害每年减产十分严重。因此，提高小麦产量成为十分迫切的问题，而增强小麦抗病性是提高单产从而提高总产量的主要中国农业科学院硕士学位论文 7 方法。 小麦病害主要包括全蚀病、赤霉病、白粉病、锈病 等。全蚀病是目前世界上最主要的小麦根部病害之一，为土传病害，难以防治，目前南起云南，北至内蒙古，东起山东半岛，西至西藏高原共计 19 个 省发生全蚀病，轻者减产 10% 20%，重者减产 50%以上 (任贤， 2003)； 赤霉病是南方麦区的主要病害，一般减 产 20 30%。 近 10 年已经扩展到北方麦区，减产幅度 10 30%，赤霉病的抗病基因主要来源于我国地方品种望水白和苏麦 3 号，但表现为数量遗传性状，抗病品种性不强 (韩青梅， 2003；吴春艳， 2003；杨新军， 2004；任明见， 2001)；白粉病是南方麦区和北方麦区小麦生产的 主要障碍之一，平均减产 20 30%， 白粉病和锈病抗性基因主要来源于黑麦、山羊草和地方品种，由于白粉病和锈病生理小种变异比较快，经常导致抗病品种丧失抗性 (张海泉， 2003；刘金元， 2000)。 目前，生产上防治小麦病害的常用方法有化学药剂、耕作措施和抗病育种三种方。化学药剂容易造成人畜中毒、农药残留和环境污染等危害；轮作换茬等耕作措施不能根除病害； 常规抗病育种对农业生产作出了卓越的贡献，但在某些情况下，由于作物本身或野生近缘种中缺乏抗原，限制了抗病育种的发展，例如 针对全蚀病和赤霉病等，在小麦及其近缘植物中缺乏 抗病基因，甚至还有一些病害没有抗源，使得常规抗病育种困难重重，而且常规育种方法年限一般都在 10 年左右，已经不能满足人类和社会发展的需要。 随着分子生物学、植物病理学、 组技术、植物组织培养及植物转化技术的迅猛发展，植物基因工程为抗病育种开辟了一条新途径。 自从 1983 年世界上首次获得转基因生物、 1986 年首批转基因生物被允许进行中间试验、 1994年首例转基因生物被批准进入市场以来，转基因研究一直被各国政府视为农业新技术革命的重要组成部分。目前为止，转基因研究至少已经在 120 多种植物中获得了成功，有 30 多个国家批准了数千例转基因植物进入田间试验，涉及到的植物种类有 40 多个，有 7 个转基因植物获准在 18个国家商业化种植，包括大豆、玉米、棉花、油菜、番茄、矮牵牛、甜椒、南瓜和木瓜。分布在抗虫、抗病、抗除草剂、提高品质和产量、雄性不育、生物反应器和环境保护等方面。 2003 年全球转基因农作物面积达到了 6770 万公顷，比 2002 年增加了 其中，抗除草剂类型占 抗虫类型占 兼抗类型占 抗病毒等类型 转基因作物的种植已经产生了巨大的经济效益，预计 2005 年全球转基因作物的 交易额将达到 38 亿美元， 2010 年将达到 100 亿美元。人类对高产优质、抗病抗逆、美观特异生物的需要，以及对低成本高产出的追求，无疑促进转基因技术的深入研究和转基因生物的大规模产业化。 目前已克隆出了许多微生物、植物和动物的抗病基因，并应用于植物抗病基因工程 。 例如昆虫 杀菌肽基因、细菌溶菌酶基因、 几丁质酶 基因、 葡聚糖酶 基因、 核糖体失活蛋白 基因 和防卫蛋白 基因等。但是在转入植物的许多抗病基因中，能够兼抗细菌和真菌病害的基因相对较少。 葡萄糖氧化酶（ 抵抗细菌和真菌病害过程中起 到了积极的作用。 2研究较多的与抗逆信号传递有关的分子，它不仅对病原微生物有直接的抑杀作用 , 而且还作为信号分子激发一系列防卫反应，最终使植物产生系统获得性抗性。 因应用于抗中国农业科学院硕士学位论文 8 病分子育种，已经取得了许多成功的例子，在植物抗病基因工程中具有很好的应用前景，转 目前还没有 因转化小麦的报导，把 抗病分子育种具有重要意义。本研究利用基因枪法将 因转入小麦，从而获得小麦抗病新种质。 物抗细菌和真菌病害基因工程研究概况 抗 病 转基因作物的开发和应用将是一种趋势 ，它 不仅能减少化学农药的使用，保护环境，还能解决人类所面临的粮食 危机 、资源匮乏和效益衰减等问题。 细菌和真菌病害都是农业生产上的主要病害，目前已克隆出了许多微生物、植物和动物的抗菌蛋白质的基因，并广泛应用于植物抗病基因工程 (陈谷， 1999；杜娟， 2000)。 外抗细菌、真菌病害基因工程进展 在天蚕、家蚕、柞蚕蛹的血淋巴中，经诱导后可产生 15 种蛋白质，分为杀菌肽、侵蚀素及溶菌酶三类不同的抗菌肽，对革兰氏阳性和阴性细菌有广谱的抗菌活性，能在细胞膜上形成小孔使细 胞内含物外流，从而导致病原菌死亡。 1991 年 验室将杀菌肽 B 及两种人工合成的抑杀菌肽基因转入烟草，得到了抗青枯病的烟草。 1998 年 F. 人克隆了蛋清溶菌酶基因、 菌体溶菌酶基因和人溶菌酶基因，并转化了烟草和马铃薯，获得了抗胡萝卜软腐欧文氏菌黑腐变种和丁香假单胞菌的植株（吴乃虎， 2001）。 几丁质和葡聚糖是构成许多植物病原真菌细胞壁的主要成分。已经从许多植物中克隆了几丁质酶基因， 1991 年最先将菜豆几丁质酶基因转化烟草和油菜，发现转基因植物根、茎、叶中几丁 质酶表达量大幅度提高，受立枯丝核菌侵染后，转基因植株存活率比其亲本对照明显提高，病症发展也有所延迟。葡聚糖酶能抑制真菌的生长与增殖， 将从粘质沙门氏菌中分离的葡聚糖酶基因转化入烟草，转基因植株表现出了对病原真菌 茄属丝核菌的有效抗性。 核糖体失活蛋白使真菌的核糖体失活，从而失去合成蛋白质的能力。目前已从小麦、大麦、玉米等多种植物中克隆出了核糖体失活蛋白基因，并应用于抗真菌病害的植物基因工程中。将大麦的核糖体失活蛋白基因导入烟草，发现在转基因烟草植株中表达了大麦的核糖体失活蛋白。1997 年 人将玉米的核糖体失活蛋白基因转入烟草，同样也观察到了转基因植株对茄属丝核菌抗性增强的现象（吴乃虎， 2001）。 防卫蛋白是当植物受到病原真菌侵染时积累的一类低分子量的蛋白质。将萝卜防卫蛋白因的 列转到烟草中，结果表明，在 转基因烟草植株中， 白质的含量占叶片可溶性蛋白的 ，并且对赤星病的抗性也有所增强。 细胞凋亡抑制基因，名称来源于 B 细胞白血病 /淋巴瘤 2， 族分两类，一类是抗凋亡的，主要有 类是促进凋亡的，主要包括 。细胞中的 比例就决定了细胞是否死亡中国农业科学院硕士学位论文 9 的命运。 线粒体释放的细胞色素 C 的释放有抑制作用，而细胞色素 C 对 激活作用。 制凋亡的实验中，细胞色素 C 都没释放。最近的 体的结构和功能研究中发现它和可以形成离子通道的一些毒素非常相似。随后的电生理实验表明， 可以在人工膜上形成离子通道。它们可能通 过调节跨膜的电化学梯度而对细胞凋亡进行调节，也可能它们是 的组分，当 打开时引起细胞凋亡。 内抗真菌、细菌病害基因工程回顾 近 10 年我国在转基因植物研究与开发领域取得了巨大成就，已经从跟踪国外技术迅速发展到自主技术创新阶段，并且在转基因植物商业化开发方面进入世界五强。 抗病基因工程研究发展迅速，在抗真菌和细菌病害方面，对 20 多种植物进行了抗性基因的转化，转入并得到稳定表达的外源“抗病基因”涉及 6 个抗菌肽类基因， 6 个抗菌蛋白类基因， 7 个病原菌生理抑制物质类基因（包括几丁质酶基因、葡聚糖酶基 因、防御蛋白基因、 无毒基因等）， 2 个降解病原菌毒素物质类基因（表 1）。 物抗病基因工程中存在的问题 植物抗病基因工程中存在的问题之一是缺少能够诱导植物自身防卫系统表达从而抵御细菌、真菌、甚至非生物胁迫侵害的广谱性的抗病基因。目前许多抗病基因或是抗真菌，或是抗细菌，或是抗病毒，抗性比较狭窄。所以开发和应用抗病性广谱、能够诱导植物自身防卫系统表达的抗性基因是植物抗病基因工程育种的一项重要研究内容。 表 1 中国近 10 年的抗真菌和细菌病害相关基因向植物中导入情况 in 0 菌基因 抗真菌、细菌病害转基因植物种类 主要参考资料 杀菌肽类 杀菌肽 B 水稻 黄大年等， 1996 辣椒 李乃坚等， 2000 樱桃 方宏筠等， 1999 杀菌肽 D 桉树 邵志芳等， 2002 辣椒 李乃坚等， 2000 沙田柚 郑启发等， 1999 柑橘 陈善春等， 1997 侵蚀素 烟草 王晖 等， 2001 人工拟抗菌肽 B 铃薯 贾士荣等， 1998 中国农业科学院硕士学位论文 10 抗菌蛋白类 抗真菌硫堇蛋白果 刘庆忠等， 2001 白 马铃薯 贾士荣等， 1998 病原菌生理抑制剂类 兔防御素 杨 赵世民等， 1999 水稻 何鸣等， 2002 小麦 刘伟华等， 2003 番茄 欧阳波等， 2002 萄糖氧化酶基因的抗病机制及其转化植物的研究进展 物自身的抗病机制 植物自身抗病机制的研究一直是植物病理学和抗病 育种中的热点问题。 植物一生受到各种生物逆境（真菌、细菌、病毒等病原物）和非生物逆境（盐碱、旱涝和极端温度等）的胁迫，在长期进化过程中，植物为了自身的生存，形成了一系列防御机制。 植物受到病原物侵染后，产生组织或全株抗性的抗病机制有两个过程，即 超 敏反应（ 系统获得性抗性（ 超 敏反应（ 指在植物与病原物的非亲和互作过程中，受病原物侵染的植物快速死亡而形成枯斑的反应。它的直接结果是病原物被 限制在侵染点的坏死组织中，不能向周围扩展，不能获得营养物质以致死亡。 应的共同生理生化特点可能涉及到：活性氧（ 增、 K+、 H+离子交换、细胞壁强化和抗菌化合物产生等，其中 杨酸等作为信号分子可激发一系列防卫反应，最终使植物具有系统获得性抗性 (995; C,1997)。 系统获得性抗性是指植物发生超敏反应之后获得的对病原物的广谱抗性。 一种可以用化学或遗传方法在生产上加以利用的抗病机制。 植物防卫反应基因被 系统诱导表达的结果。 寄主植物启动自身的防卫系统 表达：包括降解病原物细胞壁的酶类，如几丁质酶和 成 （ 1990） ；抑制病原物生长的酶类，如脂氧化酶等的合成； 加固细胞壁 的纤维素、木质素和结构蛋白 等的合成； 植保素和抗菌蛋白及酚类化合物的合成（ 1997； 1991）、邻近细胞中谷光甘肽 et 1994；邱金龙等， 1998） ， 最终诱导系统获得性 抗 性（ et 1993）。 性氧的抗菌机制 与植物 快速合成有关。植物被病原菌侵袭后，在体内引起活性氧中间物的迅速合成，这一过程被称为氧化激增（ (, 1989; D, 1997)。生物和非生物逆境胁迫下植物细胞中最早期的原初反应是 产生。氧化激增产生的 过氧化氢（ 超氧离子（ 羟自由基（ ，不仅具有直接抑杀病原菌的作用，而且对激发植物的防卫体系具有重要作用 ( W, 1992)。 中国农业科学院硕士学位论文 11 在氧化激增的过程中， 产生是植物启动防卫反应中最快的反应之一， 仅是植物体产生系统获得性抗性反应的信号分子，还可诱导蛋白质发生氧化交联从而使蛋白质的构型发生变化（而不是使其降解或转移），导致蛋白质固化，从而限制病原的侵入 (, 1998; , 1983; M,1991)。 生物体中的抗菌活性已得到充分证明，动物吞噬细胞在吞噬细菌后，在细菌周围积累 其衍生物，可达到抗菌的目的。外源超氧离子和 真菌和细菌抗菌活性的影响也已得到充分证明（ et 1993； 1992； ， 1995 ； ， 1997）。用 10 5 的 完全抑制 孢子萌发，当加入过氧化氢酶后抑制作用消失。 100 充分抑制软腐细菌（ 晚疫病菌（ 生长 (, 1995)。 在白桦中，也检测到一定水平的 I, S et 002）。白桦树叶片受创伤及病原菌侵染时，密切伴随着叶片细胞内 积累，特别是在创伤位置周围， 为接受生物和非生物协迫继而调节基因表达及细胞死亡的分子信号。 萄糖氧化酶基因转化植物的研究 （ 1）葡萄糖氧化酶的理化性质 葡萄糖氧化酶 是一种需氧脱氢 酶 ，它能 在有氧条件下 氧化 成葡萄糖酸和过氧化氢。 1928 年 黑曲霉（ 无细胞提取液中发现 1960 年 从青霉素中 提纯 了 天然 二聚体结构 ， 分子量为 126,000，其亚单位为 62,000， 除多肽链外，含有碳水化合物。虽然糖链部分的存在对 结构、稳定性和活性的影响并不大，但 55C 最佳反应 电聚焦凝胶 电泳测得 化的 反应受 和 的严重抑制 。 了以 催化 2对后三者的活性较低。 由于碳水化合物的作用，赋予 定的特性，如 100不沉淀，在 液中稳定，在 5% 三氯乙酸中缓慢沉淀，水溶性好，在高盐溶液中沉淀等。目前 工业上大量使用。在食品保鲜方面，牛奶中加入 葡萄糖可抑制牛奶中丁香假单胞菌的繁殖； 可 延长啤酒保鲜期 ，是很有效的防腐剂。 （ 2） 因在植物抗病基因工程中的应用 白质在植物抗细菌和真菌病害方面起到了积极作用。 因目前已在多种细菌和真菌 中检测到，但在植物和动物中仍末发现。目前 因已被成功地转化至马铃薯、烟草、棉花、番茄和水稻中，在所获得的转基因植株中，检测到了对马铃薯软腐病、水稻稻瘟病等病害不同程度的抗性。 将 因转入了马铃薯（ 1995），发现转基因植株体内的 度比对照提高了 2中国农业科学院硕士学位论文 12 3 倍，用软腐病菌进行接种后发现，转基因薯块能对软腐病产生强烈抗性，并且其抗性无论在有氧还是缺氧条件下都能持续发挥对细菌的抗性。高水平表达 转基因马铃署对晚疫病也表现出抗性，外加过氧化氢酶可使其抗菌能力消失，说明其抗菌能力是由 产 生的 导的。 王志兴通过 增克隆出了黑曲霉的 因（ 1998）。构建了以 动子和动子驱动的 因植物表达载体，经遗传转化，获得了烟草、马铃薯、棉花的转 基因烟草中 含量最高可达非转基因对照植株的 6 倍。转基因马铃薯薯块抗软腐病能力比非转基因对照明显提高。 甄伟等将黑曲霉 ( 融合构建了植物表达载体并转入马铃薯（ 2000）。该基因表达的 反应产物 碘化钾显色反应得到证实。用马铃薯晚疫病 (复合生理小种侵染转基因植株，结果表明：含 病原诱导型启动子 的 转基因马铃薯 的抗性 可受马铃薯晚疫病病原的诱导 ，表现出对晚疫病不同水平的抗性，发病时间推迟且病征明显减弱。 L， 等用 因转化番茄（ 2001），证实了在转 2水平的 和茎细胞内与抗性相关 的一些基因的 平提高，最终诱发全株抗病性。 ， 等也将 因以组成型和诱导型表达系统转化到水稻中（ 2003），结果无论是组成型还是诱导型表达系统的转化植株都能产生长效的抗病性。转 因植株中 而激活了细胞多个防卫基因表达，使得转化植株表现出真菌和细菌的抗性。当 到一定浓度后，导致细胞死亡。与诱导型相比，组成型所表达的 其相应的酶活性提高 3 10 倍，如此高水平的 使种子活力降低。因此利用病原诱导型的转化系统诱发植株产生广谱抗病性 比较实用。 彭昊等利用根癌农杆菌介导法将 因转入水稻（ 2003）。淀粉 2实了在转基因水稻中 表达以及 活性。抗病性鉴定表明，所获得的转基因水稻对稻瘟菌具有良好的抗性。 另外，巩万奎 (2000)也将 因转入棉花中，并获得了再生植株。 上述成功的例子说明， 因在植物抗病基因工程中具有很好的应用前景，转 因的植株表现出对细菌和真菌的广谱抗病性。但目前却没有 因转化小麦的报导。把 因这样一个广谱性抗病基因转入小麦中，对小麦抗病分子 育种具有重要意义。 中国农业科学院硕士学位论文 13 麦遗传转化 麦遗传转化研究现状 禾 本科植物遗传转化研究 相对于其 它 双、单子叶植物而言，起步晚、困难大 。随着 单子叶植物的高效表达启动子， 因、 因等选择标记和 高毒性农杆菌菌系的运用，近几年单子叶植物遗传转化研究取得了可喜进展。然而 小麦相对于其他禾 本科植物 如水稻、玉米等又 相对 滞后 ，直到 1992 年 才 获得了 世界上第一例 转基因小麦 。经过十年的努力，已初步确立了小麦遗传转化体系（叶兴国， 2001；徐惠君 ， 2001；武丽敏， 2003；肖兴国， 2000）。所导入的基因有 基因、 因 、 病毒外鞘蛋白（ 因、谷蛋白 5+10 亚基基因， 因、 因和 因等，主要涉及到 抗 病、抗虫和抗逆性、 雄性不育 和品质改良 等方面 (覃建兵， 2001；田秀平， 2001；郭殿京， 1997；卢雄斌， 1998；杨景成， 2004)。 在转化抗真菌和细菌病害基因方面，大多集中在转入与病程相关蛋白 (其它功能未知的抗微生物蛋白方面。如将兔防御素 因转入小麦（刘伟华， 2003）；许多学者采用花粉管通道法或 柱头注射法，将近源种、属的总 入普通小麦，筛选出含外源基因的抗病小麦。例如，通过花粉管通道法将抗白粉病的二棱大麦总 入普通小麦中 , 筛选出对白粉病高抗或免疫的变异株；将抗燕麦条锈病的基因转入到栽培小麦中，获得了对白粉病具有稳定抗性的小麦品系（刘萍， 2000）。 在转化抗虫基因方面，主要利用了 3 类“抗虫基因”：即苏云金芽孢杆菌毒蛋白（ 因及其修饰体、蛋白酶抑制剂类基因和外源凝集素类基因。近年有报导获得了转 因小麦以及转雪花莲凝集素（ 因的小麦（徐琼芳等， 2001；梁辉， 2004） 。 在转化抗或耐病毒基因方面，绝大部分是转病毒外壳蛋白（ 因。例如将黄花叶病毒复制酶基因导入小麦，所获得的抗黄花叶病毒小麦目前已经进入环境释放阶段（徐惠君， 2001）。 在转化除草剂基因方面，膦丝菌素乙酰转移酶基因（ 利用最多。 因所表达的蛋白质能分解 除草剂，所以目前小麦转化大多用 因作为筛选标记，与其它目的基因一起转化小麦。 在转化抗逆基因方面，陈受宜等从山菠菜中克隆的甜菜碱醛脱氢酶基因、胆碱单氧化物酶基因和脯氨酸转运蛋白基因 ，刘俊君等从大肠杆菌中克隆的 6些甜菜碱代谢相关基因和渗透调节物代谢酶基因以及 衡调节基因是我国目前利用的抗盐碱基因的主体，已经在转基因小麦中得到稳定表达（肖兴国，白书农， 2004）。 在品质改良方面，主要集中在提高作物蛋白质含量和人体必需氨基酸含量、提高淀粉含量或改变淀粉成分等方面。国内外均有关于将小麦高分子量麦谷蛋白优良亚基（ 因导入小麦，获得加工品质得到提高的转基因小麦的报道。 中国农业科学院硕士学位论文 14 雄性不育基因转化 是近 10 年转基因研究新的生长点。尽管多数研究沿用了 发明的由烟草花药绒毡层特异性表达启动子（ 动核糖核酸酶基因（ 人工雄性不育基因 对新的人工雄性不育基因的探索一直在进行，并且取得了一定的进展，例如肖兴国在小麦花药中特异性表达反义肌动蛋白基因，获得了完全雄性不育的植株（肖兴国，白书农， 2004；李艳红， 1999；阎龙飞， 2000）。 麦基因工的基本步骤 植物的转化需要经过几个关键的操作环节，包括基因的克隆与分离、基因的修饰与表达 载体的构建、植物的遗传转化和转基因细胞或植株的筛选 (叶键明， 1999)。 （ 1）基因克隆与分离 库钓取路线是指用探针从 库或 库中钓取基因的方法。近年来，用库分离和克隆基因的技术进展很快，图位克隆法、染色体步查技术、转座子标签法、 因组相减技术、基因挽救技术、 别显示技术以及最近发展起来的表达序列标签法，都是用合适的探针，从 库或 库中筛取目的基因。 直接获得目的基因的方法如 术，人工合成基因等，可直接分离或克隆出目的基因。此法 必须已知基因的全序列或部分序列，或者已知该基因所翻译的氨基酸序列，进而推导出基因的碱基序列，然后再进行 物的设计或基因的合成。 新筛取的基因往往不具有完整的结构，只是开放读码框（ （ 2）基因的修饰与表达载体的构建 目的基因