【毕业学位论文】（Word原稿）番茄抗灰霉病和晚疫病基因的分子遗传分析与多基因辅助选育技术蔬菜学博士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 博士研究生学位论文 番茄抗灰霉病和晚疫病基因的分子遗传分析与多基因辅助选育技术 o.: I 中 文 摘 要 番茄晚疫病和灰霉病是世界性周年频发的重要病害，特别是在设施栽培条件下，严重影响番茄的产量和品质。目前我国还未有抗病品种选育成功的报道，而且相关研究工作始终处于相对滞后的地位。就普通栽培种番茄而言，对晚疫病和灰霉病通常表现感病，虽然野生资源是番茄抗病育种的宝贵材料库 ，但对灰霉病还尚未有较好的抗源材料。因此，筛选抗晚疫病和灰霉病的抗病新材料，并应用常规育种与分子生物学相结合的手段，深入挖掘抗病资源材料，是解决目前生产中亟待解决问题的有效途径。本研究针对生产实践需要，结合番茄已有研究结果，对抗晚疫病和灰霉病的材料进行了鉴定筛选，并利用现代生物学的技术对抗病基因进行了研究，旨在为抗病育种奠定基础。主要结果如下： 1对来自番茄 8 个种的 22 份野生资源材料进行了苗期人工接种抗病性鉴定，筛选出 多毛番茄番茄茄 7 份抗灰霉病资源材料。上述材料人工接种 7 天后，病斑占叶面积的比例少于 5%。综合国内外研究结果初步认为，野生资源材料中的部分多毛番茄和类番茄茄可作为番茄抗灰霉病的资源材料。 2筛选出一些高抗我国番茄晚疫病的资源材料，包括兼抗目前我国 8 个不同生理小种的多毛番茄 合胚培养对上述材料进行了初步转育。利用近等基因系，明确了含抗晚疫病基因 番茄材料，苗期呈现明显的株龄抗性，即幼苗期随株龄的增加，对晚疫病的抗性呈现明显的 增强趋势。 3利用抗灰霉病的多毛番茄 优良品系 99165建的 200 个 离群体，结合记，构建了长度为 801含 13 个连锁群的番茄分子遗传连锁图谱，并对控制番茄灰霉病的基因进行了定位。鉴定出影响 番茄叶部对灰霉病抗性的 2 个 中一个位于番茄第 2 条染色体上，为抗病 59记连锁， 为 献率为 效应值为 翼标记为 61 间为 一个位于番茄第 3 条染色体的末 端，为感病 锁， 为 献率为 效应值为 定出番茄果实抗灰霉病的 1 个 为 献率为 效应值为 翼标记为 59 间为 于番茄第 2 条染色体上。 4利用以栽培种为遗传背景，来自抗灰霉病的多毛番茄 93 个和类番茄茄 8 个渐渗系群体，对抗灰霉病的 行了定位。发现来自多毛番茄 灰霉病的位点分布在第 1、 2、 3、 4、 6、 7、 8、 10、 12 等 9 条染色体上，其中来自 4 条染色体末端，介于 记间的位点，命名为 番茄抗灰霉病贡献率较大，叶片病斑面积较普通栽培种 少了 而来自类番茄茄 抗病 、 2、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 11、 12 等 10 条染色体上，其中来自 7 条染色体，介于 记的位点，命名为 病效应最好，病斑面积较少了 通过对上述不同群体抗灰霉病位点比较分析发现，来自 来自 别位于染色体 1、 2、 4、 8 的 5 个抗病 位。来自 条染色体上， 记附近的 位。上述定位的抗灰霉病 番茄抗灰霉病育种奠定了扎实的基础，尤其是来自多毛番茄 于染色体 2 和来自类番茄茄 的抗病 应较大，可直接应用于转育。 5对多毛番茄 93 个渐渗系，分别接种我国晚疫病 、 ,4 等生理小种，鉴定出位于番茄染色体 1，与 锁，抗 小种 的 点；位于染色体 9，介于小种 的位点 于染色体 11，均介于 小种 1,2 的位点 时还鉴定出，分别位于染色体 2、 3、 4、 5、 8 上，对 个位点；分别位于染色体 4、 8 上，对 小种感病的 3 个位点；分别位于 12 条染色体上对 ,4 感病的 22 个感病位点。 6鉴定出 3 个品系，不仅对晚疫病而且对灰霉病均表现一定程度的抗性，其中 系与栽培种 二者的抗性差异均达到了显著差异，即抗晚疫病的 抗灰霉病的 位，位于染色体 1，这些品系可以作为兼抗两种病害的抗源材料。 7针对目前番茄生产中的一些主要病害，包括番茄灰霉病、番茄根结线虫、番茄花叶病毒病、番茄斑点萎凋病毒病，首先利用近等基因系获得了与来自 病 密连锁的 记，结合国内外研究结果还开发了可以对抗根结线虫的 番茄花叶病毒的 番茄斑点萎凋病毒的 2 个抗病基因同时鉴定筛选的多重 系。该体系的建立，为苗期早期快速辅助选育提供了可能。 关键词： 番茄；灰霉病；晚疫病； L. be a to no to to of to of at to of of of as a of to is of of of to or or In in to to of on so to in in as 1. 22 of by . L. of % of to we . . to 2. . of as a . as a of a of of 3. A 3 SR 00 C1 9165. of 01to in TL to in on 40/of 4.3 cM 40/TL on of of in of OD TL on of .0 cM 32/ . In to in to on 38 3 . . . 6203 on , 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 12. on of a of 6203. on 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12. TL on of of on ,4,8. in a to 5. 93 6203 to to 1, 1,2,4 of on to 1,2. on to 1,2. on 1 to of 1 1,2. 6 on 3, 4, 5, 8, 3 on , 8 2 2 to or 1, 1,2,4 of 6. 3 to to . 6203. to to on be a to of in 7. on , a in a CR be to of to Mi to be as an by at V 目 录 第一章 绪论 . 1 1 番茄灰霉病及其抗病育种 . 2 茄灰霉病的危害及小种分化 . 2 霉病病菌与寄主的互作机制 . 4 茄抗灰霉病育种 . 6 2 番茄晚疫病及其抗病育种 . 7 茄晚疫病的危害及其小种分化 . 7 疫病病菌与寄主互作机制 . 8 茄抗晚疫病 育种 . 9 3 番茄分子连锁图谱及抗病基因的定位与克隆 . 9 茄遗传连锁图谱的构建 . 9 科比较图谱 . 11 茄渐渗系群体的建立及应用 . 11 茄抗病虫基因定位 . 12 茄抗病基因的克隆 . 14 物抗病 深入开发 . 14 4 植物株龄相关的抗性及机理 . 15 物株龄相关的抗性 . 15 物株龄相关抗性机理 . 16 5 复合 系及其应用 . 16 6 论文研究的目的和主要技术路线 . 16 究目的和意义 . 16 术路线 . 17 第二章 番茄抗灰霉病基因的遗传分析与 位 . 19 1 材料与方法 . 20 料 . 20 法 . 22 2 结果与分析 . 25 茄抗灰霉病资源材料的筛选鉴定 . 25 茄 谱的构建 . 29 茄抗灰霉病 定 位与分析 . 33 番茄不同部位抗病相关性分析 . 41 茄抗灰霉病 种间比较分析 . 41 3 讨论 . 41 茄抗灰霉病资源材料 . 41 工接种抗灰霉病方法 . 42 茄 传连锁图谱 . 42 茄抗灰霉病 位 . 43 第三章 番茄抗晚疫病材料的鉴定、转育及 位 . 46 1 材料与方法 . 47 料 . 47 法 . 47 2 结果与分析 . 48 生资源材料抗晚疫病的鉴定及转育 . 48 茄抗晚疫病 位 . 51 制番茄抗晚疫病位点的比较 . 56 茄不同株龄幼苗的抗性 . 56 3 讨论 . 58 茄抗晚疫病资源材料及 位 . 58 茄对晚疫病的株龄抗性分析 . 60 第四章 多基因 记辅助选育番茄多抗育种 . 61 1 材料与方法 . 61 茄材料 . 61 法 . 62 2 结果与分析 . 64 抗灰霉病 密连琐 记的获 得 . 64 因紧密连琐特异标记的获得 . 65 基因体系的建立 . 68 3 讨论 . 70 第五章 结论 . 72 参考文献 . 74 致 谢 . 88 作者简历 . 89 附 录 . 90 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 番茄（ L. 泛栽培于世界各地，是人类日常生活中不可缺少的主要蔬菜之一，不仅可用于鲜食，而且可加工成不同类型的罐装食品，包括番茄酱、番茄沙司、番茄丁、番茄汁等，已成为重要的功能食品 （ ， 2002； ， 2003； 005） 。我国目前的番茄栽培面积已达 100 多万公顷，保护地约 30 多万公顷（范小建等， 2000），其中用于加工的番茄约 15 万公顷，已成为世界重要的鲜食和加工番茄生产基地。然而，随着栽培历史的延伸，番茄的病害也越来越严重。番茄抗病育种一直是国内外研究的重点，我国虽然 一直 将 抗番茄花叶病毒病 (根结线虫（ 枯萎病（ f. 、叶霉病（ 、黄瓜花叶病毒病 (抗病育种列为“六五”到“十五”国家重点科技攻关（李树德， 1995）或国家高新技术“ 863”项目的重要内容，取得了不少结果，但是对于近年来发生猖獗的番茄晚疫病 （ 和灰霉病 (病育种，却始终处于相对滞后或空白的局面。 在人类栽培番茄的历史过程中发现， 使用常规育种的方法对于再利用表型可判断的有用性状已很有限，这是因为常规育种 群体对于番茄生产而言，产量和主要质量性状的提高已达到一个生理平台水平（ ， 1999）。 （ 1999）通过在美国及以色列两个不同地区的 20 年重复田间试验指出，过去美国番茄的品质改良，主要是由于从 80 年代起杂种一代的使用及栽培条件的改善包括施肥、灌溉和病虫防治，导致产量的增加，而可溶性固形物等没有较大变化。番茄属包括 6 个种，这些野生 资源材料不仅含有可用于提高品质的宝贵基因（ 1990； ， 1995； ， 1998； 1999；余诞年等， 1999），而且在与病原菌互作过程中，进化演生出系列栽培种所不具有的特异抗病虫基因（ ， 2002， 2004, ， 2005；郑光华等， 1988），如醋栗番茄（ L. 番茄萎凋病（ 叶霉病（ 斑枯病（ 细菌性茎腐病（ 番 茄花叶病毒病（ 斑萎病（ 多毛番茄（ L. 早疫病（ 斑枯病、叶霉病、番茄花叶病毒病、卷顶病毒病（ 晚疫病（ 根瘤线虫（ 多种杀虫作用，秘鲁番茄（ L. 卷顶病毒病、斑枯病、枯萎病、叶霉病、晚疫病、番茄花叶病毒病、根瘤线虫及马铃薯蚜虫，多腺番茄（ L. 叶霉病、根瘤线虫、黄萎病，智利番茄（ L. 萎病，潘那利番茄（ L. 顶卷病毒病，类番茄茄（ S. 早疫病、枯萎病、 诞年等， 1999）。众所周知，现有栽培种番茄中，相当一部分抗病基因来源于野生资源。就晚疫病和灰霉病而言，多毛番茄、醋栗番茄等是抗晚疫病的宝贵资源材料（ ， 2004； ， 2002； ，1999），而多毛番茄、醋栗番茄及类番 茄茄还对灰霉病表现一定的抗性（ ， 2002； 999）。虽然野生资源囊括极具价值的基因，但野生资源的转育利用存在一定的困难，首先野生资源材料和栽培种番茄杂交存在杂种不孕性，其次野生材料携带许多不良园艺性状，如果实较小等（ ， 1999），另外通过 杂交、回交将有益基因转入栽培种通常需要较长的时间等等。上述问题的存在，严重障碍了野生资源材料有用基因的有效开发与利用。 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 2 基于 平的分子生物技术，已被广泛应用于作物遗传改良（ ， 1988； 1991； ， 1993； ， 2004）。利用与控制不同性状基因紧密连锁的分子标记，早期鉴定筛选，极大地加速了作物育种进程（ ， 1992）。番茄作为模式植物，相关研究较为深入，目前已获得了与抗叶霉病、白粉病、番茄花叶病毒病、枯萎病、根结线虫等多个基因紧密连锁的不同类型的分子标记（ ， 1994； 1994； ， 1996； 997； ， 1997； ， 1998； ， 1994）。 作物抗病通常受单基因或 于质量抗病基因而言，开发一般较为容易，如利用建立的群体或近等基因系获得相关标记，直接用于后代选育；而对于受多个位点控制的抗病 说，通过常规转育较为困难，基于分子标记的 分子图谱技术不仅可鉴定基因的主效和微效效应，并且可揭示杂种优势、超亲分离、基因型和环境互作等重要遗传现象，从而使数量变异效应转化为不同染色体上的单个基因座的作用。另外，利用 图对复杂性状的遗传也增加了新的认识，从而为育种者和遗传学家进行品质、抗病等性状的遗传育种研究提供了新方法。然而， 在实际应用中 ， 由于 析常常受制于目的基因和两侧标记之间发生重组 的影响， 开发也存在一定问题 。 针对受多个基因影响的性状， 996)提出了 术，该技术能使数量性状位点（ 析和育种相结合，有望将有用的 育到栽培种，从而促进深入开发利用近缘野生种中潜在优良性状的可能 。就番茄而言，针对野生资源 开发， 目前已以番茄属的 8 个种 0 个不同结构的群体 建了较为详细的园艺性状的 谱，这些工作为番茄遗传改良奠定了良好基础。但是，上述图谱的构建均是基于 记，由于 记操作的复杂性，最近几年，相关研究人员开发了大量的快速简便、易于操作的 特异 记（ ， 2005； ， 2005），这些标记图谱的获得将会为番茄遗传改良 提供更为方便的技术手段。另外， 随着拟南芥、水稻基因组测序的陆续完成，根据植物进化理论和番茄大量的表达序列标签（ 至 2005 年 11 月公布 164691 个 部分基因组序列（ 6 个 ， (2002)推测番茄基因组编码大约 35000 个基因（ 2002）。人们还发现 不同抗病基因都具有共同的保守序列，这些抗病基因类似物 (鉴定、分离和克隆抗病基因提供了一种有效手段（ 2002）。康乃尔大学发起了番茄基因组测序工作现，由中国、美国、荷兰、 意大利等 10 多个国家共同参与，我国承担了第 3 条染色体的测序工作（ ， 2005）。随着番茄测序的完成，相关功能基因的鉴定，将为番茄抗病育种提供更为方便的平台，也会使番茄遗传改良发生深入的变化。 1 番茄灰霉病及其抗病育种 茄灰霉病的危害及小种分化 灰霉病病菌寄主十分广泛，约有 235 种，严重危害各种作物，常导致减产甚至毁灭。我国保护地近几年发生频繁，严重障碍了番茄的生产，带来了不可估量的损失。 病菌可为害叶、茎、花及果实。 苗期受害可造成茎叶腐烂，呈污绿色至灰褐色，表面密生灰霉 ； 成株期发病，叶 片上形中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 3 成 V字形斑，浅褐色，有稀疏轮纹，边缘变黄，潮湿时，表面生稀疏灰褐色霉层 ；也可以形成不规则形和圆形轮纹斑；叶柄折断侵染后呈水浸状褐色斑块。 花受害时花瓣及柱头腐烂脱落，受害的柱头常使幼果果脐染病。果实受害多始于果脐或果蒂，青果受害多 ， 果面上出现水浸状褪色斑，渐扩大致全果腐烂，病部表面密生灰褐色霉层 ，失去商品价值 。 近年在发病严重的地块和时期，出现了“花脸斑”和茎基部腐烂的现象（ 2002； ， 2003； ， 2004； 2004；林柏青等， 1998；李保聚等， 1999；赵统敏等， 1999）。 。 灰霉病病菌属于半知菌亚门、葡萄孢属的灰葡萄孢菌 (。病菌的孢子梗数根丛生，具隔、褐色，顶端呈1分枝，梗顶稍微膨大，呈棒头状，其上密生小柄并