林蛙皮中多糖提取的方法比较

0摘要中国林蛙（RanachensinensisDavid）又名蛤什蟆，属两栖纲、无尾目、蛙科、蛙属，是集药用、食补、美容功能于一体的珍稀两栖类动物，具有很高的应用价值和开发潜力。本文以东北林蛙皮为实验材料，以多糖的提取率为考察指标，将林蛙皮粉碎，过筛，活性炭脱腥，比较热水提取法、碱提取法、酶提取法三种不同提取方法的提取效果，并用苯酚-硫酸法测定多糖含量。实验结果表明，酶法提取效果最佳，其次是热水提取法和碱提取法。采用正交试验法对酶法提取多糖的工艺进行优化，得出其最佳提取工艺条件为：酶用量2%，胃蛋白酶与胰蛋白酶比2:1，提取温度50，提取时间7h，多糖提取率为0.91%。关键词：林蛙皮；多糖；酶法；正交试验0AbstractChineseforestfrog(RanachensinensisDavid)akaHashima,belongingtotheAmphibia,Anura,frog,Rana,isasetofmedical,food,cosmeticfunctionsinoneoftherareamphibiananimal,hasveryhighvalueforapplicationandpromisingfuture.TheskinofRanadybowskiiisusedasexperimentalmaterial,withtheextractionrateofpolysaccharideasanindex.Crushingtheforestfrogskin,sievingit,activatedcarbondeodorization,comparedwithhotwaterextraction,alkaliextraction,enzymeextractionofthreedifferentextractionmethods,andbyphenolsulfuricacidmethodforthedeterminationofpolysaccharidecontent.Theexperimentalshowsthatenzymaticextractionhasthebesteffect,followedbyhotwaterextractionandalkaliextraction.Usingtheorthogonaltestmethodonenzymeextractionpolysaccharidetechnologyoptimization,theoptimumextractionconditionsforenzymedosage:2%enzyme,pepsinandtrypsinthan2:1,extractiontemperatureis50,extractiontimeis7h,polysaccharidesextractionrateis0.91%.Keywords:forestfrogskin;polysaccharide;enzymemethod;orthogonaltest1目录摘要.1Abstract.1目录.2第一章前言.4第二章文献综述.52.1中国林蛙.52.1.1中国林蛙的特征.52.1.2林蛙的功能作用.62.1.3林蛙的国内外研究现状.72.2林蛙皮.72.2.1林蛙皮的功能.72.2.2林蛙皮研究现状和应用前景.102.3多糖.112.3.1多糖的概念.112.3.2多糖的结构.122.3.3多糖的功效.122.3.4多糖的分离提纯方法概述.12第三章实验部分.143.1材料与设备.143.1.1原材料.143.1.2主要仪器.143.1.3主要试剂.143.2蛙皮多糖含量的测定.153.2.1苯酚-硫酸法测定蛙皮多糖的含量.153.2.2多糖提取率的计算.153.3林蛙皮多糖提取方法的比较.153.3.1热回流法提取蛙皮多糖.153.3.2酶法提取蛙皮多糖.163.3.3碱法.183.4正交实验法优化蛙皮多糖的提取工艺.1923.5结果与讨论.203.5.1葡萄糖标准曲线的绘制.203.5.2单因素实验结果分析.213.5.3正交试验优化蛙皮多糖提取工艺结果分析.25第四章结论与展望.284.1结论.284.2展望.28致谢.29参考文献.303第一章前言中国林蛙(RanachensinensisDavid)又名蛤什蟆。属两栖纲、无尾目、蛙科、蛙属1，主产东北,属国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物中经济价值很高的两栖动物2，世界自然保护联盟(IUCN)列其为易危物种3。林蛙营养价值较高，俗称“大补品”由于其以昆虫类为食物亦称“农林卫士”和“纯绿色食品”，因此在近几年的市场上显现出巨大的商机。由于其具有极高的药用和保键价值并且含有纯正绿色野味的食用价值逐渐被人们认识和利用开发，导致东北林蛙地区的人们无限制的灭绝式捕杀这一类野生动物，使这一珍稀的野生资源逐年减少，产需失衡，日趋枯竭，成为濒危物种。随着工农业生产和城市建设的不断发展，人们对土地、森林、草场的利用不尽合理，中国林蛙的适生环境遭到破坏，导致生态平衡失调，从而危及中国林蛙的生存和繁衍。建国初期，中国林蛙分布区的森林覆盖率为79.8%，1980年降为65.2%，1987年又降到58%4。中国林蛙分布区内广泛使用化学除草剂、杀虫剂、化学肥料等，以及山区、半山区的工厂、矿山长期排放大量的废水、废气、废渣,使中国林蛙的生存环境变得十分恶劣，蝌蚪难以成活，繁殖受阻，活动空间变小。加上对野生资源的过度捕抓(利用)，目前约有60%70%的适生区域，中国林蛙分布密度剧烈下降，有的地区甚至很难找见。近年来中国林蛙的人工养殖在其主产地东北已初具规模,并且正朝着产业化方向发展,养殖中国林蛙的经济效益十分可观。开展中国林蛙资源状况调查,对保护林蛙资源和促进中国林蛙养殖业的持续健康发展都具有重要意义5。林蛙全身是宝：其中林蛙皮是高级制革业的主要资源；林蛙卵富含卵磷脂和性激素；林蛙肉因其高蛋白6、低脂肪的特性可加工高级保健品；林蛙雌蛙输卵管干燥物即哈士蟆油，是极其珍贵的药材。哈士蟆油是我国医学中的滋补强壮之药，有补虚、增精、退热、解毒、消肿、润肺、健脾胃、益肝肾之功，可治疗失眠眩晕和神经衰弱、脾胃虚弱、咳嗽肺虚、体弱气虚、水肿腹胀、创痛肿毒、疮疾和肝炎、肺结核等疾病7。目前国内外对林蛙的研究主要集中在胶原蛋白这一块，对林蛙多糖的研究较少，其实动物多糖在降血压，增强免疫，抗肿瘤这些方面有很好的疗效，些动物多糖具有排除肠道毒素和降低重金属对人体的毒害、抗辐射、防龋齿等方面的保健作用。另外，壳聚糖含有游离氨基显碱性，在胃里能中和胃酸，形成一层保护膜，可辅助治疗胃酸过多症和预防消化性胃溃疡；透明质酸具有保持皮肤弹性的功能，还能保留大量水分子，对皮肤具有保湿作用8。4本论文的研究内容主要包括两部分：第一部分是酶法，碱法9，热水浸提法10林蛙皮中多糖的方法叙述；第二部分优化比较最佳工艺。5第二章文献综述2.1中国林蛙2.1.1中国林蛙的特征中国林蛙俗称“哈士蟆”或“哈什蟆”、黄蛤蟆或油蛤蟆，医药界又称“田鸡”。在动物学分类上，属于脊索动物门，脊椎动物亚门，两栖纲，无尾目，蛙科，林蛙属，是中国著名的集药。本草纲目记载：哈什蚂，本草纲目中称之“山哈”，别名哈什蚂、雪哈。中国林蛙，形状似蛤蟆，古时，女真人（满族）称之为哈什蚂，意为圣洁。民间传说哈什蚂以人参为食，吃灵芝草而冬眠，是一种能赐福、消灾的吉祥物。现今被命名为中国林蛙。主要产于我国东北的长白山区，是东北地区特有的蛙种中国东北林蛙是国家保护动物。自明代始，即为供品,被立为皇家食谱中“三宝”(哈什蚂、红景天、不老草)。清太祖努尔哈赤用中国林蛙祭祖,由此，中国林蛙成为清王朝宫廷贡品，被列为八珍之首（蚂、参、翅、骨、肚、窝、掌、筋），中华人民共和国建国后，中国林蛙被立为中国“四大山珍”（熊掌、林蛙、飞龙、猴头）。从中国林蛙皮中提取到的保湿因子，添加到化妆品中，可以起到极佳的保湿效果。从中国林蛙卵中提取到的低分子活性物质，可以用其生产美容产品，减缓人体皮肤衰老。蛙头、蛙皮、蛙肝脏等部位均是制造保健、美容食品的极佳原料11。提取到林蛙油后的副产品，如骨骼、内脏、肌肉等也可作为毛皮动物的饲料，又可浸泡后入药。林蛙除了药用、美容、保健、饲料价值外，在中国东三省和广东、台湾及东南亚等地又被人们充分的认可，具有纯天然的绿色的药用和食用价值，因而，具有广泛的消费市场。中国林蛙雌蛙体长约为7190mm，雄蛙较小；头长宽相等或略宽，头较扁平；吻棱较明显，吻端钝圆，略突出于下颌；鼻间距大于眼间距而与上眼睑宽，鼻孔位于吻眼之间；鼓膜显著，且大于眼径的一半，位于内鼻孔内侧的犁骨齿两短斜行，前肢较为短壮，指端较圆，指细长，指长顺序为3、4、2、第1、3指几等长；指基下瘤、关节下瘤及内外掌突均较为显著。后肢长。胫跗关节前可6达到眼或略超过，左右跟部则明显重叠，胫长超过体长的一半，足与胫等长或者略长；趾端较钝圆；趾较细长，第3、5趾达第4趾的第2、3关节下瘤的中部，蹼发达，除第4趾以外，其余的各趾的蹼多少至趾端然而蹼缘缺刻较大，外侧的跖间有蹼而不发达；关节下瘤小而明显，内跖突窄而长，外跖突小而圆。皮肤上微小痣粒较多，口角后端的颌腺非常明显，背侧的褶在颞部不平直而且成曲折状，在鼓膜上方的侧褶略微斜向外侧，随即又折向中线处，再向后延伸达胯部；两侧的褶间有少数分散疣粒，在肩部则有排成“人”形者。腹面皮肤光滑。两眼间深色横纹及鼓膜处三角斑较清晰，背面与体侧有分散黑斑点，通常都在疣粒上；四肢的横斑清晰；腹面的灰色斑点颇多，有的甚至从咽至腹后都存在斑纹。雄蛙前肢较为粗壮，第1指上灰色的婚垫极发达；有一对咽侧下内声囊。蛤士蟆1年的生活周期可分为水中生活和陆地生活两个明显不同的阶段。水中生活阶段是在较深的水域中进入冬眠状态，以渡过寒冷的冬季，一般从9月下旬到翌年4月中旬，历时150180天。此时的蛤士模多群集于水下穴洞之中，不食少，新陈代谢降到极低水平；陆地生活阶段是到春季冰雪溶化，水温变暖时，冬眠的蛤士蟆渐渐开始活动，随着水温和气温的升高陆续上岸。此时的雌雄蛙体生殖腺均已成熟，在温暖的浅水池沼、田水中“抱对”和产卵，排精，在水体外受精，形成受精卵。蛤十蟆完成生殖活动后，即进入陆地山林的草丛或灌丛中，营陆地生活。随着气温的升高，蛤士模逐渐由低地向高地，由阳坡向明坡迁移。此时援食旺盛，蛙体渐肥，幼蛙也正处于迅速生长时期，从9月中旬开始，气温降到15以下时，蛤土蟆开始向山下迁移，陆续到达越冬水域周围，在气温降到10以下时，即陆续进入水中，又从陆地生活转入水中生活。蛤士蟆蝌蚪在水中为鳃呼吸，以植物碎屑、藻类、植物嫩芽、嫩叶等为食，为植物性食性期，约30d左右。变成蛙后即离水登陆，转变成动物性食性，以昆虫，蜘蛛，蜗牛等活饵为食，因有特殊结构和功能的蛙舌，故有很强的放舌捕捉各种小型飞虫的能力。2.1.2林蛙的功能作用林蛙因其肉质细嫩、易于消化吸收，受到各种年龄段人的青睐。特别适合体弱多病及老年人食用，具有极高的食补价值。林蛙经烹调能释放出大量的肌溶蛋白和氨基酸等含氮浸出物，味道香浓。中国林蛙因其味道鲜美、营养丰富，在明清时已成为贡品，被列为“东北新三宝”（不老草、哈什蟆、红景天），“四大山珍”（哈什蟆、熊掌、猴头、飞龙）和宫廷“八珍”（参、骨、肚、翅、蒿、掌、蟆、筋）之列。林蛙在医药和滋补美容方面均具有卓越功效，如：滋阴补肾、平肝养胃、健脑益智、抗衰驻颜、降血脂血压、增强免疫力、嫩肌活肤等；对冻疮、脚气和水火烫伤均有奇效。7林蛙还具有滋阴补肾、润肺养胃、补脑益智、提高人体免疫力的功能。林蛙是一种强身健体的滋补中药，对气血两亏、体虚气弱、神经性头痛、心悸失眠、精力亏损和产后出血等病症有显著疗效，是国内外极为紧缺的名贵药材，在国际市场享有很高声誉，产品供不应求12。哈士蟆“油”为雌性哈士蟆的输卵管和卵巢、脂状物。哈士蟆历来作为皇室进贡珍品，清朝时被列为“上八珍”和“八大山珍”之一。在李时珍的本草纲目记载哈士蟆油味甘咸、性平和。具解虚痨发热利水、消肿、补虚、尤益产妇。在中国药典、中药大词典、中草药手册中国药志等中也记载到哈士蟆油润肺养阴化精添髓、补脑益智、延缓衰老、用于身体衰弱、产后气虚、肺痨咳嗽、内分泌失调等。医学研究现代医学分析鉴定哈士蟆油含丰富的不饱和脂肪酸、雌二醇、孕酮、磷脂、18种氨基酸（含8种人体必需氨基酸）、多种维生素和多种人体必需、半必需的微量元素等成分，适应用于提高人体的机体免疫能力、促进新陈代谢、调节内分泌、补充雌激素、软化心恼血管、补肾益精、润肺养阴、延缓衰老、滋肤、降脂等效果。现代医学称其为“绿色软黄金”而且被定为国家二级保护中药材13。2.1.3林蛙的国内外研究现状目前，国内外针对中国林蛙的研究多见于雌性林蛙输卵管蛤士蟆油的成分和功能等方面的报道，而有关林蛙皮废弃物林蛙皮中多糖报道极少。林蛙皮中富含多糖，胶原蛋白等具有特殊分子结构、功能复杂多样的生物活性物质，具有重要的应用价值及较大的开发潜力。2.2林蛙皮2.2.1林蛙皮的功能“东北林蛙皮”有一千古之谜，在其生命停止后，无论是在水中泡、烈日下晒，还是在阴干的地方存放，它的形体几十年不会变质、不会霉烂。冬季东北林蛙在河水冻成冰时，由于胸腹呼吸困难，因此可用皮肤进行呼吸，夏季在进入森林中，用皮肤从土地中、露水中吸水，其性格被堪称动物中典范。林蛙可以用皮肤呼吸并吸收水分，其机体具有完善的保湿系统，林蛙的某些组织中天然保湿因子含量较高，尤其是保湿因子的典型代表物透明质酸(Hyaluronicacid，HA)的含量与牛眼玻璃体中HA的含量接近，而牛眼玻璃体中HA的含量是至今为止动物性原料中HA含量最高的。HA是目前世界公认的性能优越的保湿因子，其分子中的羧基和其他极性基团可与水形成氢键而结合大量的水，当含量低于01时，HA可结合其质量1000倍的水。这种天然保湿因子可使皮肤含水量增加，表皮角质层柔软，改善皮肤表面的血液循环，增强皮肤弹性，阻止表皮细胞纤维化。，从而起到护肤作用。HA是皮肤固有的生物物质，当皮肤所含HA浓度下降时14，可导致皮肤干燥和皱8纹的产生，而通过口服或涂抹HA，可增加体内HA及其合成前体，从而有效改善皮肤的保水性和弹性。HA可维持眼玻璃体呈胶凝状，明显延长泪膜破裂时间，是治疗干眼病的首选药物，还可应用于眼科手术的粘弹性填充剂。HA在皮肤中可清除阳光中的紫外线照射所产生的活性氧自由基，保护皮肤细胞免受其害，可有效抑制由于自由基侵害而出现的皮肤衰老及色素沉淀的出现，提高皮肤的抗病能力。人们以雄性林蛙皮及摘油后的雌性林蛙皮为原料，采用复合酶解进行天然保湿因子的提取和纯化，最终得到HA纯品。HA目前的市售价格为雄性林蛙及摘油后的雌性林蛙胴体价格的1300倍以上，因此林蛙皮的利用为提高林蛙产品的附加值，实现其高附加值综合利用开辟了一条新途径。2.2.1.1食疗价值哈士蟆是蛙科动物中国林蛙或黑龙江林蛙的肉。前者，分布于中国辽宁、吉林、黑龙江、内蒙古、甘肃、河北、山西、陕西、河南、青海、四川等地；后者，分布于中国黑龙江、吉林、辽宁等地。获得雌蛙后，先取出输卵管，再除去内脏；获得雄蛙，即剖腹去内脏。洗净晒干备用。若鲜用，须除去肉脏和皮。【性能】味甘、咸，性微温。能滋养补虚，益肾气。【用途】用于体虚营养不良或小儿疳积，瘦弱少食；肾气虚衰，阳虚精少。【用法】煮汤，入菜肴等。【附方】雪哈汤：鲜哈士蟆35个，落花生60克。加水煮，以盐、猪脂少许调味服食。落花生与哈士蟆配伍，以增强滋养补虚的作用。用于身体虚弱或疳疾消瘦。哈士蟆油历来作为皇室进贡珍品，清朝时被列为“上八珍”和“八大山珍”之一。在李时珍的本草纲目记载哈士蟆油味甘咸、性平和。具解虚痨发热利水、消肿、补虚、尤益产妇。在中国药典、中药大词典、中草药手册中国药志等中也记载到哈士蟆油润肺养阴化精添髓、补脑益智、延缓衰老、用于身体衰弱、产后气虚、肺痨咳嗽、内分泌失调等。医学研究现代医学分析鉴定哈士蟆油含丰富的不饱和脂肪酸、雌二醇、孕酮、磷脂、18种氨基酸（含8种人体必需氨基酸）、多种维生素和多种人体必需、半必需的微量元素等成分，适应用于提高人体的机体免疫能力、促进新陈代谢、调节内分泌、补充雌激素、软化心恼血管、补肾益精、润肺养阴、延缓衰老、滋肤、降脂等效果。现代医学称其为“绿色软黄金”而且被定为国家二级保护中药材。2.2.1.2林蛙皮的保湿功能林蛙皮中胶原蛋白的含量可达48，而多肽类的含量可达10以上。更为难得的是，在林蛙皮中含有天然的保湿因子、典型的代表是透明质酸（HA）。目前透明质酸（HA）被世界公认为是人体皮肤的最理想保湿物质，可以通过其补充体内保湿9因子的含量，起到锁住全身水分作用，是目前眼科用药、美容保健品及国际上高档化妆品中必需的保湿营养成份。2.2.1.3林蛙皮的治疗痤疮功能研究表明，大孔多肽因子为蛙皮的有效成份且具有广谱杀菌的功效，可有效的杀灭由皮肤表层引起的豆口、痤疮而产生的细菌，在加上其保湿因子的作用，使皮肤表面温度上升、表皮角质层柔软、血液的循环得到改善，进而可以达到治疗痤疮、皮肤湿润祛斑的目的。2.2.1.4林蛙皮的祛斑功能林蛙皮的透明质酸HA在抗氧化试验中表现出了与谷胱甘肽等非酶自由基清除剂相同的作用，所以它具有对理想细胞的保护作用，可以延缓因为自由基的侵害而引起的色素沉着和皮肤衰老，并且可以改善皮肤的新陈代谢，以此加速皮肤中黑色素的分解，达到提高皮肤抗病能力的作用。2.2.1.5林蛙皮的抗菌功能林蛙皮肤中的小分子抗菌活性肽具有较强的抗菌的活性，并且他对革兰氏阳性细菌均具有抑制作用。通过与传统食品防腐剂苯甲酸钠和山梨酸钾活性的比较发现，林蛙皮肤中的多肽粗提物-多肽Fm对所选用的4种细菌种的抑制作用较强。而且经一定手段纯化后，他的抑菌效果会更高这是传统的食品防腐剂所无法匹敌的，为开发出安全无毒副作用的天然食品防腐剂来取代传统的具有一定毒副作用的化学合成防腐剂奠定了基础。另外，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和蜡状芽孢杆菌都是引起某些疾病的致病菌，因此也可以利用抗菌肽于常见的抗生素作用机理不同，不易产生抗菌株这一特征，将其开发成为新一代的抗菌药物。2.2.1.6林蛙皮的去皱功能研究结果表明，林蛙皮中胶原蛋白的含量可达48，而多肽类的含量可达10以上。林蛙皮中的胶原蛋白，经过口服吸收，可以有效的补充人体衰老的肌肤中流失的胶原蛋白，能提高皮肤弹性，并且能减少皱纹生成。此外，林蛙皮中保湿因子-透明质酸HA可以有效提高皮肤中保湿因子的含量，增强皮肤的保水性，并能够减少由紫外线照射而产生的自由基损害皮肤，可提高皮肤的抗病能力。综合以上结果，胶原蛋白可以减轻皮肤的衰老症状，使皮肤逐渐恢复原有弹性。林蛙皮中含有大量的多肽类成分，可以防治自身受感染。它的皮腺内包含各种活性因子，其包括多肽生长因子、保湿因子、血管紧张素因子、林蛙生物抗菌因子、舒缓激肽样多肽、铃蟾肽类因子、吗啡因子、促甲状腺素肽类等14种多肽类因子。研究表明，林蛙皮当中抗菌多肽有广谱抗菌作用，其包括对革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌特别对耐药株有明显的抑制作用，还可杀灭皮肤当中各种有害的细菌，10有助于减少青春痘生成，并且以不损害真核细胞为前提对癌细胞、病毒和真菌有抑杀作用。亦可用来治疗肠炎、痢疾、胃痛等某些炎症类的疾病。在世界范围内林蛙油保健效果已得到普遍的共识，林蛙皮当中的活性成分同林蛙油类似，即可促进细胞的修复，亦可延缓组织细胞的衰老。当代研究证明，林蛙皮的成分组成当中含有不同种类的活性因子，它的作用是由一种或几种生长因子协同作用诱导细胞DNA的分裂和合成。林蛙皮当中含有蛙皮素，含丰富的脯氨酸抗菌肽可以预防创面感染，它的特点是抗菌谱广，并能在几分钟或几小时内杀死病原菌，且对正常细胞是没有害的。林蛙的活性蛙皮在治疗创伤的过程中，即有抗感染又有止痛、止血、透气、保湿和隔绝创面的作用，可以代替传统的敷料，一方面主动参与，促进创面愈合；同时，可以覆盖创面，是一种新型的胶体生物敷料。成纤维细胞作为机体内极为重要的一种细胞，在创伤愈合和组织修复等过程中起着至关重要的作用。随着年龄的增长人体内透明质酸HA的含量逐渐降低，极可能与老化时皮肤弹性的下降有关。林蛙皮当中胶原蛋白的含量可达到48%，多肽类得含量可达到10%以上，透明质酸（HA）的含量极为丰富，这几种成分则是成纤维细胞生长繁殖所必需的基质。人类的皮肤内透明质酸HA伴随着衰老，特别是光导致的老化，透明质酸（HA）的含量会逐渐减少，同时皮肤的保湿能力也有所下降。在机体内透明质酸HA以它特有的理化性质和分子结构成就了很多重要的生理功能。它具有特殊的持水作用，是当前发现的在自然界中保湿性最佳的一种物质，故被称为理想天然保湿因子（NMF)。人类皮肤的成熟和老化过程亦随着透明质酸（HA）的新陈代谢和含量多少而变化，适当的补充透明质酸（HA）可以改善皮肤的营养代谢，从而使皮肤去皱、光滑、柔嫩、提高弹性、预防皮肤衰老。通过研究可知，林蛙皮的提取液能显著提高成纤维细胞增殖，其中透明质酸HA成分极可能起重要作用，从而进一步证明林蛙皮可以促进伤口愈合、恢复衰老皮肤的弹性以及治疗烧伤等过程作用机制，成为林蛙皮应用于临床的理论根据。2.2.2林蛙皮研究现状和应用前景中国林蛙皮成份组成中含有活性因子它是蛋白质和肽类，其作用是一种或几种生长因子的协同作用来诱导细胞DNA的合成和分裂，其结构与人体生物皮类同。目前，国内学者对此已有所熟悉，如：血小板来源的生长因子、血管内皮因子、酸性或碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、转化生长因子、生物抗菌因子等，某些生长因子也有趋化作用。血管内皮生长因子，是迄今为止发现的作用最强的血管形成因子。可防止创面感染，其特点是抗菌谱广，能在几分钟或几小时内杀死病原菌，而且对正常细胞是无害的。中国林蛙活性蛙皮在治疗创伤中，即有隔绝创面又有止血、止痛、保湿、透气、抗感染的作用，是不可多得的生物敷料。可代替传统敷料，它一方面可以覆盖创面，同时，主动参与和促进创面愈合，是一11种新型胶体生物敷料。同时林蛙皮中含有丰富的透明质酸，HA是一种高分子量的直链多糖，由N-乙酰氨基葡糖和葡糖醛酸二糖单位重复交替连接形成。HA广泛的分布于动物和人体的结缔组织中，但不同组织来源的HA化学结构完全相同，只是在含量多少和相对分子量大小上存在差异，没有种属特异性。经过多年的研究，人们对HA的结构、理化性质及生理功能已有了明确的认识。它在水溶液中的无规则卷曲状态和它的流体动力学特点赋予其重要的物理特性，即高度粘弹性、可塑性、渗透性和良好的生物相容性，作为一种可吸收、可降解的生物材料，其应用研究领域不断扩大，表现出良好的市场前景。由于HA具有保湿功能，广泛用于化妆品和口服美容保健食品中；作为粘弹性保护剂，用于眼科手术和关节疾病的治疗；作为媒介在滴眼液中广泛应用；交联的HA在粘连的预防和软组织修复等应用中获得成功；HA与其他药物反应形成的加合物对药物发挥控释作用，可达到定向和定时释放的目的。林蛙皮表面湿润、裸露，为抵御环境有害因子侵袭，在自然选择的过程中，经长期进化，其皮肤分泌液中含有大量具有防御功能的抗菌活性物质。此种物质能抑制部分菌种的生长，可以将其开发为低毒、高效药用资源或食物保鲜剂。目前，国内针对中国林蛙的研究多见于雌性中国林蛙输卵管蛤士蟆油的成分和功能等方面的报道，而对中国林蛙皮肤活性物质的研究少有报导。蛙类皮肤中含有丰富的具有特殊分子结构、功能复杂多样的生物活性物质，具有重要的应用价值及较大的开发利用潜力。国外对蛙类皮肤中的活性多肽的研究有40多年的历史。从70年代开始，就已大规模地从两栖类动物皮肤及其分泌物中寻找具有药用价值的生物活性物质，已涉及到600多种蛙类，从中提取出100多种活性肽，其中对部分蛙皮多肽抗生素的结构、功能与性质等方面,已做了深入研究。这些活性肽的结构功能各不相同，其中抗菌肽具有分子量小、水溶性好、抗原性低、稳定性高等特点，不但能够抗细菌，而且能够抗真菌、抗原虫、抗肿瘤、抗病毒，对哺乳动物正常细胞却只有很低的毒性。可在食品工业中作为天然防腐剂加以应用。2.3多糖2.3.1多糖的概念均一性多糖：由一种单糖分子缩合而成的多糖，叫做均一性多糖。自然界中最丰富的均一性多糖是淀粉和糖原、纤维素。它们都是由葡萄糖组成。淀粉和糖原分别是植物和动物中葡萄糖的贮存形式，纤维素是植物细胞主要的结构组分。动物多糖是从动物体内分离提取出的，具有多种生物活性的一类多糖，主要有海参多糖(seacucumberpolysaccharides)、壳聚糖(chitosan)、透明质酸(hyaluronicacid,HA)等。122.3.2多糖的结构多糖（polysaccharide）是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个以上的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物，可用通式（C6H10O5）n表示。由相同的单糖组成的多糖称为多糖，如淀粉、纤维素和糖原；以没的单糖组成的多糖称为杂多糖，如阿拉伯胶是由戊糖和半乳糖等组成。多糖不是一种纯粹的化学物质，而是聚合程度不同的物质的混合物。多糖类一般不溶于水，无甜味，不能形成结晶，无还原性和变旋现象。多糖也是糖苷，所以可以水解，在水解过程中，往往产生一系列的中间产物，最终完全水解得到单糖。2.3.3多糖的功效2.3.2.1降血脂如壳聚糖可降低血清和肝脏组织中的胆固醇含量和脂肪水平，在降血脂、减肥、预防高血压等方面发挥着重要的保健作用。2.3.2.2抗病毒及抗癌15海参多糖可对抗多种动物肿瘤的生长，并能提高机体的细胞免疫力，改善和增强因肿瘤或使用抗癌药物引起的机体免疫功能低下状况16。壳聚糖也有增强免疫力、防肿瘤作用，能促进动物对大肠杆菌和病毒感染产生非专一性的宿主抵抗性，增加抗体生成，并可以诱导白介素、增殖因子和干扰素的产生，发挥免疫调节剂的功能17。2.3.2.3其它用途些动物多糖具有排除肠道毒素和降低重金属对人体的毒害、抗辐射18、防龋齿等方面的保健作用。另外，壳聚糖含有游离氨基显碱性，在胃里能中和胃酸，形成一层保护膜，可辅助治疗胃酸过多症和预防消化性胃溃疡；透明质酸具有保持皮肤弹性的功能，还能保留大量水分子，对皮肤具有保湿作用。2.3.4多糖的分离提纯方法概述2.3.3.1热水提取法19该法所得多糖提液可直接或离心除去不溶物；或者利用多糖不溶于高浓度乙醇的性质，用高浓度乙醇沉淀提纯多糖20；但由于不同性质或不同相对分子质量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同，它也可以用于样品中不同多糖组分的分级分离；还可按多糖不同性质在粗分阶段利用混合溶剂提取法对植物中不同的多糖进行分离；其中，以乙醇沉淀最为普遍。2.3.3.2碱法提取多糖有些多糖适合用稀酸或碱溶液提取，才能得到更高的提取率21。但酸碱提取法有其特殊性，因多糖类的不同而异。只在一些特定的植物多糖提取中占有优势，13而且即使有优势，在操作上还应严格控制酸碱度。因为某些多糖在酸性或者碱性较强时，可能引起多糖中糖苷键的断裂。另外，稀酸、稀碱提取液应迅速中和或迅速透析，浓缩与醇析而获得多糖沉淀。2.3.3.3酶提取法22酶技术是近年来广泛应用到有效成份提取中的一项生物技术，在多糖的提取过程中，使用酶可降低提取条件，在比较温和的条件中分解植物组织，加速多糖的释放或提取。此外，使用酶还可分解提取液中淀粉、果胶、蛋白质等的产物，常用的酶有蛋白酶，纤维素酶，果胶酶等.2.3.3.4苯酚-硫酸法测多糖23可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖24。苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min以上25.14第三章实验部分3.1材料与设备3.1.1原材料林蛙皮粉：林蛙晒干，剥下林蛙皮，用粉碎机粉碎。3.1.2主要仪器（1）TDZ5-WS型离心机，江苏金坛荣华仪器制造有限公司；（2）GYB306D型高压均质机，上海东华高压均质机厂；（3）HV-10电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；（4）UV1102型紫外分光光度仪，上海天美科学仪器公司；（5）DK-98-型电子恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；（6）FD-1C型冷冻干燥机，北京德天佑科技有限公司；（7）RE-52C旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；（8）KQ-250DB型超声波清洗器，昆山市超声波仪器有限公司；3.1.3主要试剂（1）浓盐酸，分析纯，北京试剂厂；（2）浓硫酸，分析纯，北京试剂厂；（3）95%乙醇，分析纯，北京试剂厂；（4）氢氧化钠，分析纯，北京试剂厂；（5）氯胺T，分析纯，北京试剂厂；（6）胃蛋白酶，分析纯，北京试剂厂；（7）醋酸钠，分析纯，北京试剂厂；（8）活性炭，北京试剂厂；（9）硝酸，分析纯，沈阳市试剂五厂；（10）对苯二酚，分析纯，沈阳市试剂五厂；（11）亚硫酸钠，分析纯，沈阳市试剂五厂；（12）磷酸二氢钾，分析纯，北京试剂厂；（13）高氯酸，分析纯，北京试剂厂；（14）二甲氨基苯甲醛，分析纯，沈阳市试剂五厂；（15）异丙醇，分析纯，北京试剂厂；153.2蛙皮多糖含量的测定3.2.1苯酚-硫酸法测定蛙皮多糖的含量采用苯酚-硫酸法测定蛙皮多糖的含量，具体操作步骤如下：精确称取干燥的葡萄糖0.1g，准确定溶至1000mL容量瓶。精密吸取葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL。再加入蒸馏水至1mL,迅速加入苯酚1mL,硫酸5mL后摇匀,静止5min,置沸水浴中加热15min，取出迅速冷却至室温。用分光光度计在490nm波长下测定吸光度值。并且以吸光度值y为纵坐标、溶液中葡萄糖浓度x为横坐标，绘制标准曲线。表3-1苯酚-硫酸法中各试剂添加量管号1234567葡标液(mL)00.10.20.40.60.81.0蒸馏水(mL)21.91.81.61.41.21苯酚液(mL)1111111浓硫酸(mL)55555553.2.2多糖提取率的计算10m%MCV）林蛙皮中多糖含量（）粗提物的的含糖量（式中：C为由吸光度值在标准曲线查得的相应的多糖含量（g/mL）；V为样品稀释后的体积（ml）；m为多糖粗提物的质量(g);M为实验前所用林蛙皮的质量(g);3.3林蛙皮多糖提取方法的比较3.3.1热回流法提取蛙皮多糖多糖溶于热水，不溶于60%以上乙醇，也不溶于氯仿正丁醇。所以用热水提取，乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质。因为热水也可以将蛋白类物质提取出来，所以用氯仿正丁醇萃取除去提取液中的蛋白。将林蛙皮用粉碎机粉碎，过40目筛，料液比1:8加入蒸馏水，在50水浴加热12h，用离心机离心取上清液。加入等量体积95%乙醇，静置24h，用离心机离心取16沉淀物，用95%乙醇洗涤脱水，在50鼓风干燥箱内干燥至恒重。图3-1热水浸提法工艺流程3.3.1.1提取温度对多糖提取率的影响按照上述的提取方法，以液料比18、林蛙皮20g于35、40、45、50、55提取多糖12h，分别离心，取上清液。，用95%醇沉，干燥，得到干粉，准确称量干粉的质量，计算提取率和多糖含量，确定合适的提取温度。3.3.1.2液料比对多糖提取率的影响按照上述的提取方法，分别按液料比14、16、18、110、112和林蛙皮20g于锥形瓶中，并于50提取12。离心后取上清液，用95%醇沉，干燥，得到干粉，准确称量干粉的质量，计算提取率和多糖含量，确定合适的料液比。3.3.1.3提取时间对多糖提取率的影响按照上述的提取方法，以液料比15、称林蛙皮20g于50分别提取多糖9、10、11、12、13h，离心后取上清液，用95%醇沉，干燥，得到干粉，准确称量干粉的质量，计算提取率和多糖含量，确定合适的提取时间。3.3.2酶法提取蛙皮多糖酶法是通过酶反应将原料组织分解，加速有效成分的释放和提取，选择适宜条件17将影响提取的杂质分解去除，促进促进某些极性低脂溶性成分转化成糖苷类，易溶于水的成分，但因为多糖不溶于65%以上浓度的乙醇，所以最后用乙醇提取出多糖粗提物。将林蛙皮用粉碎机粉碎，过40目筛，料液比1:8加入蒸馏水，匀浆，用冰醋酸调节pH至2-3，加2%胃蛋白酶，在50水浴加热6h酶解，在用5%KOH调节pH至8-9，加2%的胰蛋白酶，在50水浴加热6h酶解，用离心机离心取上清液。加入等量体积95%乙醇，静置24h，用离心机离心取沉淀物，用95%乙醇洗涤脱水，在50鼓风干燥箱内干燥至恒重。图3-2酶法提取蛙皮多糖的工艺流程3.3.2.1提取温度对多糖提取率的影响18按照上述的提取方法，以液料比15、林蛙皮20g于35、40、45、50、55提取多糖6h，分别离心，取上清液。用95%醇沉，干燥，得到干粉，准确称量干粉的质量，计算提取率和多糖含量，确定合适的提取温度。3.3.2.2酶比对多糖提取率的影响按照上述的提取方法，分别按液料比15和林蛙皮20g于锥形瓶中，分别用胃蛋白酶和胰蛋白酶之比为2:1、1:1、1:2、2:2于50提取6h。离心后取上清液，用95%醇沉，干燥，得到干粉，准确称量干粉的质量，计算提取率和多糖含量，确定合适的酶比。3.3.2.3提取时间对多糖提取率的影响按照上述的提取方法，以液料比15、称林蛙皮20g于50分别用胃蛋白酶和胰蛋白酶提取多糖4、5、6、7、8h，离心后取上清液，用95%醇沉，干燥，得到干粉，准确称量干粉的质量，计算提取率和多糖含量，确定合适的提取时间。3.3.3碱法碱能破坏细胞膜，使多糖析出更迅速，选择适宜条件将影响提取的杂质分解去除，促进促进某些极性低脂溶性成分转化成糖苷类，易溶于水的成分，但因为多糖不溶于65%以上浓度的乙醇，所以最后用乙醇提取出多糖粗提物。不过碱能破坏多糖的空间结构和多糖的活性。19图3-3碱法提取蛙皮多糖的工艺流程粉碎林蛙皮，过40目筛，然后加5%KOH5倍，在50水浴锅上搅拌提取2h,用冰醋酸调节pH至7.0，离心取沉淀，沉淀用95乙醇洗涤脱水，沉淀用鼓风干燥机干燥至恒重。3.3.3.1浸提液浓度对多糖提取率的影响按照上述的提取方法，以液料比15、林蛙皮20g于锥形瓶中分别加3%、4%、5%、6%、7%等量于林蛙皮的KOH浸提液50提取多糖2h，分别离心，取上清液。，用95%醇沉，干燥，得到干粉，准确称量干粉的质量，计算提取率和多糖含量，确定合适的提取温度。3.3.3.2液料比对多糖提取率的影响按照上述的提取方法，分别按液料比