【毕业学位论文】（Word原稿）牛分枝杆菌MPB64蛋白的原核表达及单克隆抗体制备硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 牛分枝杆菌 白的原核表达及 单克隆抗体制备 of 国 农 业 科 学 院 硕 士 学 位 论 文 of I 摘 要 分枝杆菌是一种革兰氏阳性 抗酸杆 菌，许多 为 环境中常在菌。大多数菌 株生长缓慢，有些能够引起人和动物 结核及结核样疾病，这一类分枝杆菌组成了结核分枝杆菌复合群，该菌 有许多共同的抗原蛋白。 白 是结核分枝杆菌复合群成员都合成分泌的一种早期滤液蛋白， 是该复合群 特异性 的分泌蛋白，在 菌株鉴定和疫苗研究中都有重要应用。 本实验为了制备 克 隆 抗 体 ， 根 据 已发布的7 菌株的 因序列 设计引物 ， 以牛分枝杆菌 菌株 基因组 模板 ， 增出 具有完整开放阅读框架（ 因 ， 连 接 到 ) 中 构建原核表达载体 ， 诱 导 表 达 重 组 蛋白（ 同时， 将 因经 酶切 后 连接到真核表达质粒 )中， 构建真核表达质粒 经瞬时转染鉴定该真核质粒 能够 在哺乳动物细胞 中表达。以 构建的真核表达质粒免疫 c 小鼠 ， 采用 聚乙二醇 导 脾细胞和 骨髓瘤 细胞融合， 用纯化的 筛选针对 白的单克隆抗体， 阳性的细胞株用有限稀释法进行 3 4 次亚克隆，最终获得 3 株能稳定分泌单克隆抗体 的杂交瘤细胞株 ， 命名为 单克隆抗体亚型鉴定 结果 表明 ： 型 ，轻链 为 链； 5 型 ，轻链 为 链。 验 证实 ， 3 株单抗都能与纯化的及 纯化的牛分枝杆菌培养滤液蛋白（ 反应， 与本实验室 表达并纯化 的 反 应。 析 表明， 3 株 单抗都不能 与经性 电泳 后转移到 上的 生反应， 认为 制备的单克隆抗体识别的 可能 是 白 的 构象 表位 。 本实验 利用 大肠杆菌 原核表达系统成功表达 和 纯化了重组蛋白 以此蛋白为筛选抗原，采用基因免疫的方法制备了 3 株能够分泌针对 白的单克隆抗体的杂交瘤细胞，这为进一步研究 白的结构和功能，以及建立 白的 检测 方法奠定了基础。 关键词： 牛分枝杆菌 白 原核表达 疫 克隆抗体 is a it is in in or of is an is by it is in of of To of CR NA , ) to in as be B of in +) to of in by c 35to 2E5 to gM 5to PD in So of In . s be to to in 录 第一章 绪论 . 1 述 . 1 枝杆菌分类及菌株全基因组测序 . 1 枝杆菌的检测方法 . 2 枝杆菌分泌蛋白研究进展 . 4 结核病概述 . 8 究目的与意义： . 10 第二章 牛 分 枝 杆 菌 特 异 性 抗 原 白 原 核 表 达 . 11 料和试剂 . 11 种、载体及宿主 . 11 要试剂 . 11 要溶液和培养基的配制 . 11 要仪器 . 13 验方法 . 14 分枝杆菌的培养及其基因组 提 取 . 14 的基因的扩增 . 14 肠杆菌感受态细胞的制备及转化 . 15 物连接 重组质粒的鉴定 . 15 达载体的构建与鉴定 . 16 组质粒 大肠杆菌中的诱导表达 . 16 合蛋白的小量纯化 . 16 化蛋白的浓度测定 . 17 化蛋白的 析 . 17 果 . 18 增目的基因 . 18 组质粒 鉴定 . 18 组质粒 鉴定 . 18 的片段的序列分析 . 18 导表达融合蛋白及其纯化 . 19 化蛋白的 析 . 19 化蛋白的浓度测定 . 20 论 . 20 第三章 白 单 克 隆 抗 体 的 制 备 . 22 胞、实验动物及材料 . 22 胞、实验动物 . 22 剂配制 . 22 验方法 . 22 原的制备 . 22 核载体瞬时表达 . 24 物免疫 . 25 胞融合 . 25 性杂交瘤细胞的筛选 . 26 性杂交瘤细胞的亚克隆 . 26 克隆抗体的大量制备 . 26 测 . 26 析 . 27 克隆抗体的生物学鉴定 . 27 果 . 28 瞬时转染 . 28 物免疫抗体水平检测 . 28 胞融合 . 29 克隆抗体亚类鉴定 . 29 定 . 29 水与重组蛋白 应 . 29 克隆抗体识别抗原表位的鉴定 . 30 定 . 30 胞稳定性 . 31 论 . 31 第四章 结论 . 33 参考文献 . 34 附录： 基因扩增产物与标准序列比对 . 38 致 谢 . 40 作者简介 . 41 V 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 克隆抗体 聚合酶链式反应 丙基 道尔顿 酶联免疫吸附试验 B 液体培养基 乙二醇 酸盐缓冲溶液 苯二胺 ,3氨基联苯胺 黄嘌呤、氨基喋呤与胸苷 黄嘌呤与胸苷 甲基亚砜 二烷基硫酸钠聚丙稀酰胺 凝胶电泳 根过氧化酶 牛血清 氧核糖核酸 糖核酸 苄青霉素 纯蛋白衍生物 介苗 核分枝杆菌复合群 a 非结核分枝杆菌 中 国 农 业 科 学 院 硕 士 学 位 论 文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 述 枝杆菌分类及菌株全基因组测序 分 枝 杆菌属成员均为好氧，平直或弯曲细长，革兰氏阳性杆菌。在一定 情况下可产生菌丝，但这些菌丝在搅动后成为杆状或球行。本属菌富含类脂质，一般不宜着色，若加温或延长染色时间使之着色后，能抵抗盐酸和酒精的脱色作用，所以称其为抗酸性杆菌（ 伯杰细菌学鉴定手册，1994）。 本 属细菌 无鞭毛和芽孢，菌体内含有大量类脂质成分，一般对营养要求比较特殊，有的菌株生长较快， 3d 内长成菌落；有的生长缓慢 ， 2 6周才可形成可见菌落；而且 有的不能在试管内生长。其中有些菌株是有致病性的，而有些是非致病性的。对动物致病的 菌 种， 主要包括 结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、禽分枝杆菌和副结核分枝杆菌等。本菌属的细菌基因组 +2% 70%。 自从 1882年 枝杆菌新菌种的发现、命名、分类及其演变都有很大的发展变化。据统计，已报道的分枝杆菌有 100多种。在微生物分类学上， 分枝杆菌归属于原核生物界、原壁菌门、放线菌纲、放线菌目、分 枝杆菌科、分枝杆菌属。为鉴定方便起见，根据伯杰细菌学鉴定手册 (1994)，将分枝杆菌属的菌种基本上划分为 2大类：缓慢生长分枝杆菌与快速生长分枝杆菌 。 结核分枝杆菌复合群 (人们对能够引起人和动物结核疾病的一类分枝杆菌的总称，其 成员 属于缓慢生长 分枝杆菌 类， 如 结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌统称为结核分枝杆菌复合群，其 100相关性，分类地 位相近。该群中的成员都能够引起人及特定动物的结核病（刘思国，2005）。 结核分枝杆菌主要引起人类结核病，参考菌株为 牛分枝杆菌主要引起牛结核病，但也引起人类结核病。参考菌株为 田鼠分枝杆菌引起鼠类结核病； 非洲分枝杆菌引起人类结核病。 虽然分枝杆菌 中许多 成员 最初只是与动物疾病相关，或者只是存在 于 环境中 ，但是，现在分枝杆菌属中 的成员 有超过 50种能引起人类的疾病 (004)。在这些分枝杆菌中，结核分枝杆菌因为能引起人类的疾病而被人们所熟知，并且它也很少 存在 于 自然环境 中。非结核分枝杆菌（ 指结核分枝杆菌复合群成员和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌。原称为非典型分枝杆菌 (其特性有别于结核分枝杆菌，如对酸、碱比较敏感 ， 对常用的抗结核菌药物较耐受 ， 生长温度不如结核分枝杆菌严格 ， 多存在于环境中 ，为条件致病菌，可 是因为他们的 抗原与结核分枝杆菌有交叉 ，并且能 引起 人和动物 结核样病变 ，从而干扰结核病诊断准确性 而受到 人们的 关注 。 1999年上海第一肺科医院报道， 15年间 5592 例中 国 农 业 科 学 院 硕 士 学 位 论 文 第一章 绪论 2 痰抗酸杆菌阳性患者中经鉴定为非结核分枝杆菌者 173例 ，其 中有咳嗽症状者占 78%，咳血者 58%，发热者 26%，有空洞者 40%， 表明 非结核分枝杆菌 有一定致病性。非结核分枝杆菌从结核样病人分离的阳性率，我国为 3% 15%。禽分枝杆菌 复合群（ 是能从人类疾病中分离到的最常见的 非结核分枝杆菌 ，而且他们也经常能从环境中分离到， 像 水、土壤、动物体内（ et 2005)。 目前主要研究的非结核分枝杆菌包括：偶发分枝杆菌，堪萨斯分枝杆菌，鸟 垢分枝杆菌，禽分 枝杆菌 复合 群（ 成员 等。 据菌落色素与生长速度将非结核分枝杆菌分为 4 组： 第 组：光产色菌 (本组细菌在暗处为奶油色，曝光 1h 后再培养即成橘黄色。生长缓慢，菌落光滑。对人致病的有堪萨斯分枝杆菌 (引起人类肺结核样病变，常有空洞形成 ; 海分枝杆菌 (在水中可通过皮肤擦伤处侵入，引起皮肤丘疹、结节与溃疡，病理检查见有抗酸菌，易被误认为麻风分枝杆菌。 第 组：暗产色菌 (这类细菌在暗处培养时菌落呈 橘红色。在 37 生长缓慢，菌落光滑。对人致病的有瘰疠分枝杆菌 (引起儿童淋巴结炎。 第 组：不产色菌 (通常不产生色素。 40 42 下生长慢。菌落光滑。鸟 引起结核样病变，多见于肺与肾。 第 组：迅速生长菌 (在 25 45 生长。生长快，培养 5 7d 即可见到菌落，菌落粗糙，有的并能产色。对人致病的有偶发分枝杆菌 (龟分枝杆菌 (溃疡分枝杆菌 (引起皮肤病。耻垢分枝杆菌 (致病，但经常在外阴部皮脂中存在，检查粪、尿中结核分枝杆菌时应予注意。 分枝杆菌部分菌株全基因组测序工作的完成为分枝杆菌致病机理及菌株分型鉴定和疾病诊断方法的研究奠定了基础 。 至 2007年， 已完成全基因组测序的分枝杆菌菌株有 13株，完成情况如下表 1据 引 自 正在测序的有 6株，拟定测序的有 5株。分枝杆菌的基因组都很大，编码合成的蛋白也很多。而且有的菌株还包含有能独立复制的质粒。所以通 过基因序列的比对，发现不同菌株 有 各自特异 性 的蛋白， 这 为今后菌株鉴定和疫苗的研制提供了重要依据。 枝杆菌的检测方法 鉴定致病的分枝杆菌是结核分枝杆菌复合群成员还是非结核分枝杆菌，在疾病治疗，用药方面都有重要意义，近几年间分枝杆菌的鉴定方法也在不断改进。 （一）涂片法：涂片法一般为检查结核分枝杆菌的首选方法，具有简便、快速、价廉、特异性高的优点，尽管阳性率在 25% 35%，无法区分死菌、活菌，但仍具有实用性，对结核病早期诊断起到重要作用。涂片法在操作时要求痰标本涂抹面积为 薄均 匀，采用色法（抗酸染色），要求每个涂片必须至少观察 100 个油镜视野。痰涂片抗酸染色阳性，要求痰液中结核杆菌量必须大于 1 103 个 /阳性率与病人排菌量明显相关，并且中 国 农 业 科 学 院 硕 士 学 位 论 文 第一章 绪论 3 阳性率受送检次数、涂片染色质量、检验者技术等影响，目前在国内检出率不高。为了提高阳性率，现在多采用厚涂片法，比直接涂片法检出率高 14% 17%。还有报道采用金胺 “ O” 光染色法）检测，检出率为 26% 陈东科等 ， 1996，刘丽华等， 2000） ， 但特异性不如抗酸法。集菌涂片法是直接涂片法 的改进，通过离心、漂浮等方法，富集标本中的抗酸杆菌，提高阳性率。阳性率比直接涂片法提高约 10%，但由于此方法操作复杂繁琐，不易标准化，易受污染，临床常规实验室较少应用。 表 1分 分枝杆菌 菌株全基因组测序 菌株名 大小 (测序机构 完成日期 04 006/11/29 001/12/27 7 001/01/23 CG 173007/01/08 ) 006/06/12 001/10/02 007/02/01 N 7% 001/10/02 006/11/29 37001/09/07 006/12/04 006/12/08 ) 006/12/22 (1)另含一质粒： 小 215075 (2)另含两个质粒： 小 302089 小 216763 引自 2007。 5月） （二）培养法：结核分枝杆菌培养在结核病诊断方面具有决定性的意义，是 诊断结核病金标准 。目前随着技术的进步， 培养 分枝杆菌的 培养基也有了很大的发展，以前结核分枝杆菌的培养使用的固体培养基主要是改良罗氏培养基，这种培养基配制起来烦琐，而且要求也较苛刻。现在中 国 农 业 科 学 院 硕 士 学 位 论 文 第一章 绪论 4 使用的主要是 列的专用培养基，这种培养基已商品化，分枝杆菌在该培养基上生长速度较罗氏培养基要快，而且配置简单，而且根据实验要求有固体和液体两种可供选择。 （三）结核杆菌的快速鉴定法：目前已开发并建立了一 系 列基于细菌培养和细菌生长过程中的生化特性的快速鉴定方法，如， 统，该法就是采用放射性同位素技术对细菌生长进行自动检测， 其原理是 根据分枝杆菌在代谢 过程中分解脂肪酸产生 一特性设计的。在含有培养基中，加入标记 14C 的棕榈酸，标本接种后，如有分枝杆菌长，则产生有放射性 14 动检测的 14量，并用生长指数（ 示，由于该法使用放射性底物而使它的应用受到了限制 。 非结核分枝杆菌的阳性检出时间小于 7d，结核分枝杆菌为 9 14d。分枝杆菌生长指示管（ 是一种非放射性的培养方法，根据在分枝杆菌培养基中加入荧光指示剂，当分枝杆菌生长时，通过特定仪器就能检测出反应管中有荧光产生 。利用该法进行乙胺丁醇及链霉素的药敏实验，其平均检出时间分别为 常规方法要 16d。 统，是德国 司生产的一种液体培养基系统，该系统对结核分枝杆菌复合群初代分离率高于 统和改良罗氏培养基，但对非结核分枝杆菌的分离率比后者低。 疫学方法 现在 已 开发研制出一种用来检测结核分枝杆菌复合群菌株的免疫胶体金层析法（ 2002），该法 是通过 检测 株在生长过程中都会分 泌一种共有的 白，来确定培养的菌株是否属于 而区分 员与 员感染。 子生物学方法 现在建立的分枝杆菌菌株鉴定 的 分子生物学方法，主要集中在 术 及核酸杂交技术 的应用 。 出结核杆菌阳性率一般在 80% 以上，国外报道（ et 1997） 的 术比常规培养阳性率平均提高 ，表明 术优于传统的细菌学法。根据基因组学的研究，针对不同分枝杆菌的基因差异设计不同的引物与探针，在鉴定不同菌种方面 有着很高的特异性和敏感性，现在建立的方法有 法（ 多重巢式疫色层分析法 方法 ） （ ,2006）等。目前，决定 法应用的主要因素就是寻找各分 枝杆菌菌种间相对保守且又特异性的序列，并针对该序列设计并优化 引物和 件从而获得更好的敏感性和特异性。 此外， 序技术，染色体基因组 制片段长度多态性 )分析技术等等也都应用到了结核分枝杆菌的鉴定和菌种的分型中。 枝杆菌分泌蛋白研究进展 目前 ， 研究较多的分枝杆菌分泌蛋白主要集中在结核分枝杆菌复合群成员，主要有 括 ） , 合物 , ，其中大多数蛋白都是结核分枝杆菌特有的分泌蛋白，也有一些是复合群中成员都分泌的。也有的蛋白虽然在各分枝杆菌中都有相似蛋白分泌，但不同菌株间蛋白的同源性和引起的免疫反映并不相同（ et 2004）。 中 国 农 业 科 学 院 硕 士 学 位 论 文 第一章 绪论 5 白家族： 多年来 ， 人们在选择结核病（ 新型疫苗的后选分子过程中，发现了许多具有免疫原性的重要抗原，其中一种就是抗原 6 随着结核分枝杆菌全基因组测序的完成和后基因组学研究的发展，在 基因组中又发现了结构与 分相近的一组基因，将他们称为 因家族。这些基因与 10% 35%的同源性（ T et 族含有 14 23 个较小的开放阅读框，编码的蛋白也相对较小，约 10右，属于低分子量蛋白；它们与 蛋白水平上的同源性小于 20%（ LV et 因位于 ，该区是 株与 株的基因组相比较的一段缺失序列，含有 9 个 中包含有 白 家族的两个成员 及 族成员等（ P et 码基因 于 与其处于同一操纵子中，一 起进行协同转录。 大小相当，有 100个氨基酸左右，可形成 1： 1 的复合物而发挥彼此功能。 族中的 22 对基因成对位于 11个位点，且这些基因在基因组中以操纵子的方式组织，转录模式可能与 样一起进行协同转录（ S